布鲁菌S2疫苗株GL_0002189基因原核表达及生物信息学分析.pdf

科学研究|组稿 Email：n mg x my 2 0 0 8 s i n a.c o m布鲁菌 S2 疫苗株 GL_0002189 基因原核表达及生物信息学分析王文龙1,红梅,呼和巴特尔1*（1.内蒙古农业大学兽医学院，农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特0 10 0 18；2.内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特0 10 0 10)摘要：为区分羊种布鲁菌S2疫苗株为疫苗免疫还是自然感染，本课题组对布鲁菌S2疫苗株进行了测序，将测序得到的基因与已在NCBI数据库中提交的布鲁菌基因组进行比对,找出了布鲁菌S2(猪种)疫苗株特有的GL_0002189基因，再对GL_0002189基因进行克隆、表达及验证，并采用布鲁菌BP26基因当作阳性对照。同时对GL_0002189基因进行了生物信息学分析。结果发现，以绵羊S2疫苗免疫的血清当作抗体检测，重组蛋白BL21(pETBP26)、BL2 1(p E T G L_0 0 0 2 18 9)与空菌BL21(DE3)比较，分别在32 kDa和2 9kDa处出现条带。结果表明重组蛋白BL21(pETBP26)、BL2 1(p E T G L_0 0 0 2 18 9)能够与布鲁菌S2免疫血清中的抗体特异性结合,且具有很好的免疫原性。另外,重组蛋白BP26与自然感染的血清发生特异性反应，而重组蛋白GL_0002189与自然感染的血清不发生特异性反应，因此GL_0002189基因在布鲁菌S2疫苗株中存在，而在羊种布鲁菌自然流行株中不存在。通过生物信息学分析发现,GL_0002189基因编码蛋白分子量约为2 4.1kDa，含有1个6 6 0 bp的完整的开放阅读框，编码2 19个氨基酸，无跨膜区，有5个抗原表位。由此表明，本研究中的GL_0002189抗原可用于布鲁菌S2疫苗免疫与羊种布鲁菌自然感染的鉴别诊断，为布鲁菌病的诊断提供了理论支持。关键词：布鲁氏菌;GL_0002189基因；原核表达；鉴别诊断中图分类号：S852.61布鲁菌病是一种由属于布鲁菌属的微生物引起的细菌性人畜共患病,布鲁菌进人体后，约有9 0%的菌被中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞杀死,然而少部分细菌会在巨噬细胞内寄生,并扩散到细胞和组织中-2。自2 0 世纪8 0 年代末以来，布鲁菌病在部分国家和地区快速流行，感染了6 0 多种野生动物，并对畜牧业造成了巨大的经济损害3。人类很容易通过动物及其产品感染布鲁菌病。即使人类不是这种疾病的携带者，但感染布鲁菌可导致生殖能力丧失，也可导致孕妇流产。1材料与方法1.1材 料布鲁菌S2疫苗株为金宇保灵生物药品有限公司生产;E.coliBL21(DE3)和E.coliDH5a购自全式金生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的驴抗绵羊IgG购自依托生物有限公司；布鲁菌自然感染的血基金项目：内蒙古自治区科技计划项目(2 0 150 2 0 7 1)作者简介：王文龙（197 6 一），男，博士，教授，博士生导师，研究方向为人兽共患病及其防治。红梅（198 8 一）,女，博士，助理研究员，研究方向为生物化学与分子生物学。通讯作者：呼和巴特尔（196 6 一），男，硕士，教授，博士生导师，研究方向为人兽共患病及其防治。文献标识码：A文章顺序编号：10 0 5-5959(2 0 2 3)0 3-0 17-0 6清S2疫苗免疫的血清均为内蒙古自治区巴彦淖尔市自繁自养羊场采集。DNA提取试剂盒、pMD19-T Simple Vector、PCR产物回收试剂盒、DNAMarker、T 4连接酶、蛋白质Marker及限制性内切酶Xhol和EcoRI均购自宝生物生物制品有限公司。从测序得到的S2序列中找出GL_0002189基因序列,设计引物并分别插人EcoRI、X h o I 酶切位点，同时用BP26基因（布鲁菌外膜蛋白基因)作为对照组。引物序列如下,GL_0002189基因引物：上游引物序列为5-GCCGGGAATTCTTGTACGGTTTACTGAACAC-3,下游引物序列为5-TGTCTCGAGTCAAGGCTGTTGGATTCGCA-3;BP26基因引物：上游引物序列为5-GCGAATTCATGAACACTCGTGCT-3，下游引物序列为 5-GCCTCGAGTTACTTGATTTCAA-3。1.2方法1.2.1布鲁菌S2疫苗株特有基因的验证。将布鲁菌S2疫苗株的GL_0002189基因序列与NCBI数据库提交的布鲁菌几种序列进行比对分析，并进行PCR扩增及验证。