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桑树总生物碱分析方法与提取方法的探讨
【摘要】 　　目的研究桑树总生物碱的分析方法和提取方法。方法采用理化反应和薄层色谱对桑叶生物碱进行定性定量分析。通过对桑树生物碱成分的结构特征的分析设计提取纯化方法。结果发展了桑树生物碱的薄层色谱方法，给出了从桑叶、桑椹、桑白皮和桑枝中提取总生物碱的方法。结论薄层色谱-可见分光光度法可用于桑树总生物碱的定量分析，所提出的总生物碱提取方法具有可操作性。
【关键词】 桑树； 总生物碱； 分析方法； 提取方法
　　Abstract:ObjectiveTo study the analysis and extraction methods for total alkaloids (MTA) in　reactions and thin-layer chromatography (TLC) for qualitative and quantitative analysis were adopted, and molecular structural characteristics for extraction and purification scheme design were deduced. ResultsTLC method and extraction method of Folium Mori, Fructus Mori, Cortex Mori and Ramulus Mori were developed. ConclusionMTA can be determined by TLC-VIS　preparation process of MTA in this article is practicible.
　　Key words:Mulberry; Total alkaloids; Analysis method; Extraction method
大多桑树生物碱成分是野尻霉素(nojirimycin)的衍生物。野尻霉素最早于1965年从玫瑰产色链霉菌R-468 (Streptomyces roseochromogenes R-468)的发酵液中分得［1］，1966年被鉴定结构［2］，1967年合成得到1,5-imino-1,5-didesoxy-D-glucit (即1-脱氧野尻霉素，1-deoxynojirimycin，DNJ)［3］。之后，1976年从桑树(Morus spp.)中分得moranoline (即DNJ)［4］。由于nojirimycin,DNJ具有强的α-葡萄糖苷酶抑制活性［5，6］，因此桑树中的这类哌啶生物碱衍生物一直备受重视。我国桑树资源十分丰富，中药桑叶、桑椹、桑白皮和桑枝均来源于桑树。现在，人们已从桑类药材中发现了多种哌啶生物碱，如表1所示，其中，DNJ是4味药材的共有成分，研究也较多，大多数桑树生物碱成分的结构母核与其相同或类似，具有代表性，其结构如图1所示。表1 已发现的桑树生物碱成分
从表1、图1可以看出，哌啶型生物碱DNJ及其衍生物结构中含有较多羟基，属氮杂糖类，结构中没有苯环、双键、羰基等发色团，在可见光区和紫外光区都没有吸收，因此定性定量分析都较困难。目前DNJ含量测定方法的思路主要有二，一是将DNJ进行衍生，常用9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC-Cl)，因FMOC-Cl有紫外吸收、亦有荧光，所以可用高效液色谱紫外检测［14］或荧光检测［15］或行测定；也可将DNJ乙酰化成为沸点较低的酯类，再采用气相色谱法检测［16］；二是无需衍生，用高效液相色谱-蒸发光检测法(ELSD)直接测定［17］。显然，这些方法不够简便、对仪器要求较高，而且，除非有多种生物碱的对照品，否则无法对总生物碱进行测定。因此，寻找分析多羟基哌啶型生物碱的简便方法十分必要。
