miR-3133通过靶向HAS2促进人脐静脉内皮细胞自噬抑制血管生成对布加综合征的影响.pdf

第5 2卷第4期第5 0 3页2 0 2 3年8月 华中科技大学学报(医学版)A c t aM e dU n i vS c iT e c h n o lH u a z h o n g V o l.5 2 N o.4 P.5 0 3A u g.2 0 2 3*国家自然科学基金资助项目(N o.8 2 1 7 3 4 7 5);江苏省“青蓝计划”资助项目(N o.2 0 1 93)张兴海,男,1 9 9 4年生,硕士研究生,E-m a i l:1 3 7 7 6 5 8 3 7 4 41 6 3.c o m通讯作者,C o r r e s p o n d i n ga u t h o r,E-m a i l:g x s u n n y x z h m u.e d u.c nm i R-3 1 3 3通过靶向HA S 2促进人脐静脉内皮细胞自噬抑制血管生成对布加综合征的影响*张兴海,庄 玉,姜 敏,陈颜夙,孙桂香徐州医科大学公共卫生学院,徐州 2 2 1 0 0 4摘要:目的 探索m i R-3 1 3 3通过靶向透明质酸合成酶2(HA S 2)促进细胞自噬,抑制血管生成,从而影响布加综合征中隔膜形成的作用,为布加综合征的病因研究提供新的线索,寻求潜在的治疗方法。方法 利用透射电镜观察人脐静脉内皮细胞(HUV E C s)内自噬小体的数量,使用细胞自噬染色检测试剂盒,通过MD C法对细胞进行荧光染色,在荧光显微镜下观察自噬性死亡的细胞数量。通过W e s t e r nb l o t实验检测自噬标志蛋白p 6 2和L C 3的表达改变,从而验证m i R-3 1 3 3促进自噬的作用。通过C C K-8实验检测细胞的增殖能力变化,管状形成实验检测细胞形成管道能力的变化,从而验证m i R-3 1 3 3通过促进自噬抑制血管生成。利用生物信息学软件m i R a n d a进行预测,找到有可能成为m i R-3 1 3 3靶向调控对象的下游基因。转染m i R-3 1 3 3后使用W e s t e r nb l o t检测HA S 2的蛋白表达改变,从而验证m i R-3 1 3 3能够靶向负调控HA S 2。在使用小干扰R NA后,检测HUV E C s的增殖能力和血管形成能力变化以及自噬标志蛋白表达的改变,从而验证m i R-3 1 3 3是通过靶向HA S 2促进自噬抑制血管形成。结果 透射电镜结果显示转染m i R-3 1 3 3m i m i c的细胞比其阴性对照具有更多的自噬体。在荧光显微镜下m i m i c组中出现更多的MD C染色;与对照组相比,在i n h i b i-t o r组中观察到相对较少的MD C染色。C C K-8实验表明,m i R-3 1 3 3m i m i c减弱了HUV E C s的增殖,而m i R-3 1 3 3 i n h i b i-t o r促进了HUV E C s的增殖。与各对照组相比,m i R-3 1 3 3m i m i c组p 6 2蛋白表达显著下调,而m i R-3 1 3 3i n h i b i t o r组表达增加,m i m i c组L C 3-/L C 3-比值增加,而i n h i b i t o r组降低。W e s t e r nb l o t结果显示,与各自的对照组相比,m i R-3 1 3 3m i m i c组中的HA S 2表达受到抑制,而m i R-3 1 3 3 i n h i b i t o r组中的表达上调。然而,m i R-3 1 3 3未能在m R NA水平上显著调节HA S 2的表达。HUV E C s敲除HA S 2后,p 6 2蛋白表达明显降低,L C 3-/L C 3-比值升高。与阴性对照组相比,HA S 2敲除组的HUV E C s细胞增殖率和血管形成率显著降低。结论 m i R-3 1 3 3可以通过靶向HA S 2的表达,促进细胞自噬抑制血管生成,进而参与影响布加综合征。关键词:布加综合征;m i R-3 1 3 3;人脐静脉内皮细胞;自噬;血管形成中图分类号:R 6 5 7.3 4;Q 7 4 D O I:1 0.3 8 7 0/j.i s s n.1 6 7 2-0 7 4 1.2 0 2 3.0 4.0 1 1m i R-3 1 3 3P r o m o t e sA u t o p h a g yI n h i b i t i o no fA n g i o g e n e s i s i nH U V E C sb yT a r g e t i n gH A S 2a n dA f f e c t sB u d d-C h i a r i S y n d r o m eZ h a n gX i n g h a i,Z h u a n gY u,J i a n gM i ne t a lS c h o o l o fP u b l i cH e a l t h,X u z h o uM e d i c a lU n i v e