分子生物学技术和应用专家讲座.pptx

z第第第第1919章：分子生物学惯用技术章：分子生物学惯用技术章：分子生物学惯用技术章：分子生物学惯用技术4 4课时课时课时课时y分子杂交、分子杂交、分子杂交、分子杂交、PCRPCR、基因测序、基因测序、基因测序、基因测序y蛋白质研究技术蛋白质研究技术蛋白质研究技术蛋白质研究技术(双向电泳，酵母双杂交双向电泳，酵母双杂交双向电泳，酵母双杂交双向电泳，酵母双杂交)y基因转移与基因剔除基因转移与基因剔除基因转移与基因剔除基因转移与基因剔除(含含含含RNARNA干扰干扰干扰干扰)z第第第第2020章：基因工程章：基因工程章：基因工程章：基因工程4 4课时课时课时课时z第第第第2121章：基因诊疗与基因治疗章：基因诊疗与基因治疗章：基因诊疗与基因治疗章：基因诊疗与基因治疗4 4课时课时课时课时第四篇：分子生物学技术与应用第四篇：分子生物学技术与应用分子生物学技术和应用第1页第十九章第十九章分子生物学惯用技术分子生物学惯用技术分子生物学技术和应用第2页分子生物学技术能帮助我们干什么？分子生物学技术能帮助我们干什么？zz揭示生物大分子揭示生物大分子揭示生物大分子揭示生物大分子(DNA(DNA、RNARNA、蛋白质、蛋白质、蛋白质、蛋白质)结构与功效结构与功效结构与功效结构与功效yyDNADNA 水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位yyRNARNA 水平：定量分析、基因表示产物可变剪接分析水平：定量分析、基因表示产物可变剪接分析水平：定量分析、基因表示产物可变剪接分析水平：定量分析、基因表示产物可变剪接分析yy蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质水平：蛋白质定量、定位、功效水平：蛋白质定量、定位、功效水平：蛋白质定量、定位、功效水平：蛋白质定量、定位、功效yy细胞细胞细胞细胞与与与与整体整体整体整体水平：基因在活体中功效水平：基因在活体中功效水平：基因在活体中功效水平：基因在活体中功效zz目标：了解疾病发生规律，提供治疗与预防伎俩目标：了解疾病发生规律，提供治疗与预防伎俩目标：了解疾病发生规律，提供治疗与预防伎俩目标：了解疾病发生规律，提供治疗与预防伎俩分子生物学技术和应用第3页我们需要了解和掌握哪些基本技术？我们需要了解和掌握哪些基本技术？z基本技术：基本技术：基本技术：基本技术：y核酸：测序、印迹、杂交、体外扩增技术核酸：测序、印迹、杂交、体外扩增技术核酸：测序、印迹、杂交、体外扩增技术核酸：测序、印迹、杂交、体外扩增技术y蛋白质：电泳与印迹、组学技术、相互作用蛋白质：电泳与印迹、组学技术、相互作用蛋白质：电泳与印迹、组学技术、相互作用蛋白质：电泳与印迹、组学技术、相互作用z综合技术：综合技术：综合技术：综合技术：y基因工程技术基因工程技术基因工程技术基因工程技术y转基因生物与基因敲除技术转基因生物与基因敲除技术转基因生物与基因敲除技术转基因生物与基因敲除技术z应用技术：应用技术：应用技术：应用技术：y基因诊疗基因诊疗基因诊疗基因诊疗y基因治疗基因治疗基因治疗基因治疗分子生物学技术和应用第4页zMolecular hybridizationMolecular hybridization:利用已知核酸序列利用已知核酸序列利用已知核酸序列利用已知核酸序列 (探针探针探针探针/probeprobe)检测与其互补未检测与其互补未检测与其互补未检测与其互补未知核酸序列知核酸序列知核酸序列知核酸序列z用途：用途：用途：用途：y确认核酸序列间同源性确认核酸序列间同源性确认核酸序列间同源性确认核酸序列间同源性y对特定核酸序列进行定量对特定核酸序列进行定量对特定核酸序列进行定量对特定核酸序列进行定量y自核酸混合体中识别特定核酸序列自核酸混合体中识别特定核酸序列自核酸混合体中识别特定核酸序列自核酸混合体中识别特定核酸序列第一节：核酸分子杂交第一节：核酸分子杂交分子生物学技术和应用第5页一、基本原理一、基本原理 变性变性变性变性(denaturedenature)复性复性复性复性(renaturerenature)杂交杂交杂交杂交(hybiridizationhybiridization)分子生物学技术和应用第6页核酸核酸变性变性z在特定变性原因作用下，在特定变性原因作用下，在特定变性原因作用下，在特定变性原因作用下，DNADNA双螺旋解离过程双螺旋解离过程双螺旋解离过程双螺旋解离过程z破坏氢键与疏水作用可造成变性破坏氢键与疏水作用可造成变性破坏氢键与疏水作用可造成变性破坏氢键与疏水作用可造成变性热变性：热变性：热变性：热变性：高温高温高温高温可使核酸变性，温度高于可使核酸变性，温度高于可使核酸变性，温度高于可使核酸变性，温度高于 