MicroRNAs作为药物性肝损伤生物标记物研究进展.pdf

作者单位:421001 湖南省衡阳市 南华大学附属第二医院健康管理中心第一作者:桂芬芬,女,32 岁,医学学士,主治医师。主要从事肝脏疾病的超声诊断和临床研究。E-mail:507813040 通讯作者:周杰斌,E-mail:nhdxzjb 综述MicroRNAs 作为药物性肝损伤生物标记物研究进展桂芬芬 综述,周杰斌 审校【摘要】药物性肝损伤(DILI)是全球卫生健康领域的重要挑战和阻碍新药研发的主要障碍之一。DILI 缺乏特异性的诊断手段和治疗措施,目前主要依赖早期诊断和对症治疗。本文综述了近年来 MicroRNAs 作为 DILI 生物标记物研究取得的重要进展,以期加深对 DILI 诊断标记物的认识。【关键词】药物性肝损伤;微小 RNAs;生物标记物;诊断 DOI:10.3969/j.issn.1672-5069.2023.05.040 Micro RNAs as biomarkers in patients with drug-induced liver injuryGui Fenfen,Zhou Jiebin.Department of HealthManagement Center,Second Affiliated Hospital,University of South China,Hengyang 421001,Hunan Province,China【Abstract】Drug-induced liver injury(DILI)is an important challenge to deal with.DILI lacks specific diagnosticparameters and treatment measures,and mainly depends on early diagnosis and supporting treatment.In this article,we reviewedthe important achievements on microRNAs study as biomarkers for DILI diagnosis in recent years.【Key words】Drug-induced liver injury;MicroRNAs;Biomarkers;Diagnosis 肝脏是人体最大的消化器官,是三大物质的代谢中枢,在肝脏内进行着氧化、还原、水解、合成等一系列生化反应;肝脏也是药物及各类生化毒素转换和解毒的中心,经常暴露于各种毒性物质之中,因而肝脏是药物不良反应的主要靶器官。目前,在人类研发的 10000 余种药品中,有 1100 多种药物被报道有潜在的肝脏毒性,药物性肝损伤(DILI)是药物研发面临的主要障碍及药物撤市最重要的原因。由于人们健康保健意识的不断增强,各类处方及非处方药物的使用日益增多,DILI 也正成为全球卫生领域越来越严峻的挑战。长期以来DILI 的早期诊断及预测都是临床用药及新药研发面临的棘手难题,美国 FDA 批准了四种经典的肝损伤标记物 ALT、AST、ALP 及 TBiL 用于识别 III 期临床试验中严重的 DILI 病例1-3。然而这些标记物在灵敏度及特异度方面都存在各种不足,即使一直以来被视为肝脏损伤金指标的 ALT4也有许多缺陷,应用价值广受争议。ALT 并非肝脏损伤特异性的标记物,ALT 在心肌、肾脏及肌肉等多种组织中都有不同程度的表达5,即使在没有观察到肝组织损伤的情况下 ALT 也有可能会升高,并且对预后判断没有价值6,如肌肉损伤甚至是静脉营养都可以引起血清 ALT 升高,从而导致对肝损伤的误判7,8。此外,ALT 对肝损伤的诊断也不够灵敏,仅在严重甚至不可逆的组织损伤情况下才升高4。故迫切需要更加灵敏和更 有 特 异 性 的 新 型 标 记 物。本 文 综 述 了 近 年 来MicroRNAs 在 DILI 生物标记物领域取得的重要进展,以期加深对 DILI 生物标记物的认识。1 MicroRNAs 概述基因的表达与调控是疾病发生的重要因素之一,miRNAs作为一种小型非编码 RNA,在翻译水平调控着基因表达,它们与传统的 RNA 分子不同,miRNAs 并不直接编码蛋白质,而是参与体内重要生物过程的调节,包括生长发育、内环境稳定及衰老 等5-8。在 RNA 诱 导 的 沉 默 复 合 体(RISC)中,miRNAs 通过互补序列与 mRNA 相结合,进而通过物理阻碍作用或诱导 mRNA 降解等途径阻止 mRNA 翻译成为蛋白质,从而在翻译水平上起到负性调节作用9,10。