miR-223对高糖环境培养的视网膜微血管内皮细胞NLRP3_IL-1β通路的调控作用.pdf

对高糖环境培养的视网膜微血管内皮细胞/通路的调控作用董雪松刘 丹宿星杰张 剑齐艳秀(佳木斯大学附属第一医院眼科黑龙江 佳木斯)摘要:目的:探讨 介导调控糖尿病性视网膜病变炎症反应的作用与机制 方法:分别将 、及 通过 转染高糖培养的人视网膜微血管内皮细胞()将 分为 组:对照组、模型组(高糖)、阴性组(高糖)、组(高糖)、抑制组(组 高糖)转染后除对照组用正常培养基培养外其余 组用高糖(葡萄糖)培养基培养 采用荧光定量 检测 、表达水平 采用酶联免疫吸附法检测细胞上清液 和 水平 采用蛋白印迹法检测各组、和 的蛋白水平 结果:转染了 的 组 水平明显高于未转染 的模型组、对照组以及 阴性组和 抑制组(.)蛋白印迹法检测 组、表达水平低于模型组、阴性组和 抑制组(.)酶联免疫吸附法检测 组 细胞上清液中 、低于模型组、阴性组和 抑制组(.)结论:可抑制高糖诱导的 细胞/通路激活延缓糖尿病视网膜病变()的发生关键词:人视网膜微血管内皮细胞/通路中图分类号:.文献标识码:文章编号:()糖尿病视网膜病变()是一种由糖尿病引发的视网膜微血管损害性病变是严重影响视力甚至致盲的慢性进行性疾病是导致 岁以上人群致盲眼病的因素之一 多数学者认为其发病与糖代谢、血液、生长激素、神经退行性变、免疫和慢性炎症等多种因素相关 根据微血管变性和缺血损害程度糖尿病视网膜病变()可分为增殖性()和非增殖性()增殖性()的主要病理特征表现为血管生成和玻璃体视网膜表面纤维化其机制是巨噬细胞导致的炎症和血管损伤 炎性小体是固有免疫的重要效应分子由细胞内模式识别受体()、衔接蛋白和 酶组成它们可以促进 和 促炎性因子释放 目前研究较多的是核苷酸结合寡糖化结构域样受体蛋白()炎性小体 既往研究显示 异常激活与痛风、动脉粥样硬化、年龄相关性黄斑变性、阿尔茨海默病、肥胖等疾病密切相关 研究显示早期糖尿病大鼠视网膜中发现高表达、和 沉默 表达后视网膜血管通透性降低 微小()是一种长度约 个核苷酸的小非编码 通过与编码蛋白()上碱基互补配对在转录后水平上调控基因的表达 既往研究显示 可通过调节人血管平滑肌细胞 炎性小体表达调控动脉粥样硬化的发生但 在糖尿病视网膜病变()形成过程中是否可通过抑制 炎性小体发挥保护作用目前未见报道 本文通过将 模拟物和抑制剂以及相对应的 转入经高糖环境培养的人视网膜微血管内皮细胞()通过与模型组或对照组相比较探讨 对 的 炎性小体、炎性因子表达的影响 本课题旨在研究 通过 炎性小体对糖尿病视网膜病变()的保护作用的分子机制 材料与方法.材料与试剂、胎牛血清、组织培养基、链霉素/青霉素、试剂购自碧云天人视网膜微血管内皮细胞()购自北京北纳创联生物技术研究院 阴性对照()、由大连宝生物工程公司测序合成 、酶联免疫反应法()试剂盒购自伊莱瑞特生物科技股份有限公司(武汉)、一抗购自赛默飞世尔.方法.细胞培养人视网膜微血管内皮细胞()培养于含胎牛血清、/、/肝素和 链霉素/青霉素的 培养基培养条件为、取对数生长期细胞进行实验第 卷 第 期 黑龙江医药科学 .年 月 .基金项目:黑龙江卫生健康委科研课题编号:作者简介:董雪松()女黑龙江佳木斯人在读硕士研究生通信作者:齐艳秀()女黑龙江穆棱人博士主任医师硕士研究生导师 :.实验分组采用.胰蛋白酶对 细胞进行消化计数后接种于 孔板(个/孔)分组:正常基培养的对照组、高糖环境培养的模型组、高糖环境下转染 、和 的 阴性组、组以及 抑制组.细胞转染采用 试剂依据说明书进行转染对照组和模型组转染空白试剂 阴性组转染 组转染 抑制组转染 转染完毕后对照组用正常培养进行培养模型组、阴性组、组和 抑制组用 葡萄糖以/的最终浓度添加到培养基中模拟高糖环境 培养 后收集各组细胞进行后续实验.