不同甘蔗品种对潮霉素B耐受性的研究.pdf

收稿日期：2023-05-16；修回日期：2023-06-23 基金项目：广东省科学院建设国内一流研究机构行动专项(2019GDASYL-0103034)；广东省科技创新战略专项资金(2022B0202160006)；广东省甘蔗剑麻产业技术体系创新团队(2023KJ104-05)；财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系资助(CARS-170112)作者简介：何慧怡(1981-)，女，硕士，高级农艺师，从事生物育种研究；E-mail：*通讯作者：陈兴龙(1988-)，助理研究员，博士，从事甘蔗育种研究 引文格式：何慧怡，陈勇生，张南南，等.不同甘蔗品种对潮霉素 B 耐受性的研究J.甘蔗糖业，2023，52(3)：15-21.甘蔗糖业甘蔗糖业 2023 年第 52 卷第 3 期，2023 年 6 月 Sugarcane and Canesugar Vol.52,No.3,Jun.2023 不同甘蔗品种对潮霉素 B 耐受性的研究 何慧怡1,2，陈勇生1,2，张南南1,2，吴嘉云1,2，王勤南1,2，高小宁1,2，黄咏虹1,2，陈兴龙1,2*(1广东省科学院南繁种业研究所，广东广州 510316；2广东省甘蔗遗传改良工程技术研究中心，广东广州 510316)摘 要：旨在探讨不同甘蔗品种对潮霉素 B 的耐受性，为甘蔗遗传转化后的筛选提供参考。以甘蔗品种新台糖 22 号与粤糖 00-236 的胚性愈伤组织与增殖阶段的组培苗为试验材料，分别接入加有潮霉素 B 5、15、25、35、45 mg/L 的愈伤分化培养基和加有潮霉素 B 15、30、45 mg/L 的繁殖培养基中。结果表明，2 个品种甘蔗对潮霉素 B 的耐受性存在差异。新台糖 22 号的愈伤组织在潮霉素 B 浓度为 45 mg/L时转绿率和成苗率分别为 12.60%和 5.20%；粤糖 00-236 转绿率和成苗率分别为 36.17%和 2.66%，2 个品种绝大部分转绿的愈伤块都不能分化成苗。潮霉素 B 浓度为 45 mg/L 时，新台糖 22 号组培苗的死亡率为76.28%，勉强存活的苗生长受到严重抑制，苗矮小叶色黄；而粤糖00-236的组培苗死亡率已达92.6%，基本停止生长。因此，在甘蔗愈伤组织分化阶段和组培苗增殖阶段选择潮霉素 B 浓度 45 mg/L 为适合的筛选浓度。关键词：甘蔗；潮霉素 B；遗传转化；耐受性 中图分类号：S566.1 文献标识码：A 文章编号：1005-9695(2023)03-0015-07 Study on the Tolerance of Different Sugarcane Varieties to Hygromycin B HE Huiyi1,2,CHEN Yongsheng1,2,ZHANG Nannan1,2,WU Jiayun1,2,WANG Qinnan1,2,GAO Xiaoning1,2,HUANG Yonghong1,2,CHEN Xinglong1,2(1Institute of Nanfan&Seed Industry,Guangdong Academy of Sciences,Guangzhou,Guangdong 510316;2Guangdong Sugarcane Genetic Improvement Engineering Center,Guangzhou,Guangdong 510316)Abstract:The hygromycin B tolerance of two sugarcane varieties was studied in this study,in order to provide the reference for the selection in sugarcane genetic transformation system.The tissue culture seedlings of the embryonic callus and proliferation stage of sugarcane varieties ROC22 and Yuetang00-236 were used as test