r s i t y,X u z h o u 2 2 1 0 0 4,C h i n aA b s t r a c t O b j e c t i v e T oe x p l o r e t h a tm i R-3 1 3 3a f f e c t s s e p t u mf o r m a t i o n i nB u d d-C h i a r i s y n d r o m eb y t a r g e t i n gh y a l u r o n i ca c i ds y n t h a s e2(HA S 2)t op r o m o t ea u t o p h a g ya n di n h i b i ta n g i o g e n e s i s.T op r o v i d en e wc l u e sf o rt h es t u d yo ft h ee t i o l o g yo fB u d d-C h i a r i s y n d r o m e a n d t os e e kp o t e n t i a l t r e a t m e n t o p t i o n s.M e t h o d s T r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p yw a su s e d t oo b s e r v et h en u m b e ro f a u t o p h a g o s o m e si nh u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a l c e l l s(HUV E C s).T h ea u t o p h a g ys t a i n i n gk i tw a su s e dt op e r f o r mf l u o r e s c e n c es t a i n i n g.MD Cm e t h o dw a su s e dt oo b s e r v e t h en u m b e ro fc e l l su n d e r g o i n ga u t o p h a g i cc e l ld e a t hu n d e raf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e.W e s t e r nb l o tw a su s e dt od e t e c t c h a n g e s i nt h ee x p r e s s i o no fp 6 2a n dL C 3,t w oa u t o p h a g i cm a r k e r s,i no r d e r t ov e r i f yt h a tm i R-3 1 3 3c o u l dp r o m o t ea u t o p h a g y.C C K-8a s s a yw a su s e dt ot e s tc e l lp r o l i f e r a t i o n,t u b ef o r m a t i o na s s a yw a su s e d t o t e s t t h e f o r m a t i o no f c a p i l l a r y-l i k e s t r u c t u r e sb y t h e c e l l s t ov e r i f y t h a tm i R-3 1 3 3c o u l d i n h i b i t a n g i o g e n e s i sb yp r o-m o t i n ga u t o p h a g y.m i R NAt a r g e tp r e d i c t i o ns o f t w a r em i R a n d aw a su s e dt op r e d i c td o w n s t r e a mg e n e st h a t c o u l db ep o t e n t i a l l yr e g u l a t e db ym i R-3 1 3 3,a n d t h e e x p r e s s i o no fHA S 2p r o t e i nw a sd e t e c t e db yW e s t e r nb l o t t i n ga f t e r t r a n s f e c t i o nw i t hm i R-3 1 3 3,c o n f i r m i n gt h a tm i R-3 1 3 3c o u l dn e g a t i v e l yr e g u l a t eHA S 2.M o r e o v e r,a f t e rk n o c k i n go u tHA S 2w i t hs i R NA,c h a n g e si nc e l lp