1.2.2布鲁菌目的基因的扩增、克隆及测序。取目的基因PCR产物2 5L进行1%凝胶琼脂糖电泳检测，并将PCR产物纯化。将PCR纯化的产物与pMD19-T202303当代畜禽养殖业17组稿VEmail：n m g x m y 2 0 0 8 s in a.c o m|科学研究载体连接过夜，连接温度为16，再转化到E.coliDH5a中，并涂布于含卡那霉素抗性的大肠杆菌培养基上培养过夜,培养温度为37。从板上挑取单菌落摇菌过夜，摇菌温度为37，再进行提取质粒及双酶切鉴定。1.2.3表达载体的构建。首先将从测序正确的菌株提取目的基因质粒,并将表达载体pET30a(+)和目的基因均以限制性内切酶XholI和EcoRI进行双酶切,将表达载体片段和目的基因片段进行回收，并对载体片段和目的片段使用T4连接酶过夜连接，连接温度为16,将连接产物转人到感受态BL21(DE3)细胞中，涂于含卡那霉素抗性LB培养基上过夜培养，培养温度为37；从培养好的平板上用牙签挑取单菌落进行鉴定，再挑取鉴定结果均为阳性的菌株进行测序。1.2.4表达产物检测。SDS-PAGE检测对重组蛋白进行诱导表达，再对诱导的菌液进行离心，取沉淀悬于Ni+柱结合缓冲液（washing/bindingbuffer），并置于-2 0 冰箱中反复冻融3 5次,加人溶菌酶(10 mg/mL)至终浓度为1mg/mL，室温放置1h后超声破碎细菌，离心收集沉淀和上清，再用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况。布鲁菌S2免疫血清的制备。本试验在内蒙古自治区巴彦尔市自繁自养羊场进行。选择2 年内均未进行疫苗免疫并且试管凝集试验(SAT)和虎红平板试验(RBT)检测均为阴性的羊,进行布鲁菌 S2 疫苗免疫。在免疫后第2 0 天进行采血，并进行分离血清。以RBT、SA T 及cELISA3种方法检测结果均显示阳菌株种属Brucella suis bv.1 str.S2猪种(B.suis)Brucella melitensis M5-90羊种（B.melitensis)Brucella abortus bv.1 str.941牛种(B.abortus)Brucella ovis ATCC 25840绵羊种（B.ovis)Brucella canis strain RM6/66犬种(B.cains)Brucella microti cCM 4915鼠种（B.microti)注：“+表示有；“-表示无”。经PCR扩增发现只在猪种布鲁菌的DNA中扩增出了约6 6 0 bp大小的条带，而在牛种和羊种布鲁菌的DNA中均无扩增出特异性条带（图1)。2.2目的基因扩增对BP26基因和GL_0002189基因进行PCR扩增后,采用1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果分别扩增出约6 6 0 bp和7 53bp条带,并且与预期目的条带大小一致(图2)。18当代畜禽养殖业202303性的血清判定为布鲁菌S2疫苗免疫血清。cELISA试验结束后，根据OD45o值计算出每组PI(抑制率)值：PI=(100-样本平均0 D450值10 0)/空白对照组平均OD450 值。自然感染血清的制备。在内蒙古自治区巴彦淖尔市自繁自养羊场选择2 年内未接种过布鲁菌疫苗且SAT和RBT检测均为阳性的羊，进一步进行cELISA检测，,如果以上结果均为阳性,则确定为布鲁菌自然感染的羊,最后采用AMOS-PCR鉴定所感染的菌种 5。将诱导表达的产物经SDS-PAGE电泳分离后，再转移到NC膜上进行了免疫印记。HRP标记的免抗羊IgG当作二抗，羊布鲁菌S2免疫的血清当作一抗。采用生物信息学分析法对布鲁菌S2疫苗株全基因组测序预测得到的GL_0002189基因的编码序列进行了分析。使用DNAstar中的EditSeq软件分析S2疫苗株氨基酸序列特征。经http:/www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html在线数据库分析蛋白质的跨膜区；经 http:/www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/数据库预测抗原表位；再经https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html数据库分析蛋白质的二级结构。2结果与分析2.1特有基因验证布鲁菌 S2疫苗的 GL_0002189基因序列与NCBI数据库提交的6 种布鲁菌的基因序列进行了比对分析,发现特有基因GL_0002189的序列只有在犬种、猪种及鼠种布鲁菌中存在，而牛种、绵羊种及羊种中均不存在(表 1)。