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,N o 检测分析 收稿日期:;修回日期:作者简介:栾杰(),女,主管技师,主要从事卫生理化检测工作.通讯作者:林海潮(),男,工程师,主要从事食品检测工作.d o i:/j i s s n 份玉米中类真菌毒素检测及污染情况分析栾杰,陈姗姗,林海潮,里南,刘红兵(云南省疾病预防控制中心,云南 昆明 ;陕西省产品质量监督检验研究院,陕西 西安 ;青岛普瑞邦生物工程有限公司,山东 青岛 )摘要:建立了玉米的一步法提取类真菌毒素同时检测的分析方法,共分析了 份玉米中类真菌毒素的污染情况及地域分布情况,为监测饲料质量提供技术指导.称取的样品添加类真菌毒素同位素内标,以 乙腈水和 甲醇水作为提取试剂,以mm o l/L乙酸铵 甲酸水溶液和甲醇/乙腈和水为流动相梯度洗脱,采用液相色谱串联质谱进行检测.份玉米中类真菌毒素的检出率为,单种毒素检出率最高的是伏马毒素B和B,高达,呕吐毒素和赭曲霉毒素A检出率最低,均未检出.伏马毒素B和B、黄曲霉毒素B、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的最高残留量分别是 m g/k g、mg/k g、m g/k g和 m g/k g.地域分布上具有分布范围广,污染较严重的特点.建立的类真菌毒素检测方法操作简单、结果准确,结果分析对玉米中真菌毒素污染检测和防控具有重要意义.关键词:真菌毒素;液相色谱串联质谱;污染情况;真菌毒素同位素内标中图分类号:S ;文献标志码:A文章编号 ()D e t e c t i o na n dp o l l u t i o na n a l y s i so f m y c o t o x i n s i n m a i z e s a m p l e sL UANJ i e,CHE NS h a n s h a n,L I N H a i c h a o,L IN a n,L I U H o n g b i n g(Y u n n a nC e n t e r f o rD i s e a s eC o n t r o l a n dP r e v e n t i o n,K u n m i n g ,C h i n a;S h a a n x i I n s t i t u t eo fP r o d u c tQ u a l i t yS u p e r v i s i o na n dI n s p e c t i o n,X i a n ,C h i n a;Q i n g d a oP r e b a n gB i o l o g i c a lE n g i n e e r i n gC o L T D Q i n g d a o ,C h i n a)A B S T R A C T:Ao n e s t e pm e t h o d f o r e x t r a c t i o na n dd e t e c t i o no f t y p e so fm y c o t o x i n s f r o mc o r nw a s e s t a b l i s h e d T h e c o n t a m i n a t i o na n dg e o g r a p h i c a l d i s t r i b u t i o no f t y p e so fm y c o t o x i n s i n s a m p l e so f c o r nw e r ea n a l y z e d,w h i c hp r o v i d e dt e c h n i c a l g u i d a n c e f o rm o n i t o r i n gf e e dq u a l i t y S i xk i n d so fm y c o t o x i ni s o t o p e sw e r ea d d e dt ot h es a m p l e s,a c e t o n i t r i l ew a t e ra n d m e t h a n o lw a t e rw e r eu s e da se x t r a c t i o nr e a g e n t s,mm o l/La mm o n i u ma c e t a t e f o r m i ca c i da q u e o u ss o l u t i o na n dm e t h a n o l/a c e t o n i t r i l ea n dw a t e rw e r eu s e da sm o b i l ep h a s eg r a d i e n te l u t i o n,a n dl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t a n d e m m a s ss p e c t r o m e t r yw a su s e df o rd e t e c t i o n T h ed e t e c t i o nr a t eo f m y c o t o x i n s i n c