在 miRNAs 的早期研究中,研究人员发现其在线虫发育的过渡阶段中起重要调节作用,随后在对更高级别的真核生物的研究中确认了它们的存在,并确定了它们在正常生理过程中的调节作用11。目前在哺乳动物的细胞中已经发现了数千种 miRNA,因其在作为疾病状态标记物以及毒理学研究中组织损伤的特异性标记物方面的良好潜能,从而引发了大量的科学研究,并成为药物研发领域一组重要的分子标志物12,13。由于 miRNA 高度稳定,通过分析血浆、尿液、唾液、脑脊液等体液中的 miRNA从而开发相应疾病的诊断试验一直是相关研究领域的热点14。一些 miRNAs 在特定的器官中表现出显著的组织富集现象,比如 miR-21815在脑组织中高度富集,miR-116则在心肌组织中富集并参与心脏的多种病理生理过程,而 miR-122 则几乎只存在肝脏中,miR-122 可以作为肝细胞损伤的特异性标记物17。更为重要的是,miRNAs 在不同物种之间也存在高度保守的现象18,从而使得来自动物实验的数据可能得以外推到人类,因此在 DILI 动物模型及临床检测中都有成为特异性标记物的巨大潜力,下面将重点讨论 miR167实用肝脏病杂志 2023 年 9 月第 26 卷第 5 期 J Prac Hepatol,September.2023.Vol.26 No.5-122 及 miR-192 在作为 DILI 标记物方面的潜能。2 MicroRNAs 参与 DILI 的发病机制miRNAs 在 DILI 发病机制中的作用十分复杂,迄今尚未完全阐明,大量研究表明 miRNAs 可能参与了 DILI 的某些病理过程,一项研究发现在用二恶英处理小鼠后,在检测到肝损伤之前,数种肝内 miRNAs 的表达即发生了改变,表明这些miRNAs 可能参与了肝脏毒性反应的始动过程,特别是 miR-101a 的降低,与此同时部分促炎介质的表达也有所增加,推测 miR-101a 的降低可能通过促进 Cox2 的产生从而介导了肝脏损伤19。也有研究发现当大鼠暴露于对乙酰氨基酚或四氯化碳等肝脏毒性物质中,会导致各种 miRNAs 表达的改变,由于 miR-298 和 miR-370 在调控氧化应激相关基因的表达方面具有重要的作用,研究人员推测 miR-298 和 miR-370等分子的表达减低与对乙酰氨基酚的肝脏毒性作用密切相关20。一些研究还发现,miR-199a-5p 能通过降低内质网应激信号蛋白的翻译表达来减轻胆汁酸诱导的肝细胞损伤,具有一定的肝脏保护作用21。综上所述,miRNAs 可能在药物及化学毒素所致的肝脏毒性机制中扮演着重要的角色,其中有些 miRNAs 可能具有有益的保护作用,而另一些则可能参与了药物肝脏毒性的始动、炎症反应扩大等的环节,在 DILI的发生、发展中发挥着重要的作用。3 MicroRNAs 作为 DILI 分子标记物的潜力MicroRNAs 最初主要因其在作为癌症检测的分子标记物方面的潜力而得到广泛的研究22,随后对 miRNAs 的研究表明,miRNAs 还在感染性疾病、糖尿病、心血管疾病等多种疾病的病理机制中起重要作用23-25。miRNAs 逐渐成为了近年来研究的热点,大量研究证实了 miRNAs 在病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、脂肪性肝炎和肝癌等肝脏疾病中的作用及作为肝损伤标记物的潜力26-28,其中在 DILI 领域的研究也取得了重要的进展,尤其是 miR-122 及 miR-192 因其在研究中展示的良好应用前景而受到广泛的关注。首个关于循环miRNAs 作为 DILI 标志物的研究于 2009 年发表,研究人员发现在小鼠模型中有 25 个 miRNAs 分子的水平明显增加,另外有 19 个 miRNAs 在血浆中明显减少,而在健康小鼠的中则没有发生变化,然而并非所有改变的 miRNAs 都可以作为 DILI的潜在标记物;研究人员进一步探讨了其中的 8 个 miRNAs,其中有 3 个 miRNAs 的降幅超过 5 倍,5 个 miRNAs 的增幅超过 8 倍;并且它们与血清 ALT 活性有着高度的相关性,在增加的 5 个 miRNAs 中,其中 miR-122 和 miR-192 的增幅分别为 474 和 80 倍,基于以上研究发现,提出这两种 miRNAs 可作为 DILI 的新型生物标志物29。3.1 miRNA-122miR-122 是肝脏中含量最为丰富的 miR-NAs,约占肝脏中全部 miRNA 的 70%,miR-122 在不同物种中高度保守,并且几乎只在肝脏中表达,因而具有良好的肝脏特异性30,31,近年来已有大量的基础和临床研究证实了miRNA-122 在作为 DILI 标记物方面的潜力。