实时荧光定量()检测 的表达利用 试剂提取各组总使用紫外分光光度计检测总 的浓度 参照反转录试剂盒(生工中国上海)说明书将 进行反转录以反转录产物 为模板按照 荧光定量 检测试剂盒说明书进行 扩增(生工中国上海)使用反转录试剂(碧云天中国上海)合成、和 的 使 用 荧 光 定 量 检 测、和 的 水平 分别以 和 为内参 采用 的方法处理数据见表 表 引物序列 ()().酶联免疫吸附法收集各组细胞上清液置于 冰箱保存采用 法检测各组 、水平检测步骤严格遵循试剂盒说明书.收集转染后各组 细胞提取蛋白样品 取 总蛋白上样于 十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳()上电泳分离蛋白转膜 室温下采用 脱脂牛奶封闭 洗膜后加入一抗在 下孵育过夜洗膜加入二抗在室温下孵育.洗膜后 显影采用图像分析软件 对 实验所得结果图像进行灰度分析.统计学方法采用.软件进行分析 计量资料用均数和标准差()表示组间均值比较采用 检验或单因素方差分析 计数资料采用频数表示组间比较采用 检验 .为差异有统计学意义 结果.的表达情况荧光定量 检测 组中 表达水平为(.)高于对照组(.)、模型组(.)、阴性组(.)和 抑制组(.)抑制组中 表达趋势低于对照组、模型组、阴性组、组差异均有统计学意义(.)见图 图 在各组中的表达趋势(.).和 浓度比较 组 、浓度(./)均高于对照组(./)低于模型组(./)、阴 性 组(./)和 抑制组(./)差异均有统计学意义(.).、表达模型组和 阴性组、表达水平均高于对照组 组、表达水平均低于 阴性组和模型组差异均有统计学意义(.)见表 黑龙江医药科学 年 月第 卷第 期表 各组、表达()组别()()()对照组.模型组.阴性组.组.抑制组.值.值.注:与对照组相比较 .与模型组相比较 .与 阴性组相比较 .、蛋白表达模型组和 阴性组、蛋白表达水平均高于对照组 组、蛋白表达水平均低于 阴性组和模型组差异均有统计学意义(.)见表 和图 表 各组、蛋白表达()组别 对照组.模型组.阴性组.组.抑制组.值.值.图 各组细胞、蛋白的表达 讨论近年来随着老龄化进程加速、生活水平提高和工作生活方式转变糖尿病发病率逐年升高 发病人数和致盲人数随之上升 流行病学研究显示我国 发生率约占总人群的.和糖尿病人群的.的发生发展是复杂的病理过程涉及到细胞因子、糖基化终末期产物堆积、多元醇通路异常、炎症、氧化应激、蛋白激酶 等多种机制其中炎症反应是 发生发展的关键因素固有免疫反应在驱动慢性炎症及糖尿病相关并发症中发挥重要作用炎性小体家族是机体固有免疫反应的组成部分在 的发生发展中起促进作用 是一种胞浆模式识别受体分子作为炎性小体家族一员可与凋亡相关蛋白颗粒样蛋白()和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶 ()形成炎性复合物活化的 可剪切 和 前体促进活性 和 生成启动炎性反应级联反应加速 的发生发展过程 研究显示增生性糖尿病视网膜病变患者的玻璃体液中 表达明显升高并且在 患者纤维血管膜中检测到高表达的、和 对糖尿病视网膜病变动物模型的研究同样显示 参与病理性新生血管生成 本 研 究 结 果 显 示 模 型 组、的 和蛋白表达水平均较对照组显著升高细胞上清液 和 水平高于对照组结果提示在高糖环境下 细胞/信号通路激活炎性因子表达增加加快 病变进程与临床和动物模型研究结果一致 定位于 染色体 上高表达于血液系统尤其是骨髓系如粒细胞、单核细胞参与粒细胞的分化与成熟过程参与免疫细胞分化 在动脉粥样硬化基础研究中显示 可通过直接负性调控下游 炎性靶基因延缓粥样硬化的发展 等人研究显示在限制条件下表达需要额外的启动信号常使其表达 通过 的 非翻译区内的保守结合位点抑制 表达减少 炎症反应活性 对 缺陷小鼠的研究中则可观察到/激活的特征 等人对炎症性肠病的研究中显示 缺失动物/通路表达增加炎性细胞因子水平显著升高阻断 可降低动物模型炎性肠病的严重程度 虽然在炎症性肠病、动脉粥样硬化等基础研究中观察到 对 炎症通路激活的影响但在 中较少见相关报道 本研究对高糖环境培养的视网膜微血管内皮细胞研究显示高糖诱导可降低 表达模型组在 降低的同时、在 和蛋白水平表达升高 此外模型组细胞培养液中 水平升高结果提示高糖培养的 细胞存在(下转第 页).