9090时任时任时任时任何核酸双链都将变性何核酸双链都将变性何核酸双链都将变性何核酸双链都将变性酸碱变性：酸碱变性：酸碱变性：酸碱变性：pH3 pH11 pH11 时核酸将变性，时核酸将变性，时核酸将变性，时核酸将变性，DNA DNA 使用碱变性使用碱变性使用碱变性使用碱变性，RNA RNA 则不可则不可则不可则不可化学试剂变性：能够破坏氢键化学试剂如化学试剂变性：能够破坏氢键化学试剂如化学试剂变性：能够破坏氢键化学试剂如化学试剂变性：能够破坏氢键化学试剂如尿素尿素尿素尿素或或或或甲酰胺甲酰胺甲酰胺甲酰胺可使核酸变性可使核酸变性可使核酸变性可使核酸变性分子生物学技术和应用第7页变性温度变性温度zzTmTm：melting temperaturemelting temperature，解链温度或变性温度，解链温度或变性温度，解链温度或变性温度，解链温度或变性温度zz影响变性温度原因：影响变性温度原因：影响变性温度原因：影响变性温度原因：yy溶液离子强度溶液离子强度溶液离子强度溶液离子强度xx变性温度与离子强度变性温度与离子强度变性温度与离子强度变性温度与离子强度 正相关，低盐利于变性正相关，低盐利于变性正相关，低盐利于变性正相关，低盐利于变性yyDNADNA分子分子分子分子 GC GC 含量含量含量含量xxGCGC(Tm(Tm69.3)2.2469.3)2.24分子生物学技术和应用第8页核酸复核酸复性性z变性变性变性变性 DNA DNA 单链相互识别并结合，恢复其天然双螺单链相互识别并结合，恢复其天然双螺单链相互识别并结合，恢复其天然双螺单链相互识别并结合，恢复其天然双螺旋结构过程旋结构过程旋结构过程旋结构过程z复性类似与化学反应，需要一定反应时间复性类似与化学反应，需要一定反应时间复性类似与化学反应，需要一定反应时间复性类似与化学反应，需要一定反应时间分子生物学技术和应用第9页影响影响 DNA 复性速度原因复性速度原因zDNA DNA 分子浓度：浓度高，复性快分子浓度：浓度高，复性快分子浓度：浓度高，复性快分子浓度：浓度高，复性快zDNA DNA 分子长度：长片段复性速度慢分子长度：长片段复性速度慢分子长度：长片段复性速度慢分子长度：长片段复性速度慢zDNA DNA 分子复杂性：重复序列复性速度快分子复杂性：重复序列复性速度快分子复杂性：重复序列复性速度快分子复杂性：重复序列复性速度快zz不一样物种不一样物种不一样物种不一样物种C C0 0t t曲线比较曲线比较曲线比较曲线比较 人类基因组人类基因组人类基因组人类基因组C C0 0t t曲线曲线曲线曲线分子生物学技术和应用第10页二、核酸探针二、核酸探针zProbeProbe：用于测定未知核酸片段已知序列：用于测定未知核酸片段已知序列：用于测定未知核酸片段已知序列：用于测定未知核酸片段已知序列z探针为探针为探针为探针为 DNADNA 或或或或 RNARNA，能够为能够为能够为能够为单链单链单链单链或或或或双链双链双链双链z探针必需经过标识探针必需经过标识探针必需经过标识探针必需经过标识：放射性标识放射性标识放射性标识放射性标识或或或或非放射性标识非放射性标识非放射性标识非放射性标识分子生物学技术和应用第11页1.探针有哪些种类？探针有哪些种类？zDNA DNA 探针探针探针探针：常规探针：常规探针：常规探针：常规探针z 利用基因组利用基因组利用基因组利用基因组 DNA DNA 序列或序列或序列或序列或 cDNA cDNA 序列合成探针，序列合成探针，序列合成探针，序列合成探针，普通为双链，也可制备成单链普通为双链，也可制备成单链普通为双链，也可制备成单链普通为双链，也可制备成单链zRNA RNA 探针探针探针探针：高灵敏度：高灵敏度：高灵敏度：高灵敏度探针探针探针探针z 普通是经过体外转录而来，均为单链普通是经过体外转录而来，均为单链普通是经过体外转录而来，均为单链普通是经过体外转录而来，均为单链z寡核苷酸寡核苷酸寡核苷酸寡核苷酸探针探针探针探针(oligo-nucleotideoligo-nucleotide)：用于用于用于用于点突变检测点突变检测点突变检测点突变检测z人工合成短序列人工合成短序列人工合成短序列人工合成短序列(20nt)(20nt)，可自由选择序列，可自由选择序列，可自由选择序列，可自由选择序列分子生物学技术和应用第12页2.