流感病毒的分离培养专家讲座.pptx

一、流感病毒流感病毒MDCK细胞分离方法细胞分离方法（一）生物安全要求H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒MDCK细胞分离试验室生物安全级别：BSL-3。试验操作人员需进行BSL-3防护，详细详见“生物安全个人防护SOP”。H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒MDCK细胞分离操作必须在BSL-3级试验室生物安全柜中进行。流感病毒的分离培养专家讲座第1页其余流感病毒MDCK细胞分离试验室生物安全级别：BSL-2。试验操作人员需进行BSL-2防护，详细详见“生物安全个人防护SOP”。其余流感病毒MDCK细胞分离操作必须在BSL-2级试验室生物安全柜中进行。流感病毒的分离培养专家讲座第2页（二）材料1、7590成片MDCK细胞，选取适当大小细胞培养瓶和细胞培养板来用做病毒分离2、胰酶（牛胰腺起源型）3、HEPES缓冲液，1M母液 4、D-MEM培养基，Hanks液5、青、链霉素母液（10000U/mL 青霉素G；10000g/mL硫酸链霉素 流感病毒的分离培养专家讲座第3页6、牛血清白蛋白组分，7.5%溶液7、临床样品0.5mL8、1mL无菌移液管9、10mL无菌移液管10、15mL无菌离心管流感病毒的分离培养专家讲座第4页（三）试验步骤1、准备病毒生长液（1）细胞维持液准备500mL D-MEM液中加入青、链霉素母液 5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100g/mL链霉素）牛血清白蛋白组分 12.5mL（终浓度：0.2%）HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度：25mM）流感病毒的分离培养专家讲座第5页（2）病毒生长液每500mL细胞维持液中加入0.5mLTPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶终浓度为2g/mL。2流感病毒MDCK细胞分离步骤：（1）7590成片细胞准备，以选取T25细胞瓶为例。用40物镜观察细胞生长状态。轻轻倒出细胞生长液，用10mL无菌移液管吸收6mL Hanks液分别清洗细胞3遍。流感病毒的分离培养专家讲座第6页（2）细胞培养瓶接种用无菌移液管将清洗细胞Hanks液从细胞培养瓶中移出。用无菌移液管吸收适量临床标本置于细胞培养瓶中，温和摇动数次。然后放于37，5%CO2培养箱中吸附12h。吸出接种物，用10mL无菌移液管吸收6mL Hanks液分别清洗细胞2遍。然后加入6mL病毒生长液于细胞培养瓶中。放置于3335培养箱培养。每日观察细胞病变情况。（细胞病变特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）。流感病毒的分离培养专家讲座第7页（3）细胞培养物收获当75%100%细胞出现病变时进行收获，收获之前能够将细胞放于-70冰箱，冻融12次，以提升收获标本病毒滴度。即使无细胞病变也应该于接种后第7天收获。收获病毒液时，先温和摇动细胞瓶数次，然后用10mL无菌移液管吸收病毒液置于15mL无菌离心管中，混匀病毒。收获病毒液能够马上进行后续试验，或冻于-80冰箱待以后试验使用。流感病毒的分离培养专家讲座第8页二、流感病毒分离之鸡胚培养法流感病毒分离之鸡胚培养法（一）、检视标识鸡胚（一）、检视标识鸡胚（1）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 血管：活胚血管清楚；死胚含糊，成淤血带或血管：活胚血管清楚；死胚含糊，成淤血带或淤血块淤血块 胎动：活胚有显著自然运动，死胚无胎动胎动：活胚有显著自然运动，死胚无胎动 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管绒毛尿囊膜与绒毛尿囊膜发育界限：密布血管绒毛尿囊膜与鸡胚鸡胚 胎另一面形成显著界限胎另一面形成显著界限（2）标识出鸡胚气室与尿囊界限）标识出鸡胚气室与尿囊界限（3）假如鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发）假如鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉流感病毒的分离培养专家讲座第9页（二）、接种样本（二）、接种样本将标识好鸡胚气室朝上放置在照蛋器上。将标识好鸡胚气室朝上放置在照蛋器上。（2）用）用75酒精消毒鸡胚，用无菌镊子在气室酒精消毒鸡胚，用无菌镊子在气室端钻孔，再无菌眼科剪剪开端钻孔，再无菌眼科剪剪开10 x6mm窗口。窗口。(3)用注射器吸用注射器吸800l标本。标本。(4)从窗口中滴入无菌液体石蜡，轻轻晃动鸡胚，从窗口中滴入无菌液体石蜡，轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯下即可清楚看到鸡胚胎位置。将注射针头刺入胚下即可清楚看到鸡胚胎位置。将注射针头刺入胚胎鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入胎鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚伴随针头拨动而动，即可羊膜腔时，能看到鸡胚伴随针头拨动而动，即可注射注射200l标本。将针头退出至标本。将针头退出至寸，将另外寸，将另外200l标本注入鸡胚尿囊腔。每个样本接种标本注入鸡胚尿囊腔。每个样本接种2个鸡个鸡胚。胚。流感病毒的分离培养专家讲座第10页(5)将针头弃于适当生物安全装置中将针头弃于适当生物安全装置中(6)用消毒过医用胶布封口用消毒过医用胶布封口(7)3335oC 温箱培养鸡胚温箱培养鸡胚23 天。临床天。临床采样标本通常培养采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养天，病毒传代通常培养2天。天。注意：鸡胚进行病毒分离培养时，天天检注意：鸡胚进行病毒分离培养时，天天检验鸡胚生长情况，验鸡胚生长情况，24小时内死亡鸡胚，认小时内死亡鸡胚，认为是非特异死亡应弃去为是非特异死亡应弃去流感病毒的分离培养专家讲座第11页+”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但还有少数红细胞不：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但还有少数红细胞不凝，在管底中心形成小红点。凝，在管底中心形成小红点。“+”：约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不：约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不凝集红细胞在管底中心聚成小圆点。凝集红细胞在管底中心聚成小圆点。“+”：只有少数红细胞凝集，不凝集红细胞在管底中心聚成小：只有少数红细胞凝集，不凝集红细胞在管底中心聚成小圆点，凝集红细胞在小圆点周围。圆点，凝集红细胞在小圆点周围。“”：不凝集，红细胞沉于管底，呈一边缘整齐致密圆点。：不凝集，红细胞沉于管底，呈一边缘整齐致密圆点。流感病毒的分离培养专家讲座第12页