IGSF9在上皮性卵巢癌中的表达及对卵巢癌细胞转移能力的影响.pdf

国际医药卫生导报 2023 年8 月第 29 卷第 16 期IMHGN,August 2023,Vol.29,No.16IGSF9在上皮性卵巢癌中的表达及对卵巢癌细胞转移能力的影响丁佰娟1 张立伟2 杨慧1 崔秀娟1 李南11徐州医科大学附属滕州市中心人民医院妇科，滕州277500；2上海复旦大学附属妇产科医院妇科，上海200011通信作者：崔秀娟，Email：zhaoyi_【摘要】目的研究免疫球蛋白超家族成员9（IGSF9）在上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）中的表达，分析其与EOC患者预后及临床病理特征之间的关系，探究IGSF9对卵巢癌细胞转移能力的影响。方法使用基因表达谱数据动态分析（GEPIA）网站综合分析IGSF9 mRNA表达情况，Kaplan-Meier Plotter 数据库分析 IGSF9表达与卵巢癌患者生存期之间的关系。选取 2010年 6月至2020年6月于滕州市中心人民医院妇科就诊的EOC患者原发病灶石蜡样本76例及同期因其他疾病切除的正常卵巢组织石蜡标本30例，免疫组织化学染色检测IGSF9在EOC患者组织和正常组织的表达并分析EOC患者中IGSF9表达与患者的临床病理特征之间的相关性。使用shRNA构建IGSF9干扰的 SKOV3 卵巢癌细胞株，通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）鉴定干扰效果，使用Transwell小室法检测干扰IGSF9后SKOV3细胞株转移能力。采用t检验、方差分析和2检验。结果GEPIA数据库显示，IGSF9在EOC中的表达水平是正常组织的21.8倍；高表达IGSF9的患者5年整体生存期和无进展生存期均较差。免疫组化显示，IGSF9在EOC组织和正常卵巢组织的高表达率分别是69.7%和16.7%；IGSF9蛋白的表达与EOC患者的FIGO分期、腹腔转移、血清糖类抗原（CA）-125水平有相关性；干扰IGSF9后卵巢癌细胞转移能力减低。结论IGSF9在EOC中表达升高，且与EOC患者预后不良及较差的临床病理特征有关；IGSF9能够促进卵巢癌细胞转移；IGSF9能促进EOC的进展；IGSF9对患者的诊治及预后判断有一定价值。【关键词】上皮性卵巢癌；IGSF9；预后；临床病理特征；肿瘤转移基金项目：国家自然科学基金项目（82101727）Expression of IGSF9 in epithelial ovarian cancer and its effect on metastasis of ovarian cancer cells Ding Baijuan1,Zhang Liwei2,Yang Hui1,Cui Xiujuan1,Li Nan11 Department of Gynecology,Tengzhou Central Peoples Hospital,Xuzhou Medical University,Tengzhou 277500,China;2 Department of Gynecology,Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University,Shanghai 200011,ChinaCorresponding author:Cui Xiujuan,Email:zhaoyi_【Abstract】ObjectiveTo study the expression of immunoglobulin superfamily member 9(IGSF9)in epithelial ovarian cancer(EOC),to analyze its relationship with prognosis and clinicopathological characteristics of EOC patients,and to explore the effect of IGSF9 on the metastatic ability of ovarian cancer cells.MethodsThe expression of IGSF9 mRNA was analyzed by dynamic analysis website of gene expression profile data(GEPIA).The relationship between IGSF9 expression and the patients survival time was analyzed by the Kaplan-Meier Plotter database.A 科研课题专栏DOI：10.3760/cma.j.issn.1007-1245.2023.16.011收稿日期 2023-03-09 本文编辑 成观星引用本文：丁佰娟,张立伟,杨慧,等.IGSF9在上皮性卵巢癌中的表达及对卵巢癌细胞转移能力的影响J.