实验九水中总大肠菌群的测定专家讲座.pptx

试验试验九九 水中总大肠菌群测定水中总大肠菌群测定实验九水中总大肠菌群的测定第1页一一 试验器材试验器材1 1 培养基培养基乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管）培养基、伊红美兰琼脂平板乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管）培养基、伊红美兰琼脂平板2 2 溶液和试剂溶液和试剂革兰氏染色液革兰氏染色液3 3 仪器和其它用具仪器和其它用具高压湿热灭菌器、显微镜、载玻片、灭菌培养皿、灭菌吸管、试管、三角高压湿热灭菌器、显微镜、载玻片、灭菌培养皿、灭菌吸管、试管、三角瓶、接种环瓶、接种环二二 目标要求目标要求1 1 学习检测水中总大肠菌群方法。学习检测水中总大肠菌群方法。2 2 了解检测水中总大肠菌群各种方法原理及其应用中优、缺点。了解检测水中总大肠菌群各种方法原理及其应用中优、缺点。3 3 了解水质评价微生物学卫生标准，明白其应用主要性。了解水质评价微生物学卫生标准，明白其应用主要性。试验八试验八 水中总大肠菌群测定水中总大肠菌群测定实验九水中总大肠菌群的测定第2页三三 基本原理基本原理 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧革兰氏大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要起源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标阴性无芽胞杆菌。该菌主要起源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌可能。来评价食品卫生质量推断食品中有否污染肠道致病菌可能。总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法原理是依据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备多管发酵法原理是依据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等相关特征，经过三个步骤进行检验革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等相关特征，经过三个步骤进行检验求得水样中总大肠菌群数。试验结果以最可能数简称求得水样中总大肠菌群数。试验结果以最可能数简称MPN表示。食品中表示。食品中大肠菌群数系以大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数（检样内大肠菌群最可能数（most probable number,MPN)表示。表示。实验九水中总大肠菌群的测定第3页四四 培养基配制培养基配制（1）乳糖蛋白胨培养液：按照说明称取适量培养基，溶于蒸馏水中，分）乳糖蛋白胨培养液：按照说明称取适量培养基，溶于蒸馏水中，分装于试管中，每个试管装于试管中，每个试管10ml，倒置一德汉氏小管，于，倒置一德汉氏小管，于115高压灭菌器中高压灭菌器中灭菌灭菌20min，贮存于冷暗处备用。，贮存于冷暗处备用。（2）三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：按上述制备方法配制，除蒸馏水外，三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：按上述制备方法配制，除蒸馏水外，培养基用量增加至三倍，分装于试管中，每个试管培养基用量增加至三倍，分装于试管中，每个试管5ml。（3）伊红美培养基：按照说明称取适量培养基，置于三角瓶中，加蒸馏伊红美培养基：按照说明称取适量培养基，置于三角瓶中，加蒸馏水溶解，水溶解，115高压灭菌高压灭菌15min，待冷却至，待冷却至4550，倒平板待用。，倒平板待用。培养基配制操作图示：培养基配制操作图示：实验九水中总大肠菌群的测定第4页用漏斗分装培养基及摆斜面用漏斗分装培养基及摆斜面培养基分装：培养基分装：普通制作斜面培养基时，每只普通制作斜面培养基时，每只1515015150毫米试管，约装毫米试管，约装3 34 4毫升（毫升（1/41/41/31/3试管高度），如制作深层培养基，每只试管高度），如制作深层培养基，每只2022020220毫米试管毫米试管约装约装12121515毫升。每只锥形瓶装入培养基，普通以其容积二分之一为宜。毫升。每只锥形瓶装入培养基，普通以其容积二分之一为宜。实验九水中总大肠菌群的测定第5页包扎1培养皿：以旧报纸密密包紧，普通以培养皿：以旧报纸密密包紧，普通以6套做一包，待灭菌。套做一包，待灭菌。2吸管：在距其粗头顶端约吸管：在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段处，塞一小段1.5cm长棉花。棉花长棉花。棉花要塞得松紧恰当（过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会下要塞得松紧恰当（过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会下滑），然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条近左端，与报纸约滑），然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条近左端，与报纸约呈呈60角，并将右端多出报纸打一小结。角，并将右端多出报纸打一小结。3三角玻扒：跟包扎吸管相同，将三角部分斜放在报纸条近左端，三角玻扒：跟包扎吸管相同，将三角部分斜放在报纸条近左端，与报纸约呈与报纸约呈45角，并将右端多出报纸打一小结。角，并将右端多出报纸打一小结。4.玻璃器皿、金属器械包扎完成后置干燥箱玻璃器皿、金属器械包扎完成后置干燥箱160170灭菌灭菌2 h.实验九水中总大肠菌群的测定第6页实验九水中总大肠菌群的测定第7页实验九水中总大肠菌群的测定第8页 1.1.灭菌器内加入一定量水，将用灭菌器内加入一定量水，将用防水纸包扎防水纸包扎好物品放入其中。好物品放入其中。2.2.接通电源，进行加热。接通电源，进行加热。3.3.排除高压锅内冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或排除高压锅内冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm0.5kg/cm2 2时再打开排气阀，待压力回复到时再打开排气阀，待压力回复到0 0时再时再关闭排气阀。关闭排气阀。4.4.