Park HK 在研究对乙酰氨基酚所致的 DILI 小鼠模型中相关 miRNA 分子的变化时,发现 miR-122 是肝细胞损伤早期的敏感生物标志物,在 ALT、AST 以及胆红素尚未升高之前就能检测到其明显的升高;而 miR-155 和 miR-21 则升高并不明显,其意义可能在于表征肝脏的炎症活动及肝细胞再生等不同的肝脏生理状态32。研究表明 miR-122 对对乙酰氨基酚的肝脏毒性十分灵敏,即使是低于肝脏毒性剂量的药物暴露也能在早期明显增加小鼠血清中 miR-122 的水平29。在小鼠模型中的这些发现很快得到了临床研究的证实,使用高通量测序的方法研究了过量对乙酰氨基酚所致的 DILI 患者血清中的循环miRNA 谱,发现了 36 个新的 miRNA,包括 miR-122、miR-483和 miR-23a 等,这些 miRNA 分子在对乙酰氨基酚过量患者的血清中富集,这组 miRNA 表征着肝脏特定的生物学过程并与对乙酰氨基酚的肝毒性相关33。另一项研究34探讨了 miR-122 作为 DILI 生物标志物的潜力,研究人员发现在 53 例对乙酰氨基酚过量的 DILI 患者中血清 miR-122 较对照组显著升高,更为重要的发现是在住院后的 3 7 天当 miR-122 逐渐恢复至基线水平后,此时 ALT 水平仍未恢复正常,这表明miR-122 的半衰期较短,从而使得 miR-122 比其他生物标记物能更准确地反映肝脏的病理生理状态。一个十分有趣的病例研究报道了一个非常早期的 DILI 病例,该患者 miR-122 水平升高,然而没有任何其他肝损伤的临床及实验室证据,两天后患者因发现转氨酶升高及凝血功能异常而返回医院就诊35,这些证据都表明 miR-122 水平是早期诊断 DILI 的有效标记物。除却 miR-122 的上述优点外,miR-122 的水平还与血清 ALT 存在一定的相关性,这可能在一定程度上反映了肝脏损伤的严重程度,与之前在小鼠模型中的研究结果相符29;然而,尽管 miR-122 水平与 ALT 存在一定的相关性,但却与凝血酶原时间及总胆红素水平无明显关系34,36,这似乎从另一个角度证明了 miR-122 对早期肝脏损伤诊断的灵敏性。此外,还有研究表明 miR-122 具有良好的肝脏特异性,当临床上出现与剧烈运动、多肌炎及肌肉损伤相关的非特异性转氨酶升高时,血清中的 miR-122 水平仍然保持正常,能很好的区分肝脏损伤及其他原因所致的转氨酶异常,这表明 miR-122 比 ALT、AST 等传统的标记物拥有更好的组织特异性7。除了对乙酰氨基酚之外,miR-122 还是克拉霉素34、中草药37等其他药物相关肝损伤的敏感标记物。3.2 miRNA-192miRNA-192 主要因其具有成为各种肿瘤标志物方面的潜能而在全世界范围内得到广泛关注,高通量测序技术的发展极大地促进了生物标志物的研究;随着对miRNA-192 研究的不断深入,目前已有大量文献表明其还是DILI 良好的标记物。有研究表明同 miRNA-122 一样,miRNA-192 也在肝脏组织中富集并在 DILI 的动物模型中显著增高,血清 miRNA-192 的水平也与 ALT 水平及肝组织学表现存在明显的相关性,在受到微量肝毒性药物的损伤后 miRNA-192 在早期即有明显的变化,这比传统的肝损伤标记物 ALT等更为灵敏29;在该 DILI 的小鼠模型中,当给予小鼠150mg/kg 剂量的对乙酰氨基酚后,在最初的 1h 小时 ALT 水平没有发生任何变化,而此时血清中 miRNA-192 的水平已经有了明显的升高,继续观察到给药后 3 小时血清中 ALT 水平才有了小幅增高,而此时血清 miRNA-192 的已经显著增高29。这在随后的临床研究中得到了证实,Krauskopf J et al 使用高通267实用肝脏病杂志 2023 年 9 月第 26 卷第 5 期 J Prac Hepatol,September.2023.Vol.26 No.5量测序的方法研究了对乙酰氨基酚过量患者血清中 miRNAs谱的分布,发现了 36 个高水平表达的 miRNAs,其中就有 miR-122、miR-192、miR-194、miR-210 和 miR-483 等 5 个肝脏特异性的 miRNAs,它们与经典肝损伤标记物存在良好的相关性,进一步的研究发现在使用 N-乙酰半胱氨酸治疗后,这些miRNAs 分子的水平都有不同水平的下降33。检测 DILI 患者血清 miRNA-192 水平,他们发现与对照组相比 miRNA-192 在 DILI 患者中的水平显著增加了,两组血清中 miRNA-192 的中位数分别是 6.9 和 0.44,存在显著的差异,是一种非常有潜力的 DILI 标记物34。