标识物有哪些？标识物有哪些？z标识物要求：标识物要求：标识物要求：标识物要求：y高度高度高度高度灵敏性灵敏性灵敏性灵敏性：足以检测到极微量核酸序列：足以检测到极微量核酸序列：足以检测到极微量核酸序列：足以检测到极微量核酸序列y高度高度高度高度特异性特异性特异性特异性：足以在大量非特异性序列中检测：足以在大量非特异性序列中检测：足以在大量非特异性序列中检测：足以在大量非特异性序列中检测到特异靶序列到特异靶序列到特异靶序列到特异靶序列z标识物种类：标识物种类：标识物种类：标识物种类：y放射性同位素放射性同位素放射性同位素放射性同位素(radio isotoperadio isotope)y非放射性标识物非放射性标识物非放射性标识物非放射性标识物(non-radioactive labelnon-radioactive label)分子生物学技术和应用第13页放射性同位素放射性同位素z特点：灵敏度最高标识物，足以检测到飞克特点：灵敏度最高标识物，足以检测到飞克特点：灵敏度最高标识物，足以检测到飞克特点：灵敏度最高标识物，足以检测到飞克级微量级微量级微量级微量核酸序列核酸序列核酸序列核酸序列 gmggngpgfggmggngpgfgz惯用放射性同位素惯用放射性同位素惯用放射性同位素惯用放射性同位素分子生物学技术和应用第14页放射性标识核苷酸单体放射性标识核苷酸单体zdNTP or NTPdNTP or NTPz5 or 3 P5 or 3 P3232 labelling labelling分子生物学技术和应用第15页非放射性标识物非放射性标识物z特点：安全且易于存放，但灵敏度与特异性均不及特点：安全且易于存放，但灵敏度与特异性均不及特点：安全且易于存放，但灵敏度与特异性均不及特点：安全且易于存放，但灵敏度与特异性均不及放射性同位素放射性同位素放射性同位素放射性同位素y地高辛：地高辛：地高辛：地高辛：经过地高辛抗体结合并检测经过地高辛抗体结合并检测经过地高辛抗体结合并检测经过地高辛抗体结合并检测y生物素：生物素：生物素：生物素：结合亲和素结合亲和素结合亲和素结合亲和素/链亲和素链亲和素链亲和素链亲和素(avidinavidin/streptavidinstreptavidin)y化学发光物质：经过紫外激发或化学反应而发光化学发光物质：经过紫外激发或化学反应而发光化学发光物质：经过紫外激发或化学反应而发光化学发光物质：经过紫外激发或化学反应而发光y电子密度标识物：金等重金属电子密度标识物：金等重金属电子密度标识物：金等重金属电子密度标识物：金等重金属分子生物学技术和应用第16页3.怎样检测杂交信号？怎样检测杂交信号？z同位素标识物：同位素标识物：同位素标识物：同位素标识物：y盖革计数器、液体闪烁计数器盖革计数器、液体闪烁计数器盖革计数器、液体闪烁计数器盖革计数器、液体闪烁计数器y放射自显影放射自显影放射自显影放射自显影(autoradiographyautoradiography)分子生物学技术和应用第17页怎样检测杂交信号？怎样检测杂交信号？z非放射性标识物：非放射性标识物：非放射性标识物：非放射性标识物：y酶联免疫技术酶联免疫技术酶联免疫技术酶联免疫技术(enzyme linked immuno-assayenzyme linked immuno-assay)y化学发光化学发光化学发光化学发光(chemiluminescencechemiluminescence)分子生物学技术和应用第18页三、怎样对核酸探针进行标识？三、怎样对核酸探针进行标识？分子生物学技术和应用第19页1.缺口平移缺口平移znick translation:nick translation:z适合用于适合用于适合用于适合用于标识标识标识标识双双双双链链链链DNADNAz控制控制控制控制 DNase I DNase I 用用用用量，能够控制探量，能够控制探量，能够控制探量，能够控制探针长度针长度针长度针长度分子生物学技术和应用第20页2.非放探针酶促标识非放探针酶促标识z生物素或地高辛标识核苷酸单体经过酶促反应能够生物素或地高辛标识核苷酸单体经过酶促反应能够生物素或地高辛标识核苷酸单体经过酶促反应能够生物素或地高辛标识核苷酸单体经过酶促反应能够参入探针参入探针参入探针参入探针分子生物学技术和应用第21页3.