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紫外-可见分光光度法
1.1紫外-可见吸收光谱的应用范围
基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为分光光度法，包括紫外可见分光光度法和红外光谱法。
紫外可见分光光度法是仪器分析中应用最广泛的分析方法，具有如下特点：
(1) 灵敏度高：常用于测定试样中1%—0.001%的微量成分，甚至可以测定低至10-6—10-7的痕量成分。
(2) 准确度高：测量的相对误差通常在2%—5%，对常量组分，此法准确度不及重量法和滴定法，但对于微量组分而言，则是紫外可见分光光度法较为准确。
(3) 适用范围广：几乎所有的无机离子和许多有机化合物都可以用吸光光度法来测定。
(4) 操作简单快速，仪器价格相对较低。
紫外可见分光光度法在冶金、地质、材料、医药等诸多领域均发挥着重要的作用。随着高新科技的发展，我们有理由相信紫外可见分光光度法将得到更好的利用。

1.2紫外-可见吸收光谱的原理
1.2.1 光的基本性质
光是一种电磁波，具有波粒二象性，如光的偏振、干涉、衍射、折射等现象就是波动性的体现，而光电效应、光的吸收和发射则体现了光的微粒性，即光是由大量具有能量的粒子流所组成，这些粒子就称为光子。
光子的能量仅与光的波长有关，波长越短，频率越高，能量越大，反之波长越长，频率越低，能量越小。因此，单色光（具有单一波长的光）是由具有相同能量的光子所组成，而复合光是由很多种单色光所组成，他们的波长和能量各不相同。
1.2.2 分子吸收光谱的形成
1.2.2.1过程：运动的分子外层电子吸收外来辐射，能量升高而产生电子能级跃迁 ，分子由基态被激发到激发态而产生分子吸收谱。
1.2.2.2 能级组成：在分子中，除了电子相对于原子核的运动外，还有核间相对位移引起的振动和转动。这三种运动能量都是量子化的，并对应有一定能级。在每一电子能级上有许多间距较小的振动能级，在每一振动能级上又有许多更小的转动能级。
若用△E电子、 △ E振动、 △ E转动分别表示电子能级、振动能级和转动能级差，即有△ E电子> △ E振动> △ E转动。处在同一电子能级的分子，可能因其振动能量不同，而处在不同的振动能级上。当分子处在同一电子能级和同一振动能级时，它的能量还会因转动能量不同，而处在不同的转动能级上。所以分子的总能量可以认为是这三种能量的总和：E分子 = E电子 + E振动 + E转动
物质结构不同或者说其分子能级的能量间隔各异，因此不同物质将选择性地吸收不同波长或能量的外来辐射，这是紫外可见分光光度法定性分析的基础。
定性分析的具体做法是让不同波长的光通过待测物，经待测物吸收后，测量其对不同波长光的吸光度，以吸光度 A 为纵坐标，辐射波长为横坐标作图，得到该物质的吸收曲线，据吸收曲线的特性 (峰强度、位置及数目等) 研究分子结构。
1.2.3 Lambert-Beer朗伯-比耳定律
1.2.3.1 基本原理
当强度为 I0的入射光束通过装有均匀待测物的介质时，该光束将被部分吸收，未被吸收的光将透过待测物溶液以及通过散射、反射（包括在液面和容器表面的反射）而损失，这种损失有时可达10% ，那么，
I0 =Ie + Is +Ir
因此，在样品测量时必须同时采用参比池和参比溶液扣除这些影响！
对于任何一种有色溶液，都可以测出它的光吸收曲线，光吸收程度最大处的波长称为最大吸收波长。如图1-1所示，图中浓度A＞B＞C，因此当浓度不同时，最大吸收波长是不变的，但浓度越大，光的吸收程度越大，吸收峰就越高，这也是分光光度法的理论依据。
波长λ
吸光度A
A
B
C
最大吸收波长