r o l i f e r a t i o n,t u b e f o r m a t i o n,a n de x p r e s s i o no fa u t o p h a g ym a r k e r sw e r ed e t e c t e dt ov e r i f yt h a tm i R-3 1 3 3p r o m o t e sa u t o p h a g ya n di n h i b i t sa n g i o g e n e s i sb yt a r g e t i n gHA S 2.R e s u l t s T r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p yr e s u l t ss h o w e dt h a tc e l l st r a n s f e c t e dw i t ht h em i R-3 1 3 3m i m i cg r o u ph a dm o r e a u t o p h a g o s o m e s t h a n t h e i r n e g a t i v e c o n t r o l s.F l u o r e s c e n c e s t a i n i n gw i t hMD Cm e t h o ds h o w e dt h a t t h em i m i cg r o u ph a dm o r eMD Cs t a i n i n gc o m p a r e dt ot h ec o n t r o lg r o u p,w h i l et h ei n h i b i t o rg r o u ph a dr e l a t i v e l yl e s sMD Cs t a i n i n g.C C K-8a s s a ys h o w e dt h a tm i R-3 1 3 3 m i m i c sw e a k e n e d HUV E C sp r o l i f e r a t i o n,w h i l em i R-3 1 3 3i n h i b i t o r sp r o m o t e d i t.W e s t e r nb l o ts h o w e dt h a tc o m p a r e dt ot h e i rr e s p e c t i v ec o n t r o lg r o u p s,p 6 2p r o t e i ne x p r e s s i o nw a ss i g n i f i c a n t l yd o w n r e g u l a t e d i nt h em i R-3 1 3 3m i m i cg r o u pw h i l eu p r e g u l a t e di nt h em i R-3 1 3 3i n h i b i t o rg r o u p;t h er a t i oo fL C 3-/L C 3-w a s i n c r e a s e d i n t h em i m i cg r o u pa n dd e c r e a s e d i n t h e i n h i b i t o r g r o u p.W e s t e r nb l o t r e s u l t s s h o w e d t h a tHA S 2e x p r e s s i o n i n t h em i R-3 1 3 3m i m i cg r o u pw a s i n h i b i t e d,w h i l eHA S 2e x p r e s s i o n i nt h em i R-3 1 3 3 i n h i b i t o rg r o u pw a su p r e g u l a t e d.H o w e v e r,m i R-3 1 3 3c o u l dn o t s i g n i f i c a n t l yr e g u l a t eHA S 2e x p r e s s i o na t t h em R NAl e v e l.A f t e rk n o c k i n go u tHA S 2i nHUV E C s,t h ee x p r e s-s i o no fp 6 2p r o t e i nw a s s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d,a n d t h e r a t i oo fL C 3-/L C 3-w a s i n c r e a s e d.C o m p a r e dw i t h t h en e g a t i v e c o n-t r o l g r o u p,t h ec e l lp r o l i f e r a t i o nr a t ea n da n