非放探针化学标识非放探针化学标识z利用光敏基因经可见光照射直接与核酸结合利用光敏基因经可见光照射直接与核酸结合利用光敏基因经可见光照射直接与核酸结合利用光敏基因经可见光照射直接与核酸结合分子生物学技术和应用第22页四、怎样进行四、怎样进行杂交杂交？z样品样品样品样品(DNA or RNA)(DNA or RNA)吸附于支持物吸附于支持物吸附于支持物吸附于支持物y尼龙膜、硝酸纤维膜、载玻片等尼龙膜、硝酸纤维膜、载玻片等尼龙膜、硝酸纤维膜、载玻片等尼龙膜、硝酸纤维膜、载玻片等z与标识探针杂交与标识探针杂交与标识探针杂交与标识探针杂交y封闭液封闭后杂交，杂交炉中进行封闭液封闭后杂交，杂交炉中进行封闭液封闭后杂交，杂交炉中进行封闭液封闭后杂交，杂交炉中进行z缓冲液清洗缓冲液清洗缓冲液清洗缓冲液清洗y控制温度与变性剂浓度控制温度与变性剂浓度控制温度与变性剂浓度控制温度与变性剂浓度z显色显色显色显色y放射自显影放射自显影放射自显影放射自显影/酶联显色酶联显色酶联显色酶联显色分子生物学技术和应用第23页五、五、杂交杂交有哪些不一样方式？有哪些不一样方式？z斑点杂交斑点杂交斑点杂交斑点杂交：dot hybridizationdot hybridizationzSouthern Southern 印迹杂交印迹杂交印迹杂交印迹杂交：Southern blotSouthern blotzNorthern Northern 印迹杂交印迹杂交印迹杂交印迹杂交：Northern blotNorthern blotyWestern blottingWestern blotting：不是杂交：不是杂交：不是杂交：不是杂交z原位杂交：原位杂交：原位杂交：原位杂交：in situ in situ hybridizationhybridizationz反反反反 Northern Northern 印迹杂交：印迹杂交：印迹杂交：印迹杂交：reverse Northern blotreverse Northern blotz基因芯片基因芯片基因芯片基因芯片/DNA/DNA微阵列微阵列微阵列微阵列：Genechip/DNA microarrayGenechip/DNA microarray分子生物学技术和应用第24页dot hybridizationz将将将将核酸核酸核酸核酸样品直接点在杂交膜上样品直接点在杂交膜上样品直接点在杂交膜上样品直接点在杂交膜上与探针进行杂交与探针进行杂交与探针进行杂交与探针进行杂交z特点：简便但特异性不高特点：简便但特异性不高特点：简便但特异性不高特点：简便但特异性不高可探测核酸含量，但无法得知分子大小可探测核酸含量，但无法得知分子大小可探测核酸含量，但无法得知分子大小可探测核酸含量，但无法得知分子大小分子生物学技术和应用第25页Southern blotzEdwin Southern Edwin Southern 创建方法创建方法创建方法创建方法z电泳技术与杂交结合，可显示靶电泳技术与杂交结合，可显示靶电泳技术与杂交结合，可显示靶电泳技术与杂交结合，可显示靶 DNA DNA 序列长度序列长度序列长度序列长度z可进行毛吸管转移、真空转移与电转移可进行毛吸管转移、真空转移与电转移可进行毛吸管转移、真空转移与电转移可进行毛吸管转移、真空转移与电转移分子生物学技术和应用第26页电泳电泳转膜转膜杂交杂交分子生物学技术和应用第27页Northern blotz类似于类似于类似于类似于 Southern Southern 印迹杂交方法印迹杂交方法印迹杂交方法印迹杂交方法，用于，用于，用于，用于 RNA RNA 检测检测检测检测分子生物学技术和应用第28页in situ hybridizationz原位杂交原位杂交原位杂交原位杂交：特定：特定：特定：特定 mRNA mRNA 组织组织组织组织细胞细胞细胞细胞分布分布分布分布分子生物学技术和应用第29页FISHzFluorescence in situ hybridizationFluorescence in situ hybridization (FISH)(FISH)：特定基：特定基：特定基：特定基因染色体定位因染色体定位因染色体定位因染色体定位分子生物学技术和应用第30页反反 Northern 杂交与杂交与 DNA 芯片芯片z反反反反 Northern Northern 杂交杂交杂交杂交：将探针：将探针：将探针：将探针 DNA DNA 片段固定在杂交膜片段固定在杂交膜片段固定在杂交膜片段固定在杂交膜上，利用标识物标识上，利用标识物标识上，利用标识物标识上，利用标识物标识 RNA RNA 