表1GL_0002189基因序列比对结果2.3目的基因双酶切鉴定将经PCR鉴定出阳性的菌株进行质粒提取，再用限制性内切酶(XhoI、E c o R I)进行双酶切,然后对酶切产物进行电泳检测。结果发现，均扩增出了大小不一致2 个条带，分别为BP26（0.7 k b 和5.4kb)及GL_0002189(0.7kb和5.4kb)。由此表明，目的片段成功插人表达载体pET30a中（图3、图4）。GL_0002189+同源性/%1000009999科学研究|组稿VEmail：n mg x my 2 0 0 8 s i n a.c o mM12000bp1000bp一750bp一500bp-250bp_100bpM:DL2000bpDNAmarker;1:S2疫苗株;2:羊种布鲁菌；3：牛种布鲁菌图1特有基因PCR验证结果M1232000bp1900bP750bP=500bP2506P=100bpM:DL 2 000 bp DNA marker;1:GL0002181;2:BP26图2 GL_0002189基因及BP26基因扩增琼脂糖凝胶电泳图15.888.6号7508bP50006P2000bp2500bP1.900bP二750bP二500bP一2506P=100bpM1:DL2000bpDNAmarker;M2:DL15000bpDNA marker;13:GL_0002189 基因图3重组克隆质粒GL_0002189双酶切M123M16.88.B7500bp2.000bp25006p1900bP二1000bp750bP一508P2品=100bpM1:DL 2 000 bp DNA marker;M2:DL 15 000 bpDNA marker;13:BP26 基因图4重组克隆质粒BP26双酶切2.4核苷酸序列测定及分析经双酶切和PCR鉴定均为阳性的菌液进行了双2M123M-1000bp250bp250bp3向测序。将全基因组测序得到的GL_0002189基因核苷酸序列与双向测序得到的GL_0002189基因序列进行比对,结果发现同源性为10 0%;将双向测序得到的BP26基因（登录号U45996)序列与NCBI数据库提交的序列同源性为10 0%。上述结果表明,BP26和GL_0002189成功克隆至载体pMD19-T中,且成功构建了重组表达载体。GL_0002189基因序列如下:TTGTACGGTTTACTGAACACGCTACGCGATCTCGATGCCCGCACGCTCATGCTGGCGCTGGCCGAGGTCGTTGCGACTACAGGCGATCTGCGGGCCAGGGTCAATCCTAAGTATCGGTTCGATGAGCGATTGCACGACCTGACGCAGTGCCTACTGCTGGACGGCTACATCATCAAGAGCAAGATGCTGGTTCAAACTGATCCATCGATTACCGATGCGGCGCCCTTAGAGGATGACTTGATCGACGCCTTGCAGAAGTCGGGGGCTCCCCGTGCGCAGGAAATCATCGCCAAGATCAATGACTCGGCTGGCGCGTTCCGCTCGACACCACCCGACTACAATGCCTCGCTCGTTAATGCCCGCGTGGCGCTGGAGACGCTGGCCGGTGACGTGGCTGCCCATAATGCCTCGCAGCAGCCGACACCACCCACCTACAACCCATCGAAGTGGGGCGAAGTGCTTGTGTTCCTGCGAAGCAGCGGCGAGATCACGGTCGAGGAGGAAAAAGGGCTGGCTGGCGTGTTCGGTTTTCTAAGTCCGGGCGCTCACCGCCCGATGGGCATCCCAGAAGATCAGATGACGCGGCTTGGCCGCTCATTCGCGCTCCATATGTGCTGGTTCTTGCTCAAGAACCATCTCCTGCGAATCCAACAGCCTTGA。2.5重组蛋白表达形式检测重组蛋白按照1:10 0 的比例进行诱导及12%SDS-PAGE电泳。结果发现,2 个重组蛋白都以包涵体形式存在(图5)。116.0KDa-66.2 kDa 45.0 KDa35.0 kDa 25.0kDa18.4 kDa 14.4 kDa M:蛋白质Marker;1:BL21(pETGL_0002189)上清;2:BL21(pETGL_0002189）沉淀;3:BL21（p E T BP2 6）上清;4:BL21(pETBP26)沉淀2.6重组蛋白Western Blotting检测2.6.1验证布鲁菌。对布鲁菌S2疫苗免疫的血清进M1234图5检测重组蛋白表达形式202303当代畜禽养殖业19组稿VEmail:I科学研究行SAT和RBT检测结果均阳性后，再进行cELISA检测。