液质联用仪原理及操作注意事项安捷伦(课堂PPT).ppt

液质联用仪原理及操作注意事项液质联用仪原理及操作注意事项LDD12高效液相色谱质谱联用（HPLC/MS）是指高效液相色谱与质谱串联的技术，是将应用范围极广的高效液相分离方法与灵敏、专属、能够提供分子量和结构信息的质谱法结合起来的一种现代分析技术。液质联用技术简介液质联用技术简介22024/11/1 周五HPLC-MS主要由HPLC仪、接口离子源（LC与MS连接装置）、质量分析器、真空系统、计算机数据处理系统组成。过程：混合样品通过液相色谱系统进样，由色谱柱分离，从色谱仪流出的被分离组分依次通过接口进入MS仪的离子源处被离子化，然后离子被聚焦于质量分析器中，根据质荷比而分离，分离后的离子信号转变为电信号，传送至数据处理系统，对样品进行定性定量分析。液质联用技术简介液质联用技术简介32024/11/1 周五 质谱系统的结构介绍（ESI、库伦爆炸）定量方法的开发液质联用各系统的操作注意事项质谱系统的维护 主要内容主要内容42024/11/1 周五一、质谱的系统结构示意图一、质谱的系统结构示意图52024/11/1 周五质谱系统各部件介绍1.离子源：产生离子化，并将产生的离子在电场的作用下进入毛细管 3.离子光学组件：包括skimmer 1，八级杆以及Len 1和Len 2,进一步除去溶剂和中性分子，高效的离子传输组件，聚焦随机运动的离子进入四级杆。2.毛细管：离子导入通道，将离子源产生的离子传输进入质谱，同时隔离外部的常压与质谱内部的高真空4.四级杆MS1和MS2：质量过滤器，优化离子传输和质谱分辨率，可以选择让某些质荷比的离子一次通过或者所有离子全通过。5.碰撞池：高压碰撞池，优化裂解，六级杆设计有助于捕获碎片离子6.检测器：包括高能打拿级和电子倍增器，增强信号，高增益毛细管电压 Capillary Voltage毛细管出口电压Fragmentor碰撞能 Collision energy电子倍增电压 EMV62024/11/1 周五ESI离子源的原理 ESI将溶液中的离子转变为气相离子三大步骤三大步骤：1.在喷雾毛细管尖端产生带电雾滴2.通过溶剂蒸发和雾滴分裂使带电雾滴变小，这一过程反复进行，直至生成很小的带电雾滴3.由很小带电雾滴产生气相离子特点1.直角喷雾离子源设计，大大减少了未离子化的中性液滴进入质谱中，降低噪音，保证毛细管和离子光路更干净，抗污染2.反吹干燥系统，加速喷雾的溶剂挥发，减少溶剂簇和流动相的附加离子，在standby状态时，仍维持一定的干燥气温度和流量，避免空气吸入质谱真空系统，极大的减少了污染72024/11/1 周五 库伦爆炸原理：带有被测物质离子的流动相在雾化针尖端发生雾化，液滴表面富集带同种电荷的离子，内部带相反电荷聚集，形成带电液滴细的喷雾，在电场的作用下，飞向毛细管。加热的氮气干燥气体反向流动，带走液滴中的中性溶剂分子，从而收缩液滴，直至排斥的静电力超过液滴表面张力，引起库伦爆炸，过程不断重复，待分析物离子最终变成气态进入毛细管。82024/11/1 周五1.全扫描scan,确认得到化合物离子质量数2.选择离子模式，优化毛细管出口电压(fragmentor),保证母离子的传输效率3.子离子扫描，使用优化好的fragmentor,选择定量离子，优化碰撞能量，优化子离子的响应4多重反应监测MRM定量，使用已优化好的fragmentor,优化每个子离子的碰撞能MS2 ScanMS2 ScanMS2 SIMMS2 SIMProduct Product Ion ScanIon ScanMRMMRM二、定量方法的开发逻辑顺序：92024/11/1 周五1.MS2 Scan 确定待测物的分子离子102024/11/1 周五2.MS2 SIM 优化待测物的fragmentor112024/11/1 周五3.Product Ion Scan Product Ion Scan 确定定性定量离子122024/11/1 周五4.MRM MRM 优化子离子碰撞能132024/11/1 周五流动相以及样品必须过膜（有机滤膜、水系膜）流动相应超声脱气1020min,否则压力易波动（装有在线脱气机，影响会小一些）流动相每两天至少更换 过膜处理反相常用流动相为甲醇、乙腈、水以及缓冲盐溶液。