关于哌啶生物碱单一成分如DNJ的提取、分析的报道较多，但桑类药材总生物碱的分析方法和提取方法却未见报道，本文对此进行了探讨。
　　1 材料与仪器
桑叶总生物碱提取物为市售产品(DNJ含量50%)。桑叶、桑椹、桑白皮、桑枝药材购于成都荷花池中药材专业市场，经鉴定为Morus alba的干燥叶、果、根皮和嫩枝。硅胶G、732阳离子交换树脂(上海汇珠树脂有限公司)、中性氧化铝(成都市科龙化工试剂厂)、活性炭(成都市科龙化工试剂厂)，其余各种试剂为化学纯或分析纯。TU-1800紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。
　　2 方法与结果
　　桑树总生物碱分析方法的研究实验中以桑叶总生物碱提取物为样品进行了分析方法的研究；后经证实，桑椹、桑白皮和桑枝的总生物碱实验结果与之一致。
　　检识反应与生物碱沉淀试剂的反应：取桑叶总生物碱提取物适量，加蒸馏水溶解，以盐酸调pH 2～3，过滤，所得溶液为浅黄色，取5份，分别与碘化铋钾试剂、碘-碘化钾试剂、硅钨酸试剂、磷钼酸试剂、苦味酸试剂反应，结果见表2。表2 桑叶生物碱的检识反应

碘化铋钾、硅钨酸、磷钼酸与样品呈阳性反应，可用于定性鉴别。
亚硝酸反应：考虑到DNJ属于脂肪族仲胺，应能与亚硝酸进行反应。试验时取上述桑叶总生物碱提取物的酸水溶液，置试管中，加入亚硝酸钠水溶液，结果产生气泡，持续时间近1 h，随着气体的逸出，试管口颜色逐渐变深，几乎呈褐色，而溶液的颜色则由浅黄色变为深黄色。
　　薄层色谱分析桑树生物碱的薄层色谱分析鲜有报道，主要是由于DNJ及其类似物显色困难。实验中取桑叶总生物碱提取物的水溶液，点样于硅胶G板上，以醋酸乙酯-甲醇-冰醋酸(6∶2∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，显色，检识。曾实验碘化铋钾、磷钼酸、碘蒸气、10%硫酸-乙醇、α-萘酚Enrilich试剂、苯胺-二苯胺-磷酸试剂、%高锰酸钾等薄层色谱显色剂，结果碘化铋钾显色不明显，其他试剂均未能显色。

　　有文献报道［18］，采用茚三酮试剂能使DNJ显紫色斑点。经试验，茚三酮能使样品的薄层板显出斑点，但是，用茚三酮显色不能排出氨基酸的干扰，而亚硝酸反应产生气泡表明样品中可能存在氨基酸。后终于找到氯-邻联甲苯胺试剂，能使样品的薄层板显红黄色斑点。若令薄层板不显色，刮取氯-邻联甲苯胺试剂能显色的相应位置的硅胶，以甲醇洗脱，洗脱液挥除溶剂，酸水溶解，加碘化铋钾试剂，结果呈阳性反应，表明氯-邻联甲苯胺试剂能使桑叶生物碱显色。又取谷氨酸水溶液，与桑叶总生物碱提取物平行试验结果，氯-邻联甲苯胺试剂不能使谷氨酸显色。因此，桑叶总生物碱用氯-邻联甲苯胺试剂显色具有专属性。氯-邻联甲苯胺试剂显色的具体方法为：取少量高锰酸钾置密闭容器中，加适量浓盐酸令产生氯气，将薄层板放入，15 min后取出，置空气中5 min以上以除去氯气，然后喷以邻联甲苯胺溶液(160 mg邻联甲苯胺溶于30 ml冰醋酸，加水至500 ml，再加1 g碘化钾)，即可显色。桑叶生物碱提取物的薄层色谱图如图2所示。
　　含量测定方法的提出实验发现，桑叶生物碱经氯-邻联甲苯胺试剂显色后，在2 h内未见褪色，5 h后慢慢褪色，显色较为稳定。刮取斑点，用甲醇洗脱，取洗脱液在200～800 nm范围内扫描结果在209 nm和446 nm处有吸收峰，如图3所示。后来发现，若样品薄层色谱中有多个斑点，这些斑点的光谱图基本一致。据此可提出含量测定方法：以DNJ为对照品，用薄层色谱-分光光度法进行测定。