materials.Callus differentiation medium with hygromycin B 5,15,25,35,45 mg/L,in propagation medium with hygromycin B 15,30,45 mg/L.The results showed that there were differences in the tolerance of the two varieties of sugarcane to hygromycin B.When the concentration of hygromycin B added in the medium was 45 mg/L,the rate of green callus and shoots of ROC22 was 12.60%and 5.20%,respectively.While that of Yuetang00-236 was 36.17%and 2.66%,respectively.Indicating that little shoots of Yuetang00-236 could derived from its green callus.When the concentration of hygromycin added in the medium was 45 mg/L during the stage of shoot growth,the rate of dead seedlings of ROC22 was 76.28%,the growth of the barely surviving seedlings was also severely inhibited,and the seedlings were short and the leaves were yellow;whereas the rate of dead seedlings of Yuetang00-236 was 92.60%,the seedlings basically stopped growing.Therefore,the 【糖料与糖料生产】甘蔗糖业 2023 年第 52 卷第 3 期 Sugarcane and Canesugar-16-hygromycin B concentration of 45 mg/L was the appropriate screening concentration in the stage of sugarcane callus differentiation and tissue culture seedling proliferation.Keywords:Sugarcane;Hygromycin B;Genetic transformation;Tolerance 0 前言 甘蔗(Saccharum spp.)是我国最主要的糖料作物，也是全世界最重要的糖料和能源作物，是生产燃料乙醇、糖醛、葡萄糖和一些天然化合物的重要原料1。近年来科研人员相继用农杆菌或基因枪介导的遗传转化方法成功获得了转基因甘蔗材料，为甘蔗育种提供了更为精准的途径2-8。在遗传转化过程中，高效的筛选体系是快速获得大量转化子的必要条件之一，合适的筛选剂对高效筛选体系的建立至关重要9。实用而高效的筛选体系，能有效抑制非转化细胞的生长，同时保证转化细胞的优势生长，对转化细胞的负影响较小，有利于阳性转基因植株的获得10。潮霉素 B(hygromycin B，简称 hyg)是一种氨基糖苷类抗生素，以其筛选时间短、效果显著、假阳性低、基因差异小等优点在水稻11-13、小麦14-15、玉米16-17、棉花18-19、大麦20等作物的遗传转化中得到了广泛的应用。不同物种及同一物种不同品种均对潮霉素 B 的耐受性存在一定差异9。梁水美等研究表明不同的小麦品种对潮霉素 B 的敏感性不同21。邹莉等研究表明不同品种大豆对潮霉素 B 的敏感性不同22。王丹等研究表明对同一品种的杨树，由于所用的外植体部位不同，或生长阶段不同对潮霉素 B 的反应也是不同的23。王晓春等研究表明菊花对潮霉素 B 的敏感性在品种间存在差异，来自同一品种菊花不同部位的外植体对潮霉素 B 的反应不同24。