进行杂交进行杂交进行杂交进行杂交分子生物学技术和应用第31页第二节：聚合酶链式反应第二节：聚合酶链式反应zPCRPCR，polymerase chain reactionpolymerase chain reactiony在体外选择性扩增特定在体外选择性扩增特定在体外选择性扩增特定在体外选择性扩增特定 DNA DNA 片段高效伎俩片段高效伎俩片段高效伎俩片段高效伎俩z7070 年年年年代代代代有些人提出有些人提出有些人提出有些人提出 PCR PCR 构想，因缺乏寡核苷酸合构想，因缺乏寡核苷酸合构想，因缺乏寡核苷酸合构想，因缺乏寡核苷酸合成伎俩和适合酶而无法进行成伎俩和适合酶而无法进行成伎俩和适合酶而无法进行成伎俩和适合酶而无法进行z1984 1984 年年年年 Kary Mullis Kary Mullis 创造创造创造创造 PCRPCR，并所以取得并所以取得并所以取得并所以取得 1993 1993 年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖z全自动热循环仪和各种全自动热循环仪和各种全自动热循环仪和各种全自动热循环仪和各种 PCR PCR 衍生技术使其衍生技术使其衍生技术使其衍生技术使其成成成成为主要为主要为主要为主要科学研究伎俩科学研究伎俩科学研究伎俩科学研究伎俩分子生物学技术和应用第32页一、一、PCR 基本原理基本原理z在体外，以特定在体外，以特定在体外，以特定在体外，以特定引物引物引物引物引引引引导，经过导，经过导，经过导，经过 DNADNA 聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶选择性扩增特定区域选择性扩增特定区域选择性扩增特定区域选择性扩增特定区域z变性变性变性变性(denaturedenature)z退火退火退火退火(annealanneal)z延伸延伸延伸延伸(extensionextension)分子生物学技术和应用第33页DNADNA体内复制体内复制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNADNA解解旋解链旋解链分子生物学技术和应用第34页ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物DNADNA解解旋解链旋解链引物引物合成合成DNADNA体内复制体内复制分子生物学技术和应用第35页ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶DNA解解旋解链旋解链引物引物合成合成新链新链延伸延伸DNA体内复制体内复制分子生物学技术和应用第36页ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35变性复性加热退火DNA加热解链分子生物学技术和应用第37页模板DNA94分子生物学技术和应用第38页55引物1引物2DNA引物分子生物学技术和应用第39页引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶分子生物学技术和应用第40页第1轮结束94第2轮开始分子生物学技术和应用第41页72TaqTaqTaqTaq55分子生物学技术和应用第42页第2轮结束分子生物学技术和应用第43页重复重复3030轮后轮后2 23030=1,073,741,824=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增 第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 分子生物学技术和应用第44页1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1-3步25-30轮目标DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性新链延伸DNA体外扩增体外扩增热循环DNA解链分子生物学技术和应用第45页PCR反应体系反应体系4种dNTP混合物 各200 mol/L引物 各0.1-0.5 mol/L模板DNA 0.12 gTaq DNA聚合酶 2.5 UMg2+1.5mmol/LDNA体外扩增体外扩增分子生物学技术和应用第46页PCR 技术特点技术特点z高度灵敏性高度灵敏性高度灵敏性高度灵敏性：理论上经：理论上经：理论上经：理论上经 