对cELISA检测得到的OD45o值和PI值进行判断，项目对照组空白对照被检样品项目对照组被检样品注：8 0 10 0 为强阳性“+;30 7 0 为阳性“+；-10 15为阴性“_”2.6.2验证布鲁菌自然感染的血清。对自然感染的20份血清进行SAT和RBT检测均显示阳性后，再进行cELISA检测，综合cELISA检测的PI值和OD450值,发现cELISA试剂盒检测结果与RBT和 SAT检测结果完全一致，检测的2 0 份血清均为阳性（表4、表5）。对判定为自然感染的羊进行采血，按照白细胞分项目对照组空白对照被检样品发现cELISA检测结果与RBT和SAT检测结果一致,检测的8 份血清均为阳性(表2、表3)。表2 S2免疫血清OD450值OD450 值0.0490.0521.2301.1030.0560.05095.47695.19994.83095.3840.0500.0541.2301.1690.0560.0650.0600.1300.0530.0830.5520.9370.047表3S2免疫血清PI值PI值49.03153.18695.66194.553离法从全血中提取DNA，再利用AMOS-PCR法对DNA扩增产物进行菌种鉴定。结果发现，12 份样品扩增出2 个条带，条带大小分别约为17 8 bp和7 2 0 bp（图6)，由此判断本试验检测的羊均感染了羊种布鲁菌自然流行株。表4自然感染的血清OD45o值OD450 值0.5700.6030.9010.9480.0720.0670.2480.0750.0770.5070.9490.0590.1380.9011.1830.05216.81295.1990.8731.0580.0610.0551.0301.1010.0514.89495.2911.1350.9720.0430.0710.05794.7370.0560.0480.05495.0140.0510.042表5自然感染的血清检测PI值项目PI值对照组95.22094.674被检样品94.26494.934注：8 0 10 0 为强阳性“+;30 7 0 为阳性“+;-10 15为阴性“-”2.6.3WesternBlotting检测。以布鲁菌S2疫苗免疫的绵羊血清当作抗体进行检测，重组蛋白BL21（p E T BP2 6）、BL2 1（p E T G L_0 0 0 2 18 1）与空菌BL21(DE3)进行比较，发现分别在2 9kDa及32 kDa处出现了条带(图7)。由此可见,重组蛋白能够与布鲁菌20当代畜禽养殖业20230394.83893.99987.57292.06645.50793.11776.29192.63942.35293.59592.83086.807S2免疫的血清中(1:50 稀释)的抗体相结合,且免疫原性较好。重组表达蛋白BP26与布鲁菌自然感染的血清相结合，发生特异性反应（图8）,而重组表达蛋白BL21(pETGL_0002181)与布鲁菌自然感染的血清(1:50稀释）不结合，不发生特异性反应。由此可见，16.5494.16994.742-8.50895.89093.21394.64795.41295.12595.985科学研究|组稿VEmail：n mg x my 2 0 0 8 s i n a.c o mM1234567891011122 000bp1.900bP二7506P二5005P250P100bpM:DL2000bpDNAmarker;112:布鲁菌检测阳性样品图6 AMOS-PCR检测电泳结果121:BL21;2:BL21(pETGL_0002189）自然感染血清；3:BL21(pETGL_0002189)S2免疫血清图7 S2免疫血清与蛋白BL21(pETGL_0002189)反应GL_0002189基因在布鲁菌S2疫苗株中存在,而在羊种自然流行株中不存在。2.7氨基酸序列特征分析经DNAstar软件分析发现,GL_0002189基因的长度为6 6 0 bp、分子质量约为2 4.1kDa，含有1个约为6 6 0 bp完整的开放阅读框，编码了2 19个氨基酸,其中,强酸性氨基酸有2 6 个(E、D)、强碱性氨基酸有2 2 个(R、K)、极性氨基酸有49个(N、Q、C、Y、S和T）、疏水氨基酸有8 4个（A、F、I、V、W和L),另包10MYGLLNTLRDLDARTLMLALAEVVATTGDLRARVNPKYRFDERLHDLTQCLLLDGYIIKSRMLVQTDPSIhhhnhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhttchhhhccttcchhhhhhhhhhheeettceecceeeeecccccTDAAPLEDDLIDALQKSGAPRAQEIIAKINDSAGAFRSTPPDYNASLVNARVALETLAGDVAAHNASQQPccccchhhhhhhhhhhttccchhhhhhhhhtttcccccccttcchhhhhhhhhhhhhhhhhhhhccccccTPPTYNPSRWGEVLVFLRSSGEITVEEEKGLAGVFGFLSPGAHRPMGIPEDOMTRLGRSFALHMCWFLLKcccccccccccheeeeeetttceeehhhhhhhheeeeccttccccccccthhhhhhhhhhhhhhhhhhhhNHLLRIQQPtthhhhcccSequence