g i o g e n e s i sr a t eo fHUV E C si nt h eHA S 2k n o c k o u tg r o u pw e r es i g n i f i c a n t l yd e-c r e a s e d.C o n c l u s i o n m i R-3 1 3 3c a np r o m o t ea u t o p h a g ya n d i n h i b i t a n g i o g e n e s i sb yt a r g e t i n gt h ee x p r e s s i o no fHA S 2,t h u sp a r-t i c i p a t i n g i nt h e i n f l u e n c eo fB u d d-C h i a r i s y n d r o m e.K e yw o r d s B u d d-C h i a r i s y n d r o m e;m i c r o R N A-3 1 3 3;h u m a nu m b i l i c a l v e i ne n d o t h e l i a l c e l l;a u t o p h a g y;a n g i o g e n e s i s 布加综合征(B u d d-C h i a r i s y n d r o m e,B C S)是一种由多种原因引起的肝静脉-下腔静脉血液回流障碍1-2,其特征是经常在病变区域形成新生的隔膜组织。在课题组针对B C S的前期研究中发现,m i R-3 1 3 3和血管形成在布加综合征的隔膜形成中发挥重要作用。同时有研究发现,透明质 酸合成酶2(HA S 2)对于血管形成具有促进作用,而自噬性细胞死亡可能在一定程度上抑制血管的生成。本研 究 的 目 的 是 探 索m i R-3 1 3 3是 否 靶 向HA S 2促进细胞自噬,抑制血管形成,从而影响布加综合征中的隔膜形成。以期更深入地理解布加综合征隔膜形成的过程,为布加综合征的病因研究提供新的线索,寻求潜在的治疗方案。1 材料和方法1.1 实验材料与试剂本研究采用的人脐静脉内皮细胞(HUV E C s)购自上海细胞生物研究所,货号:GN h u 3 9。用于细胞培养的1 0%胎牛血清和R PM I-1 6 4 0培养液分别购自北京索莱宝科技有限公司和江苏凯基生物技术股份有限公司,细胞转染过程所用质粒购自广州锐博生物,H i l y M a x阳离子脂质体转染试剂(同仁化学研究所,日本),MD C法荧光染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司,在细胞增殖-毒性实验中所用试剂盒来自徐州微科曼得生物工程有限公司,血管生成实验中 所用基质胶(康宁 公 司,美 国),进 行mR NA逆转录的F i r s tS t r a n dc D NA合成试剂盒(赛默飞世尔科技,美国)。购买北京索莱宝科技有限公司的R I P A细胞裂解液和B C A蛋白质检测试剂盒进行提取和测量蛋白质浓度实验。在W e s t e r nb l o t实验中使用的一抗主要有:a n t i-HA S 2(货号:b s-1 1 2 9 0 R,博奥森生物科技有限公司,北京),a n t i-L C 3(货号:1 4 6 0 0-1-A P,P r o t e i n t e c h公司,美 国),a n t i-p 6 2(货 号:A P 6 0 0 6,B i o w o r l d公 司,美 国),GA P DH(货号:A P 0 0 6 3,B i o w o r l d公司,美国)。采用山羊抗兔I g G二抗(货号:B D 0 0 4 9,B i o w o r l d公司,美国)。本研究使用的L a B 6透射电镜(F E I公司,美国)来自徐州医科大学公共实验室平台。1.2 细胞培养正常的HUV E C s使用含有1 0%胎牛血清的R PM I-1 6 4 0培养液进行培养,放置在3 7、5%二氧化碳培养箱中。1.3 细胞转染m i R-3 1 3 3模拟物、抑制剂及其各自的阴性对照(N C s)为了抑制HA S 2的表达,本研究设计了小干扰R NA(s i-R NA),其 中s i-HA S 2设 计 序 列 为5 -GA C GAAG T G T G GAT T AT G T-3。参 照 说 明 书进行细胞转染,即将HU V E C s在1 2孔板中以1.21 05个细胞/孔和1m L新鲜培养液培养2 4h并达到6 0%7 0%汇合度时,使用H i l y m a x试剂将m i R-3 1 3 3模拟物、抑制剂或s i-HA S 2瞬时转染至细胞。1.4 透射电子显微镜观察将消化后的细胞移至新的E P管内,1 5 0 0r/m i n,1 0m i n,弃去上清,在固定液中固定1h,置于4冰箱中储存,使其逐渐脱水并过夜。然后使用超薄切片机制备样品并通过透射电子显微镜观察细胞内自噬囊泡等微观结构。