注意：LC中常采用无机缓冲盐，LC/MS中则应该使用挥发性的缓冲盐，如甲酸铵、乙酸铵；或挥发性酸碱甲酸、乙酸、氨水等调节pH缓冲盐的使用三、液质操作系统的注意事项LC/MS中不能使用磷酸盐、硼酸盐、硫酸盐、三氟乙酸、三乙胺，易残留，会形成强离子对，产生离子抑制，降低灵敏度不能使用的溶剂添加剂溶剂的截止波长：乙腈/190nm,甲醇/210nm,水/190nm.一般分析时样品检测波长应至少大于所用溶剂的截止波长20nm以上，否则背景较高。溶剂截止波长1 12 23 34 4流动相142024/11/1 周五色谱柱根据键合相的不同可分为氨基柱、C8、C18、C30柱等等色谱柱使用完要冲洗，特别是使用缓冲盐分析样品时，原则上用于冲洗的流动相中水的比例应该等于或高于分析时所用流动相中水的比例。严禁用纯水冲洗柱子，易造成固定相的流失和键合相的坍塌。（特殊柱子除外，如T3柱，因具有三相键合相，所以高耐水性，用于分析丙酸、EDTA、三聚氰胺等）三、液质操作系统的注意事项123反相色谱柱152024/11/1 周五紫外检测器UV二极管阵列检测器DAD荧光检测器FLD蒸发光散色检测器ELSD示差检测器RID质谱检测器MS三、液质操作系统的注意事项检测器的选择162024/11/1 周五适用于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品甲乙酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式（如磺胺类、喹诺酮类物质）适合于酸性样品，可用氨水对样品进行碱化，样品中含有较多的强负电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式（如氯霉素）三、液质操作系统的注意事项正离子 模式负离子 模式正正负负离离子子模模式式选选择择的的一一般般原原则则：172024/11/1 周五四、质谱系统的日常维护及故障排除维护周期182024/11/1 周五四、质谱系统的日常维护及故障排除1.冲洗雾化气组件样品运行结束后，可以使用90%乙腈/10%水,把质谱设置on,冲洗三分钟，可以有效除去雾化器以及质谱切换阀内痕量的样品残留。当雾化器较脏时，可取下雾化器，使用合适的，可以充分溶解可能的样品残留的溶剂超声（雾化器尖端不可接触到容器壁）192024/11/1 周五四、质谱系统的日常维护及故障排除2.清洗电喷雾雾化室将仪器设置为standby,待离子源温度冷却后，用50%异丙醇-水溶液浸湿无尘布，擦拭弧形电极和喷雾挡盖以及周围。（切禁直接对着毛细管末端冲洗，压力会增大，造成涡轮泵负载急剧增加，容易损坏涡轮泵）202024/11/1 周五四、质谱系统的日常维护及故障排除3.打开气镇阀必须每周逆时针拧开气镇阀到底，维持20-30min，把油气分离器内多余的泵油放回泵内，然后顺时拧紧，关闭气镇阀。关机前务必确认气镇阀处于关闭状态，否则泵油可能因此回流到质谱的真空腔内，损坏仪器212024/11/1 周五四、故障排除1.检查溶液化学性质，确定样品溶剂是合适的2.保证用新样品，并且正确存储样品3.检查雾化器条件4.清洁毛细管入口5.检查毛细管有无损坏和污染1.重新校正质量轴2.确定调谐用离子，估计样品离子的质量范围并显示强稳定的信号1.确保雾化气压设定足够高以利液相色谱流动相气化2.检查雾化器中针头的位置3停止溶剂流动，卸下雾化装置，检查雾化器末端是否损坏1.确保LC在工作，在正确的瓶中有足够溶剂2.检查LC故障提示3.检查阻塞情况4.修理或更换任何阻塞部件5检查是否存在渗漏6.保证MS气流选择器设定在与液相色谱仪联通的位置信号低质量准确度差雾化器出口是小液滴而不喷雾无液流222024/11/1 周五Q&A232024/11/1 周五242