因此，确定潮霉素 B 对甘蔗的合适筛选浓度对甘蔗遗传转化过程中提高筛选效率就显得尤为重要。近年来也有研究人员做了相关的实验来确定潮霉素 B 对甘蔗的筛选浓度，邓智年等在研究过程中发现，甘蔗新台糖 25 号的外植体接种 30 天后，在含 50 mg/L 潮霉素 B 的 M1、M2 培养基上的愈伤组织、芽苗均死亡；在含 30 mg/L 潮霉素 B 的 M3 培养基上的幼苗均未长根6。姚丽等研究发现甘蔗新台糖22在相同浓度不同培养基中潮霉素B毒性作用不同，在愈伤分化培养基内的毒性作用比在诱导培养基内更快、效果更好25。确定潮霉素 B 对甘蔗筛选的合适浓度对甘蔗遗传转化过程中提高筛选效率非常重要。本文从潮霉素 B 对 2 个生产用甘蔗品种新台糖 22 号和粤糖 00-236 的愈伤组织和组培小苗生长状态的影响进行量化分析，找出适合潮霉素 B对甘蔗的适合筛选浓度。1 材料与方法 1.1 试验材料 甘蔗生产性品种新台糖 22 号与粤糖 00-236 的胚性愈伤组织与增殖阶段的组培苗。1.2 试验方法 1.2.1 甘蔗愈伤组织分化阶段对潮霉素 B 的耐受性试验 将新台糖 22 号和粤糖 00-236 的胚性愈伤组织分别接入加有潮霉素 B 5、15、25、35、45 mg/L 的愈伤分化培养基，其中对照组不加。每皿培养基接入 2025 块愈伤组织，每个浓度接 5 皿，设 3 个重复。愈伤分化培养基为：MS 培养基+糖 30 g/L+6-苄氨基嘌呤 0.5 mg/L+琼脂 6 mg/L，pH 5.8。温度 281，每天光照培养 14 h。在培养的第 30 天调查愈伤组织的转绿率和成苗率。愈伤组织的转绿率=颜色转绿的愈伤组织块数/接入的愈伤组织总块数100%，愈伤组织的成苗率=分化成苗的愈伤组织块数/接入的愈伤组织总块数100%。1.2.2 甘蔗增殖阶段组培苗对潮霉素 B 的耐受性试验 将长势一致的新台糖 22 号和粤糖 00-236 增殖阶段组培苗分别接入加有潮霉素 B 15、30、45 mg/L的繁殖培养基，其中对照组不加。每瓶培养基接入3 丛小苗，每个浓度接 5 瓶，设 3 个重复。繁殖培养基为 MS 培养基+糖 30 g/L+6-苄氨基嘌呤 1.0 mg/L+琼脂 6 mg/L，pH 5.8。温度 281，每天光照培养 14 h。在培养的第 30 天调查小苗的假茎长，叶长和死亡率。假茎长为苗的基部到最高可见叶片肥厚带的高度，叶长为展开叶片的肥厚带到末端的长度，死亡率=死亡的丛苗数/接入的丛苗总数100%。2 结果与分析 2.1 甘蔗愈伤组织分化阶段对潮霉素 B 的耐受性分何慧怡等：不同甘蔗品种对潮霉素 B 耐受性的研究-17-析 方差分析结果表明，2 个甘蔗品种的愈伤组织在加有潮霉素 B 5、15、25、35、45 mg/L 的愈伤分化培养基中，不同处理的转绿率和成苗率均达到了显著性差异(表 1)。2 个不同品种的甘蔗愈伤组织随着潮霉素 B 浓度的升高，转绿率和成苗率都呈现下降趋势(图 1)。从转绿率看，2 个品种的甘蔗愈伤组织对潮霉素 B 的耐受程度存在差异。新台糖 22 号在潮霉素 B 浓度为 25 mg/L 时显著下降，到 45 mg/L时转绿率只有 12.6%；而粤糖 00-236 在潮霉素 B 浓度为 15、25、35 mg/L 时转绿率差异不显著，当升高到 45 mg/L 时转绿率下降到 36.17%。而从成苗率看，新台糖 22 号在潮霉素 B 浓度为 5 和 15 mg/L 时差异不显著，成苗率在 63.16%71.43%之间变化，当潮霉素 B 浓度升到 25 mg/L 时成苗率开始大幅度下降，到 45 mg/L 时成苗率只有 5.2%。而粤糖 00-236的成苗率在 15 mg/L 时已开始显著下降，到 45 mg/L时成苗率只有 2.66%。在本次试验中潮霉素 B 浓度为 45 mg/L 时 2 个品种绝大部分转绿的愈伤块都不能分化成苗，因此在甘蔗愈伤组织分化阶段可选择潮霉素 B 浓度 45 mg/L 为适合的筛选浓度。