length:SOPMA:Alpha helix310helixPihelixBetabridgeExtended strandBetaturnBendregionRandom coilAmbiguousstates(?)otherstates11:BL21；2:BL2 1（p E T BP2 6）自然感染血清；3:BL21(pETBP26)S2免疫血清图8 S2免疫血清与蛋白BL21(pETBP26)反应3M15xDa20301219(Hh)：(Gg)：(Ii)：(Bb)：(Ee)：(Tt)：(S=)：(C)：图9GL_0002189蛋白的二级结构2218XDaKDa35KDa25KDa114i352.05%i30.00%0.00%i30.00%23i310.50%21i3i36127.85%i30.00%i30.00%3含5.90 6 个等电点。2.8跨膜区预测通过 http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/在线数据库分析发现，GL_0002189蛋白无跨膜区，并且整个蛋白位于细菌膜外区。2.9抗原表位预测经http:/www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/在线数据库预测抗原表位发现，GL_0002189蛋白的抗原表位有5个，分别为:FLSPGAHRPMGIPED、A H NA SQ Q PT PPT YNPSK、AGAFRSTPPDYNA、D PSIT D A A PLE 及KSGAPRA。2.10蛋白二级结构经 https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html在线数据库分析GL_0002189蛋白质的二级结构发现，GL_0002189蛋白的结构比例不同，螺旋结构比例为52.05%、无规卷曲结构比例为2 7.8 5%、折叠结构比例为9.59%，延伸链结构比例为10.50%。由此判断出，螺旋能成为GL_0002189蛋白的主要结构（图9）。405019.59%0.00%M一15KDa60701202303当代畜禽养殖业2121895KDaKDaKDa组稿VEmail:|科学研究3讨论对布鲁菌病的流行病学研究发现，引起人类感染的主要布鲁菌物种是羊、牛和猪，其中羊种布鲁菌感染最常见，其他种感染很少见5。2 0 世纪研究出几种潜在的免疫原性和保护性抗原，将这些蛋白质根据其分子量回进行分类。Omp31是一种外膜蛋白,其分子量为31kDa。近期的动物试验表明,Omp31对布鲁菌具有较强的免疫保护作用，而且可以作为诊断布鲁菌病的抗原I7。BP2 6 是一种分子量为2 6 kDa的蛋白质，已用于布鲁菌病的诊断8。0 mp25也是一种外膜蛋白,且具有较强免疫原性9。0 mp10、0 mp 16 和Omp19是几乎存在于所有布鲁菌物种中的脂蛋白 10。研究已经证实，这3种蛋白可以引起动物的免疫反应,并在布鲁菌病的诊断或疫苗开发方面具有潜在的价值1-2 1。本课题对GL_0002189基因进行原核表达及检测发现它与布鲁菌自然感染的血清和疫苗免疫的血清发生特异性反应。与此同时,经预测发现GL_0002189蛋白为细胞外蛋白,并有望成为鉴别诊断布鲁菌病的潜在靶点蛋白。蛋白质折叠和螺旋位于细胞内，很难与抗体发生特异性结合，而蛋白质无规则卷曲结构可逆性非常大,其一般位于细胞外,较容易与抗体相特异性结合 3。本研究中的GL_0002189蛋白具有5个抗原表位，蛋白无规则卷曲和延伸链共占38.35%，GL_0002189蛋白无跨膜区，据其可判断细胞外的分泌性蛋白。