图1-1 吸光度A与波长λ关系示意图
1.2.3.2.朗伯-比耳定律
当入射光波长一定时，待测溶液的吸光度 A 与其浓度c和液层厚度b成正比，即
式(1-1)
式中：A为吸光度；
b为液层厚度，单位为cm；
c为溶液的摩尔浓度，单位为 mol/L；
ε为摩尔吸光系数，单位为L/mol∙cm。
ε越大，表示方法的灵敏度越高，ε与波长有关。
1.2.3.3.偏离朗伯-比耳定律的因素
样品吸光度 A 与光程 b 总是成正比。但在实际工作中，当b一定时， A 与 c 并不总是成正比，尤其当溶液浓度较高时，标准曲线常发生弯曲，即偏离了朗伯-比耳定律。这种偏离由物理性因素和化学性因素造成。
(1) 物理性因素
物理性因素，如非单色光、杂散光、非平行入射光等都会引起这种偏离，其中最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。
朗伯-比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光，但即使是现代高精度分光光度计，也难以获得真正的纯单色光，大多数分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带，但它仍然是具有一定波长范围的复合光。
为了克服非单色光引起的偏离，首先应选择较好的单色器，另外，还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长处。这不仅因为在此处能获得最大的灵敏度，还因为在那附近的一段范围内吸收曲线比较平坦，各波长光的摩尔吸光系数ε值大体相等。
(2) 化学性因素
化学性因素主要包括两个方面：一类是吸光质点之间的相互作用；另一类是来自化学平衡。
a. 朗伯-比耳定律的前提条件之一是吸光质点之间不发生相互作用，但实验证明，只有在稀溶液（c<0.01mol/L）时才基本符合，也就是说朗伯-比耳定律只适用于稀溶液。因此，待测物浓度高时，必然造成对该朗伯-比耳定律的偏离
b. 试液中各组分的相互作用，如缔合、离解、光化反应、异构化、配体数目改变等化学平衡的变化使溶液浓度发生变化，这也必然会引起待测组分吸收曲线的变化，继而偏离朗伯-比耳定律。
为了克服这些偏离，必须控制待测溶液的浓度在0.01mol/L以下，而且要控制显色反应的条件以及溶液中的化学平衡。

1.3紫外-可见吸收光谱的基本构成
1.3.1紫外-可见分光光度计仪器由光源、单色器、吸收池、检测器和显示系统五部分组成。
1.3.1.1 光源
对光源的基本要求：发射连续光谱，具有不随波长而改变的足够光强，较好的稳定性，较长的使用寿命。 光源一般分为两种：
(1) 钨及碘钨灯： 340~2500 nm ，多用在可见光区；
(2) 氢灯和氘灯： 160~375nm ，多用在紫外区。
1.3.1.2 单色器
单色器是能将光源发射的复合光分解成单色光并可从中任选某一波长单色光的光学系统：通常包括入射狭缝，准光装置，色散元件，聚焦装置和出射狭缝。
其中色散元件是核心部分，有棱镜和光栅两种形式。单色光的纯度取决于色散元件的色散特性和出射狭缝的带宽。
1.3..13 吸收池
用于盛放样品。可用石英或玻璃两种材料制作，石英适用于紫外区和可见光区；玻璃只适用于可见光区。有些透明有机玻璃也可用作吸收池。
1.3.1.4 检测器
通常利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池，光电管和光电倍增管。
1.3.1.5 测量系统
测量系统包括信号放大器和结果显示系统。

1.3.2从结构上，分光光度计分为单光束和双光束两大类；从测量过程中同时提供的波长数，又分为单波长和双波长两大类。
1.3.2.1 单波长分光光度计
(1) 单光束：结构简单，价格便宜，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，但一般不能做全波段光谱扫描。
(2) 双光束：将单色器色散后的单色光分成两束，一束通过参比池，一束通过样品池 ，一次测量就可得到吸光度。可以消除光源不稳定、放大器增益变化及检测器灵敏度变化等因素的影响，当然仪器的复杂也导致了价格的昂贵。
1.3.2.2 双波长分光光度计
光源
单色器
单色器
检测器
切光器
吸收池