1.5 细胞自噬染色检测(MD C法)当细胞覆盖到培养皿底部的3 0%4 0%时,进行细胞转染。等待细胞覆盖6 0%时,按MD C法荧光染色试剂盒的说明书,配制洗涤缓冲溶液。每孔中加入1m L的洗涤缓冲溶液洗涤2次,吸弃废液后每孔加入1 0 0LMD C染料对细胞内的酸性物质进行染色,保证细胞培养板保存在避光盒子内,染色3 0m i n。吸弃MD C染色液,再次用洗涤缓冲溶液洗涤细胞3次确保没有染色液残留,最后滴加1 0 0L收集溶液保护缓冲液,置于荧光显微镜下进行观察。1.6 细胞增殖-毒性实验检测(C C K-8)收集5 1 03个细胞并重悬,接种到含有1 0 0L新鲜培养液的9 6孔板中,等待4 8h后,向每孔加入1 0L405华中科技大学学报(医学版)2 0 2 3年8月第5 2卷第4期C C K-8溶液,再培养2h,用酶标仪测量4 5 0n m处的吸光度(A)值,通过得到的A值比较细胞增殖能力。1.7 血管生成实验使用预冷的9 6孔板和吸头,在每个孔中加入5 0L基质胶,在3 7的培养箱中孵育3 0m i n后,加入1 0 0L含有1.51 05个细胞的培养液,在培养箱中继续培养4h,在显微镜下(4 0)观察细胞形成管腔的情况,并用I m a g eJ软件进行分析。1.8 q R T-P C R检测转染后基因的m R N A表达用T r i z o l试 剂 提 取 细 胞 总R NA,用F i r s tS t r a n dc D NA合成试剂盒进行逆转录,将制备的c D NA和所需试剂按所需比例加入反应管中,根据说明书,在A B I 7 5 0 0实时P C R仪器中进行反转录-定量P C R检测。其中U 6被用作m i R-3 1 3 3的内部对照,GA P DH被用作HA S 2的内部对照。实验所用的引物序列见表1。表1 P C R引物序列T a b l e1 T h ep r i m e r s e q u e n c e so fP C R基因引物链 引物序列m i R-3 1 3 3F o r w a r d5 -C G C G C G T AAA GAA C T C T T AAAA-3 R e v e r s e5 -A G T G C A G G G T C C GA G G T A T T-3 HA S 2F o r w a r d5 -GA C C AA GA G C T GAA C AA GA T G C-3 R e v e r s e5 -G G T G T GA T G C C AAAAAG G C A-3 GA P DHF o r w a r d5 -G C C G G T G C T GA G T A T G T C-3 R e v e r s e5 -C T T C T G G G T G G C AG T GA T-3 U 6F o r w a r d5 -C T C G C T T C G G C A G C A C A-3 R e v e r s e5 -AA C G C T T C A C GAA T T T G C G T-3 1.9 蛋白免疫印记分析(W e s t e r nb l o t实验)使用含有1%PM S F的R I P A细胞裂解液收集细胞,根据说明书使用B C A蛋白质检测试剂盒测量蛋白 质 浓 度,上 样 量 保 持 一 致,通 过1 0%S D S-P AG E电泳分离,然后转移到P V D F膜,用5%浓度的脱脂牛奶封闭液在室温下封闭2h。裁剪目的条带,在一抗稀释液中,4孵育过夜。使用的一抗包括:a n t i-HA S 2,a n t i-L C 3和a n t i-p 6 2。所有蛋白条带的内部对照是GA P DH。用T B S T洗膜5次后,山羊抗兔I g G二抗在室温下孵育1h,用超敏E C L化学发光底物(B o s t e r)可视化,结果使用I m a g eL a b5.2.1软件进行分析。1.1 0 统计学方法为保证本研究的重复性和可靠性,所有有效实验至少重复3次。图片和蛋白灰度条带分别采用P h o t o s h o p、I m a g e J和I m a g eL a b软件处理,各类统计图经G r a p h p a dP r i s m5作图软件制作完成。应用S P S S2 2.0软件对实验数据进行统计学分析处理,在满足正态性和方差齐性的条件下以均数标准差(xs)的形式描述,组间均数比较采用t检验或方差分析,多组间均数比较采用D u n n e t t st检验,以P0.0 5表示差异有统计学意义。2 结果2.1 m i R-3 1 3 3促进细胞自噬并抑制血管生成将m i R NA-3 1 3 3的m i m i c、i n h i b i t o r以及他们的阴性对照转染至体外培养的HUV E C s细胞,2 4h后通过q R T-P C R检测m i R-3 1 3 3的表达水平,结果表明,m i R-3 1 3 3m i m i c显著提高m i R-3 1 3 3的表达,而m i R-3 1 3 3 i n h i b i t o r有效降低了细胞内m i R-3 1 3 3的表达水平(图1 A)。