国际医药卫生导报,2023,29(16):2268-2272.DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-1245.2023.16.011.2268国际医药卫生导报 2023 年8 月第 29 卷第 16 期IMHGN,August 2023,Vol.29,No.16total of 76 paraffin samples from the primary lesions of the EOC patients who were treated in Department of Gynecology,Tengzhou Central Peoples Hospital from June 2010 to June 2020 and 30 paraffin samples from the normal ovarian tissue removed due to other diseases during the same period were selected.The expressions of IGSF9 in the EOC patients tissue and normal tissue were detected by the immunohistochemical staining;the correlation between IGSF9 expression and clinicopathological characteristics was analyzed.The SKOV3 ovarian cancer cell line interfered by IGSF9 was constructed by shRNA.Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(qRT-PCR)was used to identify the interference effect.The Transwell chamber method was used to detect the metastasis ability of SKOV3 cell line after IGSF9 interference.t test,analysis of variance,and 2 test were applied.ResultsThe GEPIA database showed that the expression level of IGSF9 in EOC was 21.8 times that in normal tissue.The 5-year overall survival and progression-free survival of the patients with high IGSF9 expression were poor.The high expression rates of IGSF9 in the EOC tissue and normal ovarian tissue were 69.7%and 16.7%,respectively.The expression of IGSF9 protein was correlated with FIGO stage,peritoneal metastasis,and serum carbohydrate antigen(CA-125)level in the EOC patients.Interference with IGSF9 expression resulted in decreased metastatic ability of ovarian cancer cells.ConclusionsThe increased expression of IGSF9 in EOC is related to poor prognosis and poor clinicopathological characteristics of EOC patients.IGSF9 can promote the metastasis of ovarian cancer cells.IGSF9 may promote the progress of EOC,and has certain value for the diagnosis,treatment,and prognosis evaluation of EOC patients.【Key words】Epithelial ovarian cancer;IGSF9;Prognosis;Clinicopathological features;Tumor metastasisFund program:Project Supported by National Natural Science Foundation(82101727)卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，5 年生存率为48.6%1-2。卵巢癌中最常见的病理类型是上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC），占卵巢恶性肿瘤的85%90%，其中高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）是卵巢癌中最常见和具有侵袭性的亚型，占卵巢癌亚型的67.5%3。由于其发病早期无明显症状且易转移，多数患者诊断时已为晚期，预后不良4。