图1-2 双波长分光光度计示意图

通过两个单色器将光源分成两束不同波长的光，之后通过切光器使两束光交替通过吸收池，测得吸光度差ΔA 。
二式相减，得
式(1-2)
这表明，试样溶液浓度与两个波长处的吸光度差成正比。
特点：可测定多组分试样、混浊试样、而且可做成导数光谱、无需参比吸收池——消除了由于参比池的不同和制备空白溶液等产生的误差、克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。

1.4 紫外可见吸收光谱的操作
紫外可见分光光度法是对有色物质进行测定，有些物质本身就具有吸收紫外光或可见光的性质，它们可直接进行光度法测定。而大多数物质本身没有这种吸收或者吸收很少，不能直接进行光度测定，这就需要借助显色反应使之转化为满足实验条件的物质进行测定。
显色反应一般分为两大类：氧化还原反应与配位反应。
(1) 氧化还原反应：例如光度法测定钢中微量锰的含量，溶解后所得的Mn2+近乎无色，不能直接进行光度测定，通常用过硫酸盐将其氧化成紫红色的MnO4-再进行测定。
(2) 配位反应：这是最常用的显色反应。由于无机显色剂与金属离子形成的配合物在稳定性、灵敏度和选择性方面较差，一般较少使用，大多都使用有机显色剂，目前仍具有实用价值的无机显色剂仅有硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。

1.4.1首先讨论紫外可见吸收光谱操作条件的选择
1.4.1.1仪器测量条件选择
仪器由于光源不稳定性、读数不准等都会带来误差。当分析高浓度的样品时，误差更大。
由朗伯-比耳定律，式(1-1)：

微分后得：
式(1-3)
当相对误差Δc/c 最小时，求得 T=0.368 或 A=0.434。即当 A=0.434 时，吸光度读数误差最小。因此通常可通过调节溶液浓度或改变光程b来控制A的读数在 0.15~1.00 范围内以使得吸光度读数误差较小。
1.4.1.2 反应条件选择
对于紫外可见分光光度法的显色反应来说，有许多需要注意的地方，下面具体介绍：
(1) 显色剂的选择原则：
a. 首先，应该选择灵敏度高，即配合物摩尔吸收系数大的反应。
b. 再者，反应应该选择性好、配合物稳定而组成恒定、显色剂吸收波长与配合物吸收波长相差大即配合物与显色剂颜色差异较大才好。
(2) 显色剂用量：
为保证显色反应进行完全，一般需加入过量显色剂，但也不是越多越好。过量的显色剂有时会导致副反应发生，从而影响测定。合适的用量可以通过实验确定：保持其他条件不变而仅改变显色剂的用量，分别测定吸光度。根据曲线来选择吸光度大而平坦的区域，这里的显色剂用量是相对合适的。
(3)溶液酸度：
酸度的影响是多方面的：许多显色剂本身是有机弱酸碱，酸度变化必然影响它们的离解平衡和显色反应的完全程度；多数金属离子因为酸度降低而形成各种羟基配合物乃至沉淀；某些显色配合物是逐级配合物，产物的组成随着酸度而改变。同样，合适的酸度也可以通过实验确定。
(4) 显色温度与时间：
温度上，多数显色反应在室温下即可很快进行，但也有的反应需要加热到一定温度才能较快发生；时间上，一方面要保证足够的时间使显色反应进行完全，另一方面测定工作必须要在有色配合物的稳定时间内完成。这些也都可以通过实验确定。
(5) 参比液选择
整体的选择原则是谁有吸收，谁做参比。
a. 溶剂参比：试样组成简单、共存组份少、显色剂不吸收时，直接采用溶剂（多为蒸馏水）为参比；
b. 试剂参比：当显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，采用试剂作参比（不加待测物）；