20 20 循环可将目标基因片段扩循环可将目标基因片段扩循环可将目标基因片段扩循环可将目标基因片段扩增增增增 2 220201000000 1000000 倍倍倍倍z高度特异性高度特异性高度特异性高度特异性：利用引物与模板特异性配对，可确保：利用引物与模板特异性配对，可确保：利用引物与模板特异性配对，可确保：利用引物与模板特异性配对，可确保扩增特异性扩增特异性扩增特异性扩增特异性y一对一对一对一对 20 20 碱基长引物多样性为碱基长引物多样性为碱基长引物多样性为碱基长引物多样性为4 4404010102424z应用广泛性应用广泛性应用广泛性应用广泛性：当前已经成为分子生物学研究必不可：当前已经成为分子生物学研究必不可：当前已经成为分子生物学研究必不可：当前已经成为分子生物学研究必不可少伎俩少伎俩少伎俩少伎俩z操作简便性操作简便性操作简便性操作简便性：不需要复杂设备和繁琐流程：不需要复杂设备和繁琐流程：不需要复杂设备和繁琐流程：不需要复杂设备和繁琐流程分子生物学技术和应用第47页二、做二、做 PCR 要有什么条件？要有什么条件？z酶酶酶酶：Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶z模板模板模板模板 DNADNA：能够为基因组能够为基因组能够为基因组能够为基因组 DNA DNA 或或或或 cDNAcDNAz引物引物引物引物：人工合成寡核苷酸片段：人工合成寡核苷酸片段：人工合成寡核苷酸片段：人工合成寡核苷酸片段zdNTPdNTP：聚合反应核苷酸单体聚合反应核苷酸单体聚合反应核苷酸单体聚合反应核苷酸单体z缓冲液：包含特定缓冲液：包含特定缓冲液：包含特定缓冲液：包含特定 pHpH、离子强度和离子强度和离子强度和离子强度和 MgMg2+2+z反应程序：变性、退火、延伸组成循环反应程序：变性、退火、延伸组成循环反应程序：变性、退火、延伸组成循环反应程序：变性、退火、延伸组成循环z仪器：仪器：仪器：仪器：DNA DNA 热循环仪，或称热循环仪，或称热循环仪，或称热循环仪，或称 PCR PCR 仪仪仪仪分子生物学技术和应用第48页DNA聚合酶催化聚合反应dNTP分子生物学技术和应用第49页1.什么是什么是耐热耐热 DNA 聚合酶聚合酶z早期早期早期早期 PCR PCR 曾曾曾曾使用使用使用使用 DNA DNA 聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 I Iy在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶y延伸反应温度为延伸反应温度为延伸反应温度为延伸反应温度为 37 37，非特异性太多，非特异性太多，非特异性太多，非特异性太多z当前惯用当前惯用当前惯用当前惯用 Taq DNATaq DNA 聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶y纯化自嗜热水生菌纯化自嗜热水生菌纯化自嗜热水生菌纯化自嗜热水生菌 (Thermus aquaticusThermus aquaticus)y可耐受可耐受可耐受可耐受 95 95 高温，最适反应温度为高温，最适反应温度为高温，最适反应温度为高温，最适反应温度为 72 72 左右左右左右左右分子生物学技术和应用第50页Taq DNA polymerasez在在在在 7075 7075 范围活性最正确，每秒可延伸范围活性最正确，每秒可延伸范围活性最正确，每秒可延伸范围活性最正确，每秒可延伸 150 150ntntz95 95 时半衰期为时半衰期为时半衰期为时半衰期为 40 40 minminy按变性时间按变性时间按变性时间按变性时间 1 1 min min 计，能满足计，能满足计，能满足计，能满足 30 30 循环反应循环反应循环反应循环反应zTaq Taq 酶含有酶含有酶含有酶含有 5 5 3 3 聚合活性和聚合活性和聚合活性和聚合活性和 5 5 3 3 外切活性外切活性外切活性外切活性z不具备校读活性不具备校读活性不具备校读活性不具备校读活性，错误率为，错误率为，错误率为，错误率为 210 2104 4 左右左右左右左右y错误合成错误合成错误合成错误合成 DNADNA片段能够作为模板，循环数越多，片段能够作为模板，循环数越多，片段能够作为模板，循环数越多，片段能够作为模板，循环数越多，最终扩增产物错误率越高最终扩增产物错误率越高最终扩增产物错误率越高最终扩增产物错误率越高y只能用于检测，不适合基因克隆只能用于检测，不适合基因克隆只能用于检测，不适合基因克隆只能用于检测，不适合基因克隆分子生物学技术和应用第51页有有保真性保真性耐热耐热 DNA 聚合酶聚合酶吗？