标准化治疗是肿瘤细胞减灭术联合铂类加紫杉醇的化学治疗，然而，超过30%的EOC患者对铂或其他化疗药物耐药，导致疾病持续或复发5。免疫球蛋白超家族成员9（IGSF9）最早被克隆并被鉴定为免疫球蛋白超家族的一员，在人类和小鼠的多种组织中表达6-8。在多种肿瘤中，IGSF9出现表达变化：在黑色素瘤全基因组表达谱中，IGSF9在晚期黑色素瘤中表达约下调7倍9；但是，在胆囊癌中，IGSF9 表达明显升高，大约是正常胆囊组织的18 倍10。本研究拟结合数据库及 EOC 临床样本分析IGSF9在EOC患者中的表达及其临床意义，细胞实验分析IGSF9对卵巢癌细胞转移能力的影响，以期为EOC的诊治提供新思路。资料与方法1.临床资料选取2010年6月至2020年6月于滕州市中心人民医院妇科就诊的EOC患者原发病灶石蜡样本76例。纳入标准：EOC患者术前未接受任何化疗或其他抗肿瘤治疗；无其他身体部位肿瘤、盆腔炎症及卵巢相关疾病。收集同期具有完整上皮的正常卵巢组织石蜡标本30例（因子宫肌瘤等良性疾病行卵巢切除患者）作为对照组。EOC样本组患者年龄（59.621.58）岁，对照组患者年龄（58.342.76）岁，差异无统计学意义。组织样本的病理诊断均由滕州市中心人民医院的2位主治病理医生独立确认。患者相关的临床病例信息从滕州市中心人民医院病案室获得，组织样本收集告知患者并签署知情同意书。本研究经滕州市中心人民医院、上海复旦大学附属妇产科医院医学伦理委员会审核批准（kyy2021-126）。2.数据库资料使用基因表达谱数据动态分析（GEPIA）网站综合分析IGSF9 mRNA表达情况，该网站是由国人开发用于分析癌组织和正常组织基因表达谱差异的公共数据库，数据来源于TCGA 和 GTEx 的 RNA 测 序 表 达 数 据11。采 用Kaplan-Meier Plotter数据库（网址：http：/）分析IGSF9对卵巢癌患者生存期的影响。3.免疫组化石蜡切片免疫组织化学染色过程交由武汉谷歌生物科技有限公司代为完成，兔抗人IGSF9多克隆抗体购买于英国Abcam公司，货号ab121324，稀释比1 100，HRP-山羊抗兔/鼠通用二抗购买于丹麦DAKO公司，货号K5007，稀释比1 1。免疫组化染色结果分析由2位研究者独立完成，评分标准如下。染色强度评分（a）：无着色 0 分，淡黄色 1 分，深黄色2 分，黄褐色 3 分；根据阳性细胞占该视野面积评分（b）：1 分6 分为高表达。2269国际医药卫生导报 2023 年8 月第 29 卷第 16 期IMHGN,August 2023,Vol.29,No.164.细胞培养与转染卵巢癌细胞株SKOV3购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，培养于 McCoy 5A（Gibico，USA）培养基，根据 ATCC 细胞培养说明添加 10%的胎牛血清（Gibico，USA）和10%的青霉素、链霉素。将细胞置于培养箱（37，含5%CO2）培养。细胞转染：IGSF9干扰质粒慢病毒浓缩液购 买 于 山 东 维 真 生 物 科 技 公 司，质 粒 载 体 为 hRNA pAV-U6-GFP 载体克隆，干扰载体序列如下；shRNA1：GGTCGAGGGAAGCCT GAGGTGGT；shRNA2：AATGCCTCCCAGGATGTTTCATT；shRNA3：CCTGCGACCAT TGACCAAGGAGG；shRNA4：GGCAGCTTCGTCAGCGACCCCAG。待细胞密度达70%后，将细胞用胰酶消化传代，取处于对数生长状态的细胞进行实验。将细胞消化后均匀接种至6孔板，控制细胞密度为50%左右。待细胞过夜贴壁，更换培养基，加入shRNA慢病毒颗粒浓缩液进行细胞转染。培养48 h后培养基中加入嘌呤霉素清除未转染细胞，荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况，待阳性细胞占比达90%以上，收集一部分细胞用于抽提总RNA，qRT-PCR检测IGSF9 mRNA表达情况，挑选干扰效果最佳的IGSF9-shRNA2和IGSF9-shRNA3及shRNA NC阴性对照细胞进行后续实验。5.qRT-PCR检测IGSF9的表达TRIzol-酚-氯仿法从新鲜收集的细胞中提取总RNA。使用TaKaRa公司的mRNA逆转录试剂盒（货号：RR036A）配制逆转录体系，将 mRNA 反转录为 cDNA。反应条件：37 15 min（反转录反应），85 5 s（反转录酶的失活反应）。得到的RT反应液加入到下一步的qRT-PCR反应体系中，选择 TB Green Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（Code No.RR820A）进行qRT-PCR，根据操作手册配制反应体系，在 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System 仪器上进行 PCR。反应步骤一：预变性 95 30 s；步骤二：PCR 95 5 s，60 30 s，循环 40 次。以 GAPDH 为内参，2-CT计算IGSF9的相对表达量，其中CT值为循环阈值，实验 重 复 3 次。