2.2 甘蔗增殖阶段组培苗对潮霉素 B 的耐受性试验 表 1 新台糖 22 号和粤糖 00-236 愈伤分化显著性分析 变异来源 自由度 新台糖 22 号 粤糖 00-236 转绿率(%)成苗率(%)转绿率(%)成苗率(%)均方 F 值 均方 F 值 均方 F 值 均方 F 值 因素 5 1560.92 366.69*1768.13 598.98*442.85 189.09*1445.53 787.41*误差 12 4.26 2.95 2.34 1.84 总因素 17 注：*表示 P0.01，下同。注：同一性状值(即同一条曲线)不同小写和大写字母分别表示差异显著(P0.05)和极显著(P0.01)，下同。图 1 不同潮霉素 B 处理浓度下新台糖 22 号和粤糖 00-236 转绿率(%)、成苗率(%)的变化情况 新台糖 22 号和粤糖 00-236 增殖阶段组培苗在不同浓度潮霉素 B 处理下假茎长、叶长和死亡率差异显著(表 2)。2 个甘蔗品种的组培苗 0、15、30、45 mg/L 4 个水平潮酶素 B 处理下的假茎长、叶长和死亡率均达到了显著性差异，说明不同浓度下潮霉素 B 对 2 个甘蔗品种组培苗的生长均产生了显著影响(图 2、图 3)。随着潮霉素 B 浓度的增加 2 个品种组培苗的生长均受到不同程度的抑制，假茎缩短苗变得矮小，叶片卷曲伸展受阻(图 4)。同一潮霉素 B浓度处理 2 个品种组培苗的生长受抑制程度存在差异，潮霉素 B 浓度为 30 与 45 mg/L 时新台糖 22 号的叶长和假茎长达到显著差异，说明在潮霉素 B 浓度为 30 mg/L 时新台糖 22 号组培苗虽受到抑制但仍有生长；而粤糖 00-236 的叶长和假茎长在这 2 个浓粤糖 00-236 转绿率 粤糖 00-236 成苗率 潮霉素浓度(mg/L)甘蔗糖业 2023 年第 52 卷第 3 期 Sugarcane and Canesugar-18-度下几乎没有什么变化，说明粤糖 00-236 在潮霉素B 浓度为 30 mg/L 时已经严重受抑制基本不能生长了。死亡率方面，在潮霉素 B 浓度为 15 mg/L 时 2个品种组培苗的死亡率均为 0%，当浓度升高到 30 mg/L 时新台糖 22 号组培苗的死亡率为 34.28%；粤糖 00-236 的死亡率为 51.8%，已超过半数的苗死亡。当浓度升到 45 mg/L 时，新台糖 22 号组培苗的死亡率为 76.28%，勉强存活的苗生长也严重受抑制，苗矮小叶色黄；而粤糖 00-236 的组培苗死亡率已达92.6%，基本停止生长。结合上述指标来看，潮霉素B 浓度为 30 mg/L 时粤糖 00-236 的生长虽然已经严重受抑制，但是致死率只有一半左右，而当潮霉素B 浓度升到 45 mg/L 时，2 个甘蔗品种的组培苗都停止生长并且大部分死亡，勉强存活下来的苗叶色发黄，基部褐化，仅存 12 片黄绿色的叶子，因此在甘蔗组培苗增殖阶段选择潮霉素 B 浓度 45 mg/L 为适合的筛选浓度。3 讨论 表 2 新台糖 22 号和粤糖 00-236 组培苗假茎长、叶长和死亡率方差分析的各项均方值 变异来源 自由度 新台糖 22 号 粤糖 00-236 假茎长(mm)叶长(mm)死亡率(%)假茎长(mm)叶长(mm)死亡率(%)因素 3 8.34*61.14*2650.23*3.90*20.35*4266.17*误差 8 0.01 0.14 0.88 0.02 0.07 34.95 总因素 11 图 2 不同潮霉素 B 处理浓度下新台糖 22 号和粤糖 00-236 组培苗假茎长(mm)、叶长(mm)的变化情况 图 3 不同潮霉素 B 处理浓度下新台糖 22 号和粤糖 00-236 组培苗死亡率的变化情况 潮霉素浓度(mg/L)潮霉素浓度(mg/L)粤糖 00-236 假茎长 粤糖 00-236 叶长 新台糖 22 号死亡率 粤糖 00-236 死亡率 何慧怡等：不同甘蔗品种对潮霉素 B 耐受性的研究-19-注：AD 分别为新台糖 22 号组培苗在潮霉素 B 浓度为 0、15、30、45 mg/L 的繁殖培养基中培养 30 天后的生长情况；EH 分别为粤糖 00-236 组培苗在潮霉素 B 浓度为 0、15、30、45 mg/L 的繁殖培养基中培养 30 天后的生长情况。图 4 不同潮霉素 B 处理浓度下新台糖 22 号和粤糖 00-236 组培苗的生长情况 不同作物、不同部位及不同培养阶段或同一作物相同材料的不同品种对潮霉素 B 的耐受性不同，因此筛选出合适的抗性标记浓度既能有效抑制非转化细胞生长又对转化细胞影响较小的筛选剂敏感浓度，不仅能降低假阳性而且能减少转化苗的损失，是获得较高的转化效率植物转基因过程中的重要一步26-27。