吗？zPfuPfu DNA polymerase DNA polymerase：y惯用高保真耐热惯用高保真耐热惯用高保真耐热惯用高保真耐热 DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶y有有有有5 5 3 3 外切外切外切外切活性活性活性活性y错误率约错误率约错误率约错误率约 110 1106 6y适应于基因克隆适应于基因克隆适应于基因克隆适应于基因克隆分子生物学技术和应用第52页2.怎样设计怎样设计寡聚核苷酸引物寡聚核苷酸引物？z引物引物引物引物(primerprimer)是是是是 PCR PCR 反应必备前反应必备前反应必备前反应必备前提提提提，对，对，对，对 PCR PCR 产物类产物类产物类产物类型、长度和反应特异性含有决定作用型、长度和反应特异性含有决定作用型、长度和反应特异性含有决定作用型、长度和反应特异性含有决定作用zPCR PCR 需要两条引物，引物决定扩增范围和扩增片段需要两条引物，引物决定扩增范围和扩增片段需要两条引物，引物决定扩增范围和扩增片段需要两条引物，引物决定扩增范围和扩增片段长度长度长度长度分子生物学技术和应用第53页引物设计标准引物设计标准z引物长度普通为引物长度普通为引物长度普通为引物长度普通为 1530 1530 核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸y引物太短引物太短引物太短引物太短影响杂交体稳定和特异性影响杂交体稳定和特异性影响杂交体稳定和特异性影响杂交体稳定和特异性y引物太长引物太长引物太长引物太长随机匹配序列增随机匹配序列增随机匹配序列增随机匹配序列增多多多多，特异性，特异性，特异性，特异性反而下降反而下降反而下降反而下降zGC GC 含量普通为含量普通为含量普通为含量普通为 4 40 0 6 60 0y应充分考虑应充分考虑应充分考虑应充分考虑退火温度退火温度退火温度退火温度(annealing temperatureannealing temperature)xGC GC 含量低，退火温度低，易出现非特异含量低，退火温度低，易出现非特异含量低，退火温度低，易出现非特异含量低，退火温度低，易出现非特异xGC GC 含量高，非特异性含量高，非特异性含量高，非特异性含量高，非特异性结合结合结合结合也会增加也会增加也会增加也会增加y引物解链温度粗略引物解链温度粗略引物解链温度粗略引物解链温度粗略计算公式：计算公式：计算公式：计算公式：引物解链温度引物解链温度引物解链温度引物解链温度TmTm4(4(GGC)C)2(A2(AT)T)分子生物学技术和应用第54页引物设计标准引物设计标准z引物本身不应该存在链内互补序列，以预防出现发引物本身不应该存在链内互补序列，以预防出现发引物本身不应该存在链内互补序列，以预防出现发引物本身不应该存在链内互补序列，以预防出现发卡结构卡结构卡结构卡结构 z两条引物间两条引物间两条引物间两条引物间、同一引物分子间、同一引物分子间、同一引物分子间、同一引物分子间不应存在互补序列不应存在互补序列不应存在互补序列不应存在互补序列yy出现互补易造成引物二聚体出现，影响扩增效率出现互补易造成引物二聚体出现，影响扩增效率出现互补易造成引物二聚体出现，影响扩增效率出现互补易造成引物二聚体出现，影响扩增效率分子生物学技术和应用第55页引物设计标准引物设计标准z防止引物与非特异序列间同源性防止引物与非特异序列间同源性防止引物与非特异序列间同源性防止引物与非特异序列间同源性z引物引物引物引物 3 3，末端必末端必末端必末端必须须须须与模板完全互补与模板完全互补与模板完全互补与模板完全互补，5 5，末端允许添加末端允许添加末端允许添加末端允许添加非配对序列非配对序列非配对序列非配对序列y5 5，末端允许添加非匹配序列末端允许添加非匹配序列末端允许添加非匹配序列末端允许添加非匹配序列，如：，如：，如：，如：酶切位点酶切位点酶切位点酶切位点53分子生物学技术和应用第56页3.