引 物 序 列 如 下：IGSF9 正 向 引 物5-GAAGCCTGAGGTGGTATCGG-3，反向引物5-CAGCCACTCGATGACATGC-3；GAPDH 正 向 引 物5-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3，反向引物5-ACACCA TGTATTCCGGGTCAAT-3。6.Transwell 小 室 检 测 干 扰IGSF9后卵巢癌细胞转移能力变化使用无血清培养基制备 IGSF9-shRNA2和IGSF9-shRNA3及shRNA NC 对照 3 组细胞的细胞悬液，使细胞浓度为2105个/ml，取0.2 ml细胞悬液加入 Transwell 小室的上室，下室加入 0.5 ml 含 10%胎牛血清的培养基，置于培养箱中孵育48 h，取出 Transwell 小室上室，棉签擦上室内的细胞，固定后结晶紫染色，显微镜下拍照计数，结果取平均值。7.统计学方法采用GraphPad 6.0软件进行统计学处理。计量资料经正态性检验符合正态分布，以（x s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，计数资料采用2检验。P0.05为差异有统计学意义。结果1.数据库分析IGSF9基因在卵巢癌和正常卵巢组织中的表达差异在GEPIA数据库中检索IGSF9在33种肿瘤中的表达水平，结果显示，IGSF9在卵巢癌等12种肿瘤中的表达明显高于正常组织，而在肝细胞癌、睾丸生殖细胞瘤中的表达明显低于正常组织，其中在卵巢癌中表达水平最高，且与正常组织相比差异最大，是正常组织的21.8倍（图1A）。匹配GTEx数据分析显示，IGSF9在卵巢癌组织中的表达高于正常对照，差异有统计学意义（P0.05）（图1B）。2.IGSF9表达与EOC患者预后的相关性使 用 Kaplan-Meier Plotter 网 站 分 析 IGSF9（Affy ID：229276_at）表达与EOC患者无进展生存期（PFS）和整体生存期（OS）的关系。PFS分析中满足条件的病例数有614例，其中高表达患者 461例，低表达患者 153例；Kaplan-Meier Plotter 结果显示，高表达患者死亡风险比 HR=1.90（1.492.43），logrank P=1.6e-07（图2A）。OS分析中满足条件的病例数为655例，其中高表达患者459例，低表达患者196例；Kaplan-Meier Plotter结果显示，高表达患者死亡风险比HR=1.30（1.041.64），log-rank P=0.023（图 2B）。PFS 与 OS 分析均提示高表达IGSF9为EOC患者预后不良的预测因子。3.免疫组化分析IGSF9在EOC组织样本中的表达免疫组化SP法显示，IGSF9的蛋白表达主要位于细胞膜及胞浆，在EOC组织中高表达，在正常卵巢组织上皮几乎不表达（图3A）。IGSF9在EOC组织和正常对照卵巢组织的高表达率分别是69.7%（53/76）和16.7%（5/30），差异有统计学意义（P0.01）（图3B）。4.IGSF9表达水平与EOC患者临床病例特征的关系注：IGSF9为免疫球蛋白超家族成员9图1基因表达谱数据动态分析数据库分析IGSF9基因的表达差异。A：IGSF9在人体正常组织和癌组织中表达差异；B：IGSF9在卵巢癌组织和正常对照组织中的表达情况BA 2270国际医药卫生导报 2023 年8 月第 29 卷第 16 期IMHGN,August 2023,Vol.29,No.16EOC患者组织样本中IGSF9的蛋白表达与EOC患者的FIGO分期、腹腔转移及血清CA-125水平有相关性（均P0.05），见表1。5.IGSF9-shRNA 对 SKOV3 细胞中 IGSF9 表达的抑制作用qRT-PCR 结 果 显 示，在 SKOV3 细 胞 中 转 染IGSF9-shRNA 后，将shRNA-NC组的IGSF9 mRNA表达水平 设 为 1.000，shRNA14 组 的 IGSF9 mRNA 表 达 水 平分 别 为（0.3200.086）、（0.2500.045）、（0.1900.075）、（0.3500.056），均明显低于对照组，差异均有统计学意义（均 P0.05），选 取 shRNA-NC 组、IGSF9-shRNA2 组 和IGSF9-shRNA3组细胞用于后续实验。6.IGSF9对卵巢癌SKOV3细胞转移能力的影响Transwell 小 室 实 验 提 示，IGSF9-shRNA-2 组、IGSF9-shRNA-3组和shRNA-NC组卵巢癌细胞的每高倍镜视野的平均穿膜细胞数分别为（64.6002.993）、（202.2008.919）和（69.6006.369）；IGSF9干扰组细胞的转移能力明显降低，差异有统计学意义（P0.05）。见图4。讨论卵巢癌是发生于卵巢的恶性肿瘤，其发病率仅次于子宫内膜癌和宫颈癌，病死率却居女性生殖恶性肿瘤首位12。卵巢上皮性肿瘤是一种常见的卵巢肿瘤，发病隐匿，多数患者确诊时已为中晚期，严重影响患者的生存质量13。早期患者通过手术联合以铂类为基础的化疗可以治愈，但大多数晚期患者会出现复发、对化疗耐药、疾病无进展间隔期逐渐缩短，但是对于铂类药物具有较好反应的患者，可以通过化疗控制病情，使卵巢癌成为一种慢性疾病，改善预后14。因此，寻找更好的卵巢癌治疗相关的基因靶点对于改善卵巢癌患者的治疗和预后具有重要的意义。