在甘蔗愈伤诱导阶段，李瑞美等研究发现当潮霉素 B 浓度为 50 mg/L 时，果蔗拔地拉愈伤组织的成活率仅为 6%，呈水渍糊状死亡或棕褐色枯死，分化培养时愈伤组织几乎不发生分化，说明 50 mg/L是潮霉素作为果蔗胚性愈伤组织遗传转化筛选的最佳浓度28。邓智年等研究发现新台糖 25 号的愈伤组织和小苗接种在含 50 mg/L 潮霉素 B 的培养基上 30天后，愈伤组织、芽苗均死亡，而对照则生长正常。因此，选择潮霉素 B 浓度 50 mg/L 为愈伤组织生长阶段、芽分化及芽生长阶段的筛选浓度6。姚丽等研究发现潮霉素B对甘蔗新台糖22号的愈伤组织的分化有更强烈的毒性作用。当潮霉素 B 为 30 mg/L时，15天内全部褐化死亡；当潮霉素B浓度增至40、50 mg/L，愈伤组织 10 天内全部死亡。因此选择 30 mg/L 的潮霉素 B 作为甘蔗遗传转化时芽分化阶段的筛选浓度。本试验发现无论是在愈伤组织分化阶段还是甘蔗组培苗增殖阶段，2 个甘蔗品种对潮霉素 B 的耐受性均有所差异。新台糖 22 号在潮霉素B 浓度为 25 mg/L 时成苗率开始大幅度下降，而粤糖 00-236 的成苗率在 15 mg/L 时已开始显著下降。当潮霉素 B 浓度为 45 mg/L 时新台糖 22 号和粤糖00-236 的成苗率分别只有 5.2%和 2.66%，2 个品种绝大部分转绿的愈伤块都不能分化成苗。在甘蔗组培苗增殖阶段，潮霉素 B 浓度为 30 mg/L 时新台糖22 号的组培苗虽受到抑制但仍有生长，而粤糖00-236 的小苗生长已经严重受抑制而无法生长了。当潮霉素 B 浓度升高到 45 mg/L 时新台糖 22 号和粤糖 00-236的组培苗的死亡率分别为 76.28%和 92.6%，甘蔗糖业 2023 年第 52 卷第 3 期 Sugarcane and Canesugar-20-2个甘蔗品种的组培苗都停止生长并且大部分死亡，勉强存活的苗生长均收到严重抑制，苗叶色发黄，基部褐化，仅存 12 片黄绿色的叶子，因此甘蔗愈伤组织分化阶段和组培苗增殖阶段选择潮霉素 B 浓度45 mg/L为适合的筛选浓度，试验结论与李瑞美、邓智年及姚丽的研究结果相仿。虽然随着潮霉素 B浓度的升高可更有效地抑制非抗性材料的正常生长，但是高浓度的筛选剂是否会对已转化的细胞产生毒害尚需进一步试验去探究，在还没有实验结果去论证之前，选择一个有效抑制绝大部分非转化细胞正常生长的浓度作为适合的筛选剂浓度仍是首选。笔者在试验过程中发现潮霉素 B 对甘蔗愈伤组织的生长也有影响，但是比较难用肉眼可统计的具体量化指标去衡量，愈伤组织的死亡与否也不好用眼睛直接判断,所以在甘蔗愈伤组织的培养阶段可参考分化阶段选出的合适浓度作为筛选浓度。另也有研究人员用梯度浓度对转化植株进行筛选，吴转娣等采用浓度梯度为 10.0、20.0、30.0、40.0 mg/L 的潮霉素 B 对转化植株进行筛选，获得转有抗虫基因的抗性甘蔗植株4。这种方法工作量会加大，但可以最大限度地保证抗性植株能存活下来，而假阳性率是否会提高则需要进一步试验去探讨。参考文献 1 陈如凯.现代甘蔗遗传育种M.北京：中国农业出版社，2010.2 长孙东亭，罗素兰，陈如凯，等.基因枪法介导 GNA基因遗传转化甘蔗的研究J.生物技术，2006，16(3)：51-55.3 陈利平，陈平华，陈忠伟，等.甘蔗黄叶病毒与花叶病毒 CP 基因 RNAi 载体构建与转化甘蔗研究J.热带作物学报，2016，37(1)：99-106.4 吴转娣，吴才文，曾千春，等.Cry1Ac 和 sck 双价抗虫基因遗传转化甘蔗的研究J.热带作物学报，2014，35(11)：2236-2242.5 滕峥，李鸣，崔永祯，等.农杆菌介导冷调节基因(Cbcor15a)遗传转化甘蔗体系的建立J.南方农业学报，2014，45(8)：1333-1339.6 邓智年，魏源文，黄诚梅，等.融合杀虫基因对甘蔗的遗传转化J.南方农业学报，2012，43(8)：1086-1089.7 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