参考文献：1 DE FIGUEIREDO P,FICHT T A,RICE-FICHT A,et al.Pathogenesis and immunobiology of brucellosis:review ofBrucella-host interactionsJJ.TheAmerican JournalofPathology,2015,185(6):1505-1517.2 ELFAKI M G,ALAIDAN A A,AL-HOKAIL A A.HostresponsetoBrucellainfection:reviewfutureperspectiveJJournal of Infection in Developing Countries,2015,9(7):697-701.3 PAPPAS G.The changing Brucella ecology:novel reservoirs,new threatsJJ.International Journal of Antimicrobial Agents,2010(36):S8-S11.4 DEANA S,CRUMP L,GRETER H,et al.Clinicalmanifestations of human brucellosis:a systematic reviewand meta-analysisJPLoSNeglectedTropical Diseases,2012,6(12):e1929.5 LI Z Q,SHI J X,FU W D,et al.A Brucella melitensis M5-90 wboA deletion strain is attenuated and enhancesvaccine efficacyJj.Molecular Immunology,2015,66(2):276-283.6 TRUONG Q L,CHO Y,PARK S,et al.Brucella abortusmutants lacking ATP-binding cassette transporter proteinsare highly attenuated in virulence and confer protectiveimmunity against virulent B.abortus challenge in BALB/cmiceJJ.Microbial Pathogenesis,2016,95(2):175-185.7 BAO Y,TIAN M,LI P,et al.Characterization of Brucellaabortus mutant strain 22915,a potential vaccine candidate.Veterinary Research,2017,48(1):17.8 TRUONG Q L,CHO Y,KIM K,et al.Booster vaccination withsafe,modified,live-attenuated mutants of Brucella abortusstrain RB51 vaccine confers protective immunity againstvirulent strains of B.abortus and Brucella canis in BALB/c miceJ.Microbiology,2015,161(11):2137-2148.9 YANG X,HE Z,ZHANG G,et al.Evaluation of reactivity ofmonoclonal antibodies against Omp25 of Brucella spp.J.Frontiers in Cellular and Infection Microbiology,2020(10):145.10 TIBOR A,DECELLE B,LETESSON J J.Outer membraneproteins Omp10,Omp16,and Omp19 of Brucella spp.arelipoproteinsJj.InfectionandImmunity,1999,67(9):4960-4962.1 WANG Z,WU Q.Research progress in live attenuatedBrucella vaccine developmentJj.CurrentPharmaceuticalBiotechnology,2013,14(10):887-896.12 HORWELL F D,VAN DRIMMELEN G G.Brucellamelitensis strain Rev I as a vaccine for cattleJJournalandof the South African Veterinary Medical Association,1971,42(3):233-235.13 ZHU L,FENG Y,ZHANG G,et al.Brucella suis strain 2vaccine is safe and protective against heterologousBrucella spp.infectionsJJ.Vaccine,2016,34(3):395-400.（责任编辑：营瑞珍）22当代畜禽养殖业202303