当压力达当压力达15bl/in15bl/in2 2（即（即1.05kg/cm1.05kg/cm2 2）时，此时灭菌器内温度为）时，此时灭菌器内温度为1211210 0C C，维持，维持30min30min。对热不稳定培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，。对热不稳定培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。延长时间。5.5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。灭菌器盖，取出物品。灭菌实验九水中总大肠菌群的测定第9页高压蒸汽自动高压蒸汽自动灭菌锅灭菌锅手提式高压蒸手提式高压蒸汽灭菌锅汽灭菌锅实验九水中总大肠菌群的测定第10页倒平板操作法示意图倒平板操作法示意图斜面摆放与冷凝斜面摆放与冷凝实验九水中总大肠菌群的测定第11页五五 操作步骤操作步骤1 水样采取水样采取（1）检测自来水）检测自来水 先将自来水龙头用火焰烧灼先将自来水龙头用火焰烧灼3 min灭菌，再开放水龙头使水流灭菌，再开放水龙头使水流5 min后，后，在火焰旁打开灭菌三角瓶塞，以其接取水样，快速地进行分析。在火焰旁打开灭菌三角瓶塞，以其接取水样，快速地进行分析。（2 2）检测池水、河水或湖水）检测池水、河水或湖水 应取距水面应取距水面101015cm15cm深层水样，先将灭菌带玻璃塞空瓶瓶口向下浸入深层水样，先将灭菌带玻璃塞空瓶瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，拨开玻璃塞，水即流入瓶中，满后将玻璃塞塞好，水中，然后翻转过来，拨开玻璃塞，水即流入瓶中，满后将玻璃塞塞好，再从水中取出。有时需用特制采样器取水样。采取水样最好马上检测，不再从水中取出。有时需用特制采样器取水样。采取水样最好马上检测，不然需放入冰箱中保留。然需放入冰箱中保留。实验九水中总大肠菌群的测定第12页3 初发酵试验初发酵试验（1）生活饮用水生活饮用水 在两个装有已灭菌在两个装有已灭菌50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液大试管或烧瓶中（内有倒管），三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液大试管或烧瓶中（内有倒管），以无菌操作各加入已充分混匀水样以无菌操作各加入已充分混匀水样100mL。在。在10支装有已灭菌支装有已灭菌5mL三倍浓缩乳糖三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀水样蛋白胨培养液试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀水样10mL，混匀后，混匀后置于置于37恒温箱内培养恒温箱内培养24h。（2）水源水水源水在装有在装有5ml 3倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基试管中加入倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基试管中加入10ml水样品；水样品；于各装有于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液乳糖蛋白胨培养液5个试管中（内有倒管），分别加入个试管中（内有倒管），分别加入1mL水样；再于各装水样；再于各装有有10mL乳糖蛋白胨培养液乳糖蛋白胨培养液5个试管中（内有倒管），分别加入个试管中（内有倒管），分别加入1mL 1：10稀释水稀释水样。共计样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37恒温箱内培养恒温箱内培养48h。（能够依据水污染程度选择（能够依据水污染程度选择3个稀释度）个稀释度）实验九水中总大肠菌群的测定第13页4 分离培养分离培养 将初发酵阳性管将初发酵阳性管(产酸产气产酸产气)菌液分别划线接种于伊红美蓝琼脂培养基菌液分别划线接种于伊红美蓝琼脂培养基平板。置平板。置361温箱内，培养温箱内，培养1824h，然后取出，观察菌落形态。选择，然后取出，观察菌落形态。选择符合大肠菌群菌落特征菌落符合大肠菌群菌落特征菌落:深紫黑色，有金属光泽；深紫黑色，有金属光泽；紫黑色，不带紫黑色，不带或略带金属光泽；或略带金属光泽；淡紫红色，中心颜色较深淡紫红色，中心颜色较深,挑取一部分，进行革兰氏挑取一部分，进行革兰氏染色。染色。平板划线分离操作法示意图实验九水中总大肠菌群的测定第14页5 复发酵试验复发酵试验 上述涂片镜检菌落如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑选该菌落另一部分上述涂片镜检菌落如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑选该菌落另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液试管中（内有倒置管），每管可接种接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液试管中（内有倒置管），每管可接种分离自同一初发酵管最经典菌落分离自同一初发酵管最经典菌落13个，然后置于个，然后置于37恒温箱中培养恒温箱中培养24h，有产酸、产气者，即证实有大肠菌群存在。依据证实有大肠菌群存在阳性管有产酸产气者，即证实有大肠菌群存在。依据证实有大肠菌群存在阳性管（瓶）数查附表（瓶）数查附表1“大肠菌群检数表大肠菌群检数表”，汇报每升水样中大肠菌群数。，汇报每升水样中大肠菌群数。每组：每组：三倍浓缩乳糖蛋白胨（三倍浓缩乳糖蛋白胨（5 ml）15管管 普通浓度乳糖蛋白胨（普通浓度乳糖蛋白胨（10 ml）15管管伊红美兰培养基伊红美兰培养基 150 ml(5个平板个平板)三角瓶三角瓶1个（装个（装27mL蒸馏水灭菌）、蒸馏水灭菌）、10ml吸管吸管 2支、支、1ml吸管吸管2支包扎灭菌支包扎灭菌实验九水中总大肠菌群的测定第15页表表2 最可能数最可能数(MPN)表表（接种（接种5份份10mL水样、水样、5份份1mL水水样、样、5份份0.1mL水水样时，不一样阳样时，不一样阳性及阴性及阴 性情况下性情况下100mL水样中细水样中细菌数最可能数和菌数最可能数和95%可信限值）可信限值）实验九水中总大肠菌群的测定第16页思索题1.何谓大肠菌群？它主要包含哪些细菌属？2.假如水中有大量致病菌，如：痢疾、伤寒、霍乱等病原菌，用多管发酵法检测总大肠菌群，能否得到阳性结果？为何？3.为何接种100、10 mL水样，用是3倍 浓缩乳糖蛋白胨培养基，而接种1.、0.1、0.01、0.001 mL水样，则用乳糖蛋白胨培养基？实验九水中总大肠菌群的测定第17页