虽然 miRNA-192 在动物模型及临床研究中都显示了良好的应用价值,然而这些研究都仅涉及对乙酰氨基酚所致的固有型肝损伤,而在特异质型肝损伤中,情况可能有所不同,由于特异质型肝损伤难以通过动物模型及药物临床试验进行预测并且呈非剂量依耐性,因而发展特异质型肝损伤标记物显得尤为迫切38,39;有研究表明,尽管在固有型肝损伤中,miRNA-192 具有与 miRNA-122 等同的诊断价值,但在特异质型肝损伤中,仅能检测到 miRNA-122 的增加,这表明 miRNA-122 在特异质型肝损伤中诊断价值优于 miRNA-19234。研究发现 miR-192 可能作为敏感度和特异性俱佳的非侵入性的生物标志物,用于中草药物相关肝损害的诊断37,似乎表明 miR-192 的诊断价值在不同病因的特异质型肝损中存在差异。此外,还有许多研究探讨了外泌体 miRNA 作为肝损伤生物标志物的潜能40-42。有研究分析了酒精性肝炎小鼠模型中的外泌体 miRNA 谱,与对照组相比,实验组中有 9 个 miRNA 表达异常,研究者进一步使用ROC 曲线分析了这 9 个 miRNA 的诊断价值,结果发现 miR-192 的诊断价值最高,其 ROC 曲线下面积高达 0.967,显示出优异的诊断价值43。除了单个的 miRNA 标记物外,血清miRNA 谱在 DILI 的诊断上可能比单个 miRNA 具有更大的应用价值,Yamaura 使用化学或特殊饲养法建立的大鼠模型检测了急性肝损伤(肝细胞损伤或胆汁淤积)和慢性肝损伤(脂肪变性和肝纤维化)中血浆 miRNAs 的水平,他们的研究表明血浆 miRNA 的表达谱与肝损伤类型相关44,最近的研究也表明 miRNA 谱还可以用于判别不同病因所致的急性肝损伤45。这些都说明,miRNAs 可能是早期诊断 DILI 的一种灵敏标的记物,并可能参与部分 DILI 的发病机制。4 小结和展望近年来,随着对 miRNAs 研究的不断深入,已经发现许多有价值的标记物,miRNA-122 及 miRNA-192 是其中最有潜力的两个,尤其是 miRNA-122 不仅比传统的标记物拥有更好的灵敏度和特异度,甚至在肝脏损伤的超急性期就有显著的增高,是最有可能转换为临床应用的标记物。虽然 miRNAs在大量 DILI 的研究中显示出了良好的应用价值,然而真正将其转换为临床应用仍然面临许多挑战:如缺乏简便可靠的实验室检测方法、miRNAs 对不同类型的 DILI 没有特异性,并且有待于大样本量研究的进一步确认46-48。总之,miRNA-122及 miRNA-192 在 DILI 领域展示出良好的应用前景,但仍需要进行更多的研究以推动其转化为临床应用。【参考文献】1Xu HM,Chen Y,Xu J,et al.Drug-induced liver injury in hospi-talized patients with notably elevated alanine aminotransferase.World J Gastroenterol,2012,18(41):5972-5978.2Tran T,Lee WM.DILI:New insights into diagnosis and manage-ment.Curr Hepat Rep,2013,12(1):53-58.3Tarantino G,Di MMN,Capone D.Drug-induced liver injury:is itsomehow foreseeable.World J Gastroenterol,2009,15(23):2817-2833.4Ozer J,Ratner M,Shaw M,et al.The current state of serum bio-markers of hepatotoxicity.Toxicology,2008,245(3):194-205.5Lindblom P,Rafter I,Copley C,et al.Isoforms of alanine amin-otransferases in human tissues and serum-differential tissue expres-sion using novel antibodies.Arch Biochem Biophys,2007,466(1):66-77.6Mendrick DL,Daniels KK.Biomarkers of 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