IGSF9属于免疫球蛋白超家族成员之一，隶属于细胞黏附分子（cell adhesion molecules，CAMs）大家族。CAMs介导细胞间的相互作用和细胞与细胞外基质之间的相互作用，也可通过与其他细胞表面受体或细胞内信号分子的相互作用来调节细胞内信号转导15。因此，CAMs参与各种生物学和病理过程，包括细胞的存活、增殖、分化、迁移、器官发生、血管生成和炎症等16-18。研究表明，IGSF9在癫痫易感性中表1 IGSF9表达与76例EOC患者临床病例特征之间的相关性观察指标年龄55岁55岁血糖类抗原12535 kU/L35 kU/L腹水量100 ml100 ml腹腔转移无有FIGO分期期期组织类型高级别浆液性其他类型肿瘤长径10 cm10 cm例数3442205630462650166054223937低表达252810431736114274639142924高表达914101313101589141581013P值0.618 40.044 90.072 70.000 40.015 80.582 90.456 2注：IGSF9为免疫球蛋白超家族成员9，EOC为上皮性卵巢癌注：IGSF9为免疫球蛋白超家族成员9，EOC为上皮性卵巢癌图3免疫组化SP法分析IGSF9在EOC组织和正常组织中的表达。A：IGSF9在正常卵巢组织呈阴性表达，在EOC组织中呈阳性表达（200）；B：IGSF9在EOC组织和正常对照卵巢组织的高表达率注：IGSF9为免疫球蛋白超家族成员 9，EOC为上皮性卵巢癌，PFS为无进展生存期，OS为整体生存期图2IGSF9表达与EOC患者预后的相关性。A：IGSF9与EOC患者PFS之间的关系；B：IGSF9与EOC患者OS之间的关系注：IGSF9为免疫球蛋白超家族成员9图4IGSF9对卵巢癌SKOV3细胞株转移能力的影响BABA 2271国际医药卫生导报 2023 年8 月第 29 卷第 16 期IMHGN,August 2023,Vol.29,No.16起作用，是引起癫痫易感性变化的候选基因之一。根据IGSF9的表达谱和外显子单核苷酸多态性可导致氨基酸替换，相对不易患癫痫的B6小鼠和对癫痫易感的D2小鼠的IGSF9之间的差异在于IgIV中第411位的谷氨酰胺替换为精氨酸和细胞质尾部871位的脯氨酸替换为丝氨酸19。在不同的肿瘤中，IGSF9有表达差异。Shi等20研究表明，在子宫内膜癌中，IGSF9的表达水平显著高于正常腺细胞，且高表达与患者预后不良有关，但是在黑色素瘤中表达降低8。不同类型癌症中IGSF9家族蛋白的上调和下调对癌症的进展是否有抑制或促进作用仍有待确定。本研究通过数据库分析发现，IGSF9在EOC组织中的表达高于正常对照组织；进一步EOC组织样本免疫组化数据表明，IGSF9蛋白在EOC组织中高表达，在正常卵巢组织上皮几乎不表达，并且高表达与EOC患者较差FIGO分期、腹腔转移及血清CA-125水平升高有相关性；Kaplan-Meier Plotter网站关于PFS与OS的分析提示，高表达IGSF9为卵巢癌患者预后不良的预测因子；干扰IGSF9后细胞转移能力明显减弱。以上数据均表明，IGSF9可能为EOC患者的促癌因素。综上所述，在EOC患者的组织样本中IGSF9表达升高，高表达的IGSF9提示EOC患者倾向于具有较差的临床病理特征及较差的预后，并且可能促进EOC患者的肿瘤转移。本研究结果提示，IGSF9在卵巢癌的发生发展中具有促进作用，能否成为卵巢癌相关的治疗靶点，仍有待进一步研究。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突参考文献1Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2020 J.CA Cancer J Clin,2020,70(1):7-30.DOI:10.3322/caac.21590.2Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015 J.CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.DOI:10.3322/caac.21338.3Sung H,Ferlay J,Siegel RL,et al.Global cancer statistics 2020:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries J.CA Cancer J Clin,2021,71(3):209-249.DOI:10.3322/caac.21660.4Baci D,Bosi A,Gallazzi M,et al.The ovarian cancer tumor immune microenvironment(TIME)as target for therapy:a focus on innate immunity cells as therapeutic effectors J.Int J Mol Sci,2020,21(9):3125.DOI:10.3390/ijms21093125.5Jayson GC,Kohn EC,Kitchener HC,et al.Ovarian cancer 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