怎样选择怎样选择 dNTP 和缓冲液和缓冲液?zdNTP dNTP 是聚合反应底物是聚合反应底物是聚合反应底物是聚合反应底物y常规使用浓度：常规使用浓度：常规使用浓度：常规使用浓度：0.2 0.2 mM eachmM eachy探针标识时，可使用同位素或非放标识探针标识时，可使用同位素或非放标识探针标识时，可使用同位素或非放标识探针标识时，可使用同位素或非放标识 dNTPdNTPz缓冲液：特定缓冲液：特定缓冲液：特定缓冲液：特定 pH pH 和离子强度和离子强度和离子强度和离子强度yMgMg2 2浓度普通为浓度普通为浓度普通为浓度普通为 1.5 1.5 mMmMzPCR mixPCR mix：预制便捷反应体系：预制便捷反应体系：预制便捷反应体系：预制便捷反应体系分子生物学技术和应用第57页4.用什么做用什么做模板模板 DNA？zPCR PCR 模板模板模板模板(templatetemplate)能够是基因组能够是基因组能够是基因组能够是基因组 DNADNA 或或或或 cDNAcDNAy逆转录逆转录逆转录逆转录-PCR(PCR(reverse transcription PCRreverse transcription PCR)：RT-PCRRT-PCRz在利用在利用在利用在利用 DNA DNA 为模板进行扩增时纯化为模板进行扩增时纯化为模板进行扩增时纯化为模板进行扩增时纯化比较简单比较简单比较简单比较简单yy血液、病原体、体外培养细胞、甚至病理标本经简单血液、病原体、体外培养细胞、甚至病理标本经简单血液、病原体、体外培养细胞、甚至病理标本经简单血液、病原体、体外培养细胞、甚至病理标本经简单处理后均可直接进行处理后均可直接进行处理后均可直接进行处理后均可直接进行 PCR PCR 扩增扩增扩增扩增zRNA RNA 样品普通要经过样品普通要经过样品普通要经过样品普通要经过严格严格严格严格纯化，并逆转录纯化，并逆转录纯化，并逆转录纯化，并逆转录yy未经纯化未经纯化未经纯化未经纯化 RNA RNA 不稳定，无法进行逆转录不稳定，无法进行逆转录不稳定，无法进行逆转录不稳定，无法进行逆转录yy反应体系中如存在反应体系中如存在反应体系中如存在反应体系中如存在 DNADNA，将对将对将对将对 RNA RNA 扩增产生干扰扩增产生干扰扩增产生干扰扩增产生干扰 分子生物学技术和应用第58页6.怎样设计怎样设计反应程序反应程序？zPCR PCR 循环数：循环数：循环数：循环数：y理论上理论上理论上理论上 20 25 20 25 即可满足即可满足即可满足即可满足扩增需要，但实际循环数扩增需要，但实际循环数扩增需要，但实际循环数扩增需要，但实际循环数普通为普通为普通为普通为 25 35 25 35y过多循环后抵达平台期，过多循环后抵达平台期，过多循环后抵达平台期，过多循环后抵达平台期，继续延长循环数无效继续延长循环数无效继续延长循环数无效继续延长循环数无效y模板浓度高时平台期出现早，模板浓度低时平模板浓度高时平台期出现早，模板浓度低时平模板浓度高时平台期出现早，模板浓度低时平模板浓度高时平台期出现早，模板浓度低时平台期出现晚，台期出现晚，台期出现晚，台期出现晚，应依据模板浓度调整循环数应依据模板浓度调整循环数应依据模板浓度调整循环数应依据模板浓度调整循环数分子生物学技术和应用第59页反应程序反应程序关键是退火温度关键是退火温度z退火温度：退火温度：退火温度：退火温度：y提升退火温度有利于提升提升退火温度有利于提升提升退火温度有利于提升提升退火温度有利于提升反应特异性反应特异性反应特异性反应特异性y退火温度过高将造成引物退火温度过高将造成引物退火温度过高将造成引物退火温度过高将造成引物与模板无法配对，影响扩增与模板无法配对，影响扩增与模板无法配对，影响扩增与模板无法配对，影响扩增效率效率效率效率y反应退火温度主要取决于反应退火温度主要取决于反应退火温度主要取决于反应退火温度主要取决于引物序列引物序列引物序列引物序列 分子生物学技术和应用第60页三、我们能用三、我们能用 PCR 做什么？做什么？z自自自自 PCR PCR 技术创建以来，经近技术创建以来，经近技术创建以来，经近技术创建以来，经近 20 20 年发展，在基本年发展，在基本年发展，在基本年发展，在基本 PCR PCR 技术基础上产生了各种技术基础上产生了各种技术基础上产生了各种技术基础上产生了各种 PCR PCR 衍生技术，应用衍生技术，应用衍生技术，应用衍生技术，应用于各种不一样目标于各种不一样目标于各种不一样目标于各种不一样目标y基因克隆或亚克隆基因克隆或亚克隆基因克隆或亚克隆基因克隆或亚克隆基因工程基因工程基因工程基因工程y特定基因表示量分析特定基因表示量分析特定基因表示