体说明何种菌群变化 多项研究表明肠道菌群的改善对干预与治疗缺血性脑损伤意义重大 随着生物与科学的进步研究人员对肠道菌群与脑 肠轴关系得到更加深入的研究 未来关于脑肠关系的科学研究将会有新的突破肠道菌群与脑损伤的联系作用机制得到进一步阐明这将对脑损伤的诊断和治疗提供新的方法和新的思路为缺血性脑损伤的临床治疗带来新的改变此实验研究发现缺血导致的脑损伤大鼠肠道菌群发生明显紊乱其肠道内优势菌较正常大鼠数量减少特别是乳杆菌属()、小球藻属()等含量降低明显 随着脑缺血时间的延长菌群结构发生更加明显的改变差异更加显著 大鼠优势菌门后壁菌门()降低明显而拟杆菌门()、变形菌门()、放线菌门()含量升高特别是变形菌门差异显著 此外在实验大鼠中某些新生菌群被发现且伴随着脑损伤程度的增加呈递增趋势说明在脑损伤大鼠肠道中微生物多样性发生急剧改变推测这可能与脑损伤的发展过程有关综上所述我们的实验研究表明脑损伤大鼠紊乱的肠道菌群加重脑缺血倾向和脑损伤程度 缺血性脑损伤大鼠肠道内存在着不同程度的菌群失衡失衡的菌群物种的丰富度和多样性降低 通过菌群粪便移植并进行 测序系统测序证实了肠道菌群紊乱程度与脑缺血程度呈正相关即脑实质损伤越严重肠内菌群紊乱程度越高 需提出的是我们的实验尚未对脑损伤与肠道菌群之间的作用机制作出阐明对脑缺血过程中肠道菌群的变化作用基础的研究仍需后续实验的进一步研究参考文献:.:.():.于淼曾宪章.肠道菌群对脑卒中后免疫功能影响的研究进展.中风与神经疾病杂志():.袁康顾津瑜许鹏飞等.氧化三甲胺与缺血性脑血管病关系的研究进展.中国脑血管病杂志():.夏耿红.肠菌紊乱促进卒中脑损伤:临床关联分析及动物实验研究.南方医科大学.姜明照.灯盏花素对脑缺血再灌注损伤大鼠肠道菌群、/信号通路及肠 的影响.大理大学.:.许海英颜玉姜威等.益生菌联合美沙拉嗪对大鼠溃疡性结肠炎 及 的影响.黑龙江医药科学():.苏晓曼张义李慧玲.肠杆菌科细菌的分布与耐药性的分析.黑龙江医药科学():.(收稿日期:)(上接第 页)降低和/通路激活 为观察 与/通路激活的相关性 本研究分别转染 和 结果显示转染 的高糖培养 细胞、在 和蛋白相对表达水平降低细胞培养液中 和 水平降低从而抑制/通路激活而转染 则可促进/通路激活 本研究结果提示与动脉粥样硬化、炎症性肠病和脑膜炎等研究中类似 可调控高糖培养 细胞/细胞通路可能在 的发生发展中发挥保护作用综上所述高糖处理 后可引起 降低上调 表达可通过抑制/通路激活减轻细胞的炎症反应本研究结果初步阐述了 在 发展中的作用丰富了 发病的分子机制为 治疗提供了新的线索参考文献:郑金凤王亚波周庆云.引发糖尿病视网膜病变的主要护理因素分析及对策.黑龙江医药科学():.崔翠齐艳秀宿星杰等.糖尿病性视网膜病变的病因与治疗的研究进展.黑龙江医药科学():.刘湘乔丽菲刘垚君等.芍药苷对脑缺血再灌注损伤大鼠 炎症体信号通路相关因子表达的影响.中国中医药信息杂志():.李奕萍王红琴王健等.阿托伐他汀抑制动脉粥样硬化患者 炎性体途径的研究.浙江医学():.吴伟滨汪睿武日东等.下调 炎性体表达抑制人血管平滑肌细胞分泌高迁移率族蛋白.第三军医大学学报():.():.朱成义伊琼马金力.银杏叶提取物对糖尿病视网膜病变的临床疗效评价.国际眼科杂志():.柴广睿刘姝陈晓隆.核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白()炎症体在眼科疾病中的研究进展.眼科新进展():.肖兰兰冯霞./通路在增殖性糖尿病视网膜病变中的作用机制.国际眼科杂志():.():.():.():.():.:.():.():.(收稿日期:)黑龙江医药科学 年 月第 卷第 期