通过透射电镜观察细胞内的结构,结果表明,转染m i R-3 1 3 3m i m i c的细胞出现更多的自噬体。图中红圈所示即为自噬体,特征为双层膜结构,动物细胞内出现的双层膜结构可以确定为自噬溶酶体,从图中可以明显看到m i R-3 1 3 3m i m i c组中出现自噬溶酶体的数量高于其阴性对照组(图1 B)。在转染m i R-3 1 3 3的m i m i c、i n h i b i t o r及其阴性对照后,使用MD C法细胞自噬染色检测试剂对细胞进行荧光染色。MD C是一种特殊的嗜酸性的荧光染色剂,在检测细胞内自噬水平时通常被当做特异性标记染色剂使用。由于自噬导致的细胞死亡,在镜下会表现出染色质浓缩,细胞核碎裂成点状,被染成大小不一、致密浓染的绿色颗粒。实验结果表明,与各自的阴性对照组相比,m i m i c组出现更多的绿色荧光标记,表明细胞自噬水平相对更高,而i n h i b i t o r组可观察到的绿色荧光标记相对较少(图1 C)。正常转染m i R-3 1 3 3的m i m i c、i n h i b i t o r和其阴性对照,转入9 6孔板培养2 4h后,加入C C K-8试剂,注意全程避光,培养箱孵育2h后通过酶标仪测定4 5 0n m波长处各组的吸光度值并计算各组的细胞增殖率。实验表明,m i R-3 1 3 3m i m i c组的细胞增殖率低于其阴性对照,而m i R-3 1 3 3i n h i b i t o r组的细胞增殖率明显高于其阴性对照。说明m i R-3 1 3 3m i m i c减弱了HUV E C s的增殖,而m i R-3 1 3 3i n-h i b i t o r促进了这一过程(图1 D)。505张兴海等.m i R-3 1 3 3通过靶向HA S 2促进人脐静脉内皮细胞自噬抑制血管生成对布加综合征的影响A:q R T-P C R显示转染m i R-3 1 3 3模拟物、抑制剂及其阴性对照的HUV E C s中m i R-3 1 3 3的表达水平;B:透射电镜下转染m i R-3 1 3 3m i m i c及其阴性对照后细胞内自噬体数量的观察(标尺=1m,5 0 0n m);C:自噬染色检测试剂盒(MD C法)观察细胞中不同程度的自噬(标尺=1 0 0m);D:转染m i R-3 1 3 3模拟物、抑制剂及其阴性对照的HUV E C s细胞增殖实验;*P0.0 1图1 m i R-3 1 3 3促进自噬和血管生成F i g.1T h er e g u l a t i o no fm i R-3 1 3 3o nt h e l e v e l o f a u t o p h a g ya n da n g i o g e n e s i s p 6 2和L C 3蛋白通常用作确定自噬的标记蛋白,本研究使用p 6 2蛋白的表达量来侧面反映细胞内自噬水平的高低。而自噬小体中L C 3-蛋白在细胞内的表达量与细胞自噬的程度成正比。通过计算L C 3-/L C 3-比值可以用来对比自噬水平的高低。在细胞内转染m i R-3 1 3 3的m i m i c、i n h i b i t o r和其阴性对照后,通过W e s t e r nb l o t实验分别检测HUV E C s中p 6 2和L C 3蛋白的表达,实验结果表明,m i R-3 1 3 3m i m i c组的自噬水平显著提高。相较于其阴性对照组,p 6 2蛋白的表达明显下调,L C 3-/L C 3-的比值增加,而m i R-3 1 3 3i n h i b i t o r组中p 6 2和L C 3蛋白呈现相反的趋势,充分说明m i R-3 1 3 3提高细胞的自噬水平(图2 A、2 B)。3-甲基腺嘌呤(3-MA)是最为经典也是主流常用的自噬抑制剂,主要功能是针对细胞内自噬小体的形成 和 发 展 过 程 进 行 抑 制。使 用3-MA替 换m i R-3 1 3 3的i n h i b i t o r,来再次检测m i R-3 1 3 3促进细胞自噬的作用,试验结果表明,在同时添加3-MA和m i R-3 1 3 3m i m i c后,原本高表达的p 6 2蛋白得到了下调,被抑制转化的L C 3蛋白也得到了重新激活,再次证明m i R-3 1 3 3对于细胞自噬的促进作用(图2 C、2 D)。