　　由于209 nm属于末端吸收峰，若用于含量测定则误差较大，故宜选用446 nm作测定波长。经试验，甲醇洗脱液放置2 h，446 nm处的吸光度值基本不变，表明方法的耐用性良好。因此确定总生物碱的含量测定方法可采用薄层色谱-可见分光光度法。
另外，根据斑点颜色清晰、稳定、以及不同斑点光谱图基本一致的性质，也可以考虑以DNJ为对照品，用薄层扫描法进行含量测定。
　　桑树总生物碱提取方法的研究本文桑树总生物碱的提取、纯化是建立在对结构、性质的分析的基础之上的。
　　根据桑树生物碱的结构推测其理化性质
溶解性：由表1可知，DNJ类化合物为氮杂糖型结构，羟基较多，极性较大，因此可溶于水、醇类溶剂，在氯仿等弱极性溶剂中、醋酸乙酯等中等极性溶剂中应不能溶解或溶解度很小，因此，传统的生物碱提取方法(酸水提取、氯仿萃取)将不适用，但可考虑用水、醇类溶剂提取。

　　碱性：由表1可知，桑树生物碱多为脂肪族仲胺或叔胺，因此具有弱碱性，在一定pH条件下能成为离子状态，故可以考虑用离子交换色谱进行纯化。另外，也以考虑使用氧化铝等碱性吸附剂进行分离。
水解性：对于氮杂糖本身而言，其化学性质非常稳定，在酸、碱、热作用下不易分解。但根据表1，不少生物碱成分以糖苷的形式存在，苷在酸性条件下尤其是加热时易被水解，因此，提取分离中若使用酸时应注意不能使作用时间太长，并应尽量避免在酸性条件下加热。
　　桑树生物碱的提取工艺流程根据上述结构与性质的分析，本文提出了以下的提取工艺流程。各提取步骤分别进行沉淀反应和薄层色谱跟踪分析，以保证各工序所得到的成分为生物碱。
　　水提醇沉：取桑叶、桑椹、桑白皮、桑枝药材，分别加水煎煮提取，煎液浓缩至一定体积，放冷后加乙醇使含醇量达70%，静置过夜，滤取上清液，回收乙醇，得提取液。

　　离子交换树脂富集：取上述提取液，适当稀释，用10%盐酸调pH 4～5，流经已预处理的732阳离子交换树脂柱，树脂柱先以水洗至近中性，弃去水洗液，再用 mol/L氨水洗脱，收集洗脱液，适当浓缩。
正丁醇萃取：取上述浓缩液，以等量的水饱和的正丁醇萃取，共3～4次，分取正丁醇层，减压回收溶剂，得正丁醇萃取物。
氧化铝柱层析：取正丁醇萃取物，用少量水溶解，上样于氧化铝干柱，以乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇，得氧化铝纯化物。
活性炭脱色：取氧化铝纯化物，以水溶解，加适量活性炭，煮沸15 min，放冷，过滤，滤液浓缩除去溶剂，即得到总生物碱产品。
　　产品的初步分析
沉淀反应：取上述产品，加水溶解，以盐酸调pH 2～3，分别加碘化铋钾试剂、硅钨酸试剂、磷钼酸试剂，结果4味药的总生物碱均呈阳性反应。

　　薄层色谱分析：薄层色谱条件同上。结果如图4所示。
　　3 讨论
中药有效成分的分析方法与提取方法建立的前提是对目标成分理化性质有充分的认识。本文在分析桑树生物碱结构与性质的基础上，根据实验结果提出了桑树总生物碱的新的定性定量方法和提取分离方法，方法可行性较好，但方法中的具体参数仍有待进一步研究，所得总生物碱的含量尚待测定。
曾考虑采用酸性染料比色法进行桑树总生物碱的定量分析，但实验发现该方法干扰很大。
亚硝酸反应中，有气体产生，表明样品应存在含伯胺基的化合物，很有可能是氨基酸。后用谷氨酸进行亚硝酸反应，结果能产生大量气体。
薄层色谱图中，点样原点亦明显显色，表明可能有部分生物碱成分停留在原点尚未展开，因此本文的薄层色谱条件尚需优化。
氯-邻联甲苯胺试剂使桑树生物碱显色的原理可能是：新生态氯使生物碱氯代，然后氯代物与邻联甲苯胺发生缩合反应生成联苯醌而显黄色［19］。
【参考文献】
　　［1］Nishikawa T, Ishida N. A new antibiotic, R-468, active against drug-resistant Shigella［J］.J Antibiotics, Ser A, 1965, 18(3): 132.