1.4.2然后，讨论干扰消除
共存离子的干扰是多种多样的，如共存离子本身有颜色，或与显色剂形成有色化合物等，消除的方法包括
(1) 控制酸度：配合物稳定性与 pH 有关，可以通过控制酸度提高反应选择性，副反应减少，而主反应进行完全。如在 H2SO4 介质中，双硫腙与 Hg2+ 生成稳定有色配合物，而与 Pb2+ 、Cu2+ 、Ni2+ 、Cd2+ 等离子生成的有色物不稳定。
(2) 加入掩蔽剂 ：选择掩蔽剂的原则是——掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。
(3) 测量条件与方法：选择合适的测量波长与参比溶液，使用导数光谱及双波长技术等。

1.4.3最后，讨论分光光度定量测定方法
紫外可见分光光度定量分析方法包括普通分光光度法（单组分与多组分）、示差分光光度法、双波长分光光度法、导数分光光度法、动力学分光光度法等，下面仅就前两者做简要介绍：
1.4.2.1普通分光光度法：
(1) 单组分定量方法
标准曲线法：先配制一系列浓度c不同的待测物质的标准溶液，然后经显色反应转化为紫外可见光区有吸收的化合物，分别测定吸光度A，做出A-c标准曲线。在同样条件下对待测样品进行显色反应然后测定吸光度A，从标准曲线上便可查出其对应的浓度。
(2) 多组分定量方法

由于吸光度具有加合性，因此可以在同一试样中测定多个组份。
设试样中有两组分x 和y ，将其显色后，分别绘制吸收曲线，会出现如图所示的三种情况：
λ1 λ2 λ
λ1 λ2 λ
λ1 λ2 λ
A
A
A
x
x
x
y
y
y
（a）
（b）
（c）

图1-2 多组分定量方法示意图
图 (a) ： x，y组份最大吸收波长不重迭，相互不干扰，可以按两个单一组份处理。
图(b) 和(c) ： x，y 相互干扰，此时可通过解联立方程组求得 x和 y 的浓度：
式(1-5)
式(1-6)
其中， x，y 组份在波长λ1 和λ2 处的摩尔吸光系数ε由已知浓度的 x，y纯溶液测得。解上述方程组可求得 cx 及 cy 。
1.4.2.2 示差分光光度法
测量原理：当试样中组分的浓度过大时，则 A 值很大，会产生读数误差。此时若以一浓度略小于试样组分浓度的溶液做参比，
则有：
式(1-7)
式(1-8)
两式相减，得
式(1-9)
具体做法：以浓度为 cs 的标准溶液调 T=100% 或 A=0（调零），所测得的试样吸光度实际就是上式中的ΔA，然后求出Δc，则试样中该组份的浓度为 (cs + Δc) 。

1.5紫外可见吸收光谱的日常维护
1.5.1 分光光度计的检定
为保证测试结果的准确可靠，新制造、使用中和修理后的分光光度计都应定期进行检定，检定规程规定了检定周期，通常为一年，在此期间内，仪器经修理或测量结果有怀疑时，应及时进行检定。检定一般包括以下几项指标：稳定度、波长准确度、透射比准确度、基线平直度、噪声、吸收池配套性等。
1.5.2 分光光度计的维护
分光光度计是光学、精密机械和电子技术三者紧密结合而成的光谱仪器，正确的使用和保养对保持仪器良好的性能和保证测试的准确度至关重要。
1.5.2.1对实验室的要求：
(1) 室温应该保持在15℃—28℃。
(2) 相对湿度应该控制在45%—65%，不要超过70%。
(3) 防尘、防震、防电磁干扰，远离强磁场和发射高频波的电器设备。
1.5.2.2 对仪器的要求
(1) 在不使用时不要开光源灯。如灯泡发黑、亮度明显减弱或不稳定，应及时更换新灯。不要用手直接接触窗口或灯泡避免沾污
(2) 单色器装在密封的盒里，一般不宜拆开，而且要经常更换盒子里的干燥剂，防止色散元件受潮发霉。