A,C:W e s t e r nb l o t显示转染m i R-3 1 3 3模拟物、抑制剂及其阴性对照以及自噬抑制剂3-MA(5mm o l/L)HUV E C s中p 6 2和L C 3的表达水平;B,D:W e s t e r nb l o t统计分析结果;*P0.0 5,*P0.0 1图2 m i R-3 1 3 3对p 6 2和L C 3蛋白水平的调控F i g.2R e g u l a t i o no f c e l l u l a ra u t o p h a g y l e v e l sb ym i R-3 1 3 3605华中科技大学学报(医学版)2 0 2 3年8月第5 2卷第4期2.2 m i R-3 1 3 3靶向调控H A S 2的表达进一步探索m i R-3 1 3 3通过调节细胞自噬影响血管 形 成 的 具 体 通 路,使 用 生 物 信 息 学 软 件m i R a n d a预测m i R-3 1 3 3可能的下游靶基因,根据得到的热力学稳定性指标(m i r S VRs c o r e)和保守性指 标(P h a s t C o n ss c o r e)两 个 指 标,将m i r S VRs c o r e分值 小 于 等 于-0.1且P h a s t C o n ss c o r e分值大 于 等 于0的 基 因 纳 入 筛 选 标 准,m i r S VRs c o r e分值 越 低 表 明m i R NA-mR NA结 合 稳 定 性越强,P h a s t C o n ss c o r e分值越大表明基因非翻译区在各物 种 中 进 化 保 守 性 越 大 且 越 好,为m i R-NA靶基因的可能性越大。根据两个指标综合评定,推测HA S 2(m i r S VRs c o r e=-0.6 0 2 0,P h a s t-C o n ss c o r e=0.5 0 2 2)可能为m i R-3 1 3 3的下游靶基因(图3 A)。HUV E C s中转染m i R-3 1 3 3的m i m i c、i n h i b i t o r和其阴性对照,使用W e s t e r nb l o t实验分别检测不同组HUV E C s中HA S 2蛋白的表达,实验结果表明,m i R-3 1 3 3m i m i c组中HA S 2蛋白的表达相较于其阴性对照组明显下调,而m i R-3 1 3 3i n h i b i t o r组中HA S 2蛋白呈现相反的趋势,这证明HA S 2为m i R-3 1 3 3的靶基因。而q R T-P C R实验表明mR-NA水平上HA S 2并未在不同组间表现出差异表达,这说明m i R-3 1 3 3通过与HA S 2的mR NA不完全互补的方式结合,阻止其mR NA的翻译过程,而不影响mR NA的稳定(图3 B3 D)。2.3 m i R-3 1 3 3通过靶向H A S 2促进细胞自噬抑制血管生成设计 小 干 扰R NA(s i-HA S 2)来 抑 制 细 胞 内HA S 2的表达,通过转染s i-HA S 2及其阴性对照,检测m i R-3 1 3 3通过HA S 2对于细胞血管形成能力的影响。按实验设计进行血管生成试验,显微镜下观察不同组细胞成管情况,并统计形成的管腔数目,对不同组别的数据进行统计学分析。结果表明,敲低HA S 2可以明显抑制HUV E C s的血管生成能力。C C K-8实验表明,与其阴性对照相比,转染s i-HA S 2后有效减弱了HUV E C s的增殖能力,以上结果表明m i R-3 1 3 3通过HA S 2来调控细胞的血管形成和增殖能力(图3 E3 G)。在细胞内转染s i-HA S 2及其阴性对照,另设有空白对照组。通过W e s t e r nb l o t实验分别检测不同组HUV E C s中HA S 2、p 6 2、L C 3蛋白的表达,实验结果表明,转染s i-HA S 2后细胞内HA S 2蛋白的表达被抑制,证明s i-HA S 2成功干扰细胞内HA S 2的表达。同时p 6 2蛋白表达降低,L C 3-/L C 3-的比值明显升高,高于阴性对照和空白对照组,这证明在细胞内干扰HA S 2的表达后,自噬水平反而得到了提高,同时验证m i R-3 1 3 3通过HA S 2来调控细胞内的自噬水平(图3 H3 I)。为进一步探索m i R-3 1 3 3、HA S 2和 自 噬 在 血 管 生 成 中 的 作 用,设 计m i R-3 1 3 3 i n h i b i t o r和s i-HA S 2联合使用,同时正常转染i n h i b i t o r、s i-HA S 2以及他们的阴性对照。血管形成实验结果表明,m i R-3 1 3 3i n h i b i t o r组明显形成最多的管腔,s i-HA S 2组形成的管腔数最少。而在加入s i-HA S 2和m i R-3 1 3 3i n h i b i t o r联用后,由m i R-3 1 3 3 i n h i b i t o r促进的血管生成能力得到了有效抑制(图4 A、4 B)。此外,细胞增殖率显示出与其相同的趋势(图4 C),这进一步证明m i R-3 1 3 3通过HA S 2来调控细胞的血管形成和增殖能力。继续将m i R-3 1 3 3 i n h i b i t o r和s i-HA S 2联用,通过W e s t e r nb l o t实验分别检测HUV E C s中p 6 2、L C 3蛋白的表达(图4 D)。W e s t e r nb l o t实验结果表明,在血管生成能力被抑制的同时,自噬水平得到提高(图4 E、4 F)。上述结果证明m i R-3 1 3 3通过靶向HA S 2促进细