　　［2］Inouye S, Tsuruoka T, Niida T. Structure of nojirimycin, sugar antibiotic with nitrogen in the ring［J］.J Antibiotics, Ser A, 1966, 19(6): 288.
　　［3］Paulsen H, Sangster I, Heyns K. Monosaccharide mit stickstoffhaltigem Ring, XIII. Synthese und Reaktionen von Keto-piperidinosen［J］.Chem Ber, 1967,100(3): 802.
　　［4］Yagi M, Kouno T, Aoyagi Y, et al. The structure of moranoline, a piperidine alkaloid from Morus species［J］.Nippon Nogeikagaku Kaishi, 1976, 50(11)：571.
　　［5］Niwa T, Inouye S, Tsuruoka T, et al. "Nojirimycin" as a potent inhibitor of glucosidase［J］. Agric Biol Chem, 1970, 34(6)：966.
　　［6］Frommer W, Mueller L, Schmidt D，et al. Inhibitors for alpha-glucosidases［P］. DE 2658561, 1978-06-29.
　　［7］Kimura M, Chen F J, Nakashima N, et al. Antihyperglycemic effects of N-containing sugars derived from mulberry leaves in streptozocin-induced diabetic mice［J］.Wakan Iyakugaku Zasshi, 1995, 12(3)：214.
　　［8］Chen F J, Nakashima N, Kimura I, et al. Potentiating effects on pilocarpine-induced saliva secretion, by extracts and N-containing sugars derived from Mulberry leaves, in streptozocin-diabetic mice［J］. Biol Pharm Bull, 1995, 18(12)：1676.
　　［9］Naoki A, Emiko T, Haruhisa K, et al. Sugars with nitrogen in the ring isolated from the leaves of Morus bombycis［J］.Carbohydr Res, 1994, 253: 235.
　　［10］Asano N, Yamashita T, Yasuda K, et al. Polyhydroxylated alkaloids isolated from mulberry trees (Morus alba L.) and silkworms［J］.J Agric Food Chem, 2001, 49：4208.
　　［11］Kusano G, Orihara S, Tsukamoto D, et al. Five new nortropane alkaloids and six new amino acids from the fruit of Morus alba LINNE growing in Turkey［J］.Chem Pharm Bull, 2002, 50(2)：185.
　　［12］Asano N, Oseki K, Tomioka E, et al. N-containing sugars from Morus alba and their glycosidase inhibitory activities［J］.Carbohydr Res, 1994, 259：243.
　　［13］陈震，汪仁芸，朱丽莲，等. 桑枝水提取物化学成分的研究［J］.中草药，2000，31(7): 502.
　　［14］施新琴，崔为正，裘立群，等. 用反相高效液相色谱-紫外检测法测定1-脱氧野尻霉素的含量［J］.蚕业科学，2006，32(1)：146.
　　［15］Kim J W, Kim S U, Lee H S, et al. Determination of 1-deoxynojirimycin in Morus alba L. leaves by derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate followed by reversed-phase high-performance liquid chromatography［J］.J Chromatogr A, 2003, 1002：93.
　　［16］李宏，钱永华，王建芳，等. 桑叶中1-脱氧野尻霉素(DNJ)的气相法测定［J］.北方蚕业，2006，27(3)：31.
　　［17］Kimura T, Nakagawa K, Saito Y, et al. Determination of 1-Deoxynojirimycin in Mulberry Leaves Using Hydrophilic Interaction Chromatography with Evaporative Light Scattering Detection［J］.J Agric Food Chem, 2004, 52：1415.
　　［18］田丽丽，李中军，李 辉. 1-脱氧氮杂-D-葡萄糖(Deoxynojirimycin，DNJ)的合成［J］.应用化学，2004，21(1)：12.
　　［19］李剑华. 邻联甲苯胺比色法检测强力洗消精的余氯量［J］.中国药业，2000，9(2)：47.