o r ns a m p l e sw a s,t h eh i g h e s ts i n g l et o x i nd e t e c t i o nr a t ew a s f u m o n a t o x i nBa n dB,u pt o,v o m i t o x i na n do c h r a t o x i nAw e r e t h e l o w e s t,a n dn o n ew e r ed e t e c t e d T h eh i g h e s t r e s i d u e l e v e l so f f u m o n i t o x i nBa n dB,a f l a t o x i nB,z e a r a l e n o n ea n dv o m i t o x i nw e r e m g/k g,mg/k g,m g/k ga n d m g/k g,r e s p e c t i v e l y T h eg e o g r a p h i c a l d i s t r i b u t i o nh a s t h e c h a r a c t e r i s t i c so fw i d ed i s t r i b u t i o na n ds e r i o u sp o l l u t i o n T h ee s t a b l i s h e dm e t h o d s f o r t h ed e t e c t i o no f s i xm y c o t o x i n s a r e s i m p l e a n da c c u r a t e,a n d t h e a n a l y s i so f t h e r e s u l t s i so f g r e a t s i g n i f i c a n c e f o r t h ed e t e c t i o na n dc o n t r o l o fm y c o t o x i np o l l u t i o n i nm a i z e K E YWO R D S:m y c o t o x i n;L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y t a n d e mm a s s s p e c t r o m e t r y;p o l l u t i o n s i t u a t i o n;m y c o t o x i n i s o t o p ei n t e r n a l s t a n d a r d真菌毒素属于真菌的代谢产物,几乎可以污染所有的农作物,会损害动物体的肝脏、肾脏及皮肤组织等,进而通过食物链的形式影响到人体的健康.已知的真菌毒素多达 种以上,目前多个国家均建立了饲料中真菌毒素的限量要求 ,我国已于 年推出国家强制性标准G B 饲料卫生标准,并于 年实施,其对黄曲霉毒素B、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏马毒素B和B、T 毒素等做出明确的检测方法规定和限量要求.本试验采用 份玉米为样本,对这类 栾杰等:份玉米中类真菌毒素检测及污染情况分析/年第期真菌毒素进行检测方法开发和污染情况分析.为多毒素的快速检测提供技术支持的同时,也为饲料中真菌毒素污染的监测和防控提供帮助.本试验采用液相色谱串联质谱,通过加入同位素内标进行校正的手段,开发类真菌毒素的检测方法,并对 份玉米样品进行类真菌 毒素的 检 测 及 污 染 情 况分析.材料 仪器T S QQ u a n t i s液相色谱串联质谱、K S D E超声波提取仪和T G L M高速冷冻离心机.试剂真菌毒素标准品:黄曲霉毒素B(货号:S T D )、呕吐毒素(货号:S T D )、玉米赤霉烯酮(货号:S T D )、赭曲霉毒素A(货号:S T D )、伏 马 毒 素B和B(货 号:S T D )和T 毒素(货号:S T D ).真菌毒素同位素内标:黄曲霉毒素B同位素内标(货号:S T D U)、呕吐毒素同位素内标(货号:S T D U)、玉米赤霉烯酮同位素内标(货号:S T D U)、赭曲霉毒素A同位素内标(货号:S T D U)、伏马毒素B同位素内标(货号:S T D U)、伏马毒素B同位素内标(货号:S T D U)和T 毒素同位素内标(货号:S T D U).样品 份玉米地域分布(样品来源于全国近 个省份及地区)见表.份玉米种类涉及青农 、郑单 、万盛 、登海W 、洛玉、中选 等.表 份玉米的分布区域区域省份份数华东地区山东、江苏、安徽、浙江、福建、上海 华南地区广东、广西、海南 华中地区湖南、湖北、河南、江西 华北地区北京、天津、河北、山西、内蒙古 西南地区四川、云南、西藏、重庆 西北地区宁夏、新疆、青海、陕西、甘肃 东北地区黑龙江、吉林、辽宁 方法 色谱及质谱条件色谱柱:H y p e r s i lG O L DC(mm).流动相:mm o l/L乙酸铵 甲酸水溶液(溶液A)和甲醇梯度洗脱伏马毒素B和B、黄曲霉毒素B、赭曲霉毒素A和T 毒素/乙腈水梯度洗脱呕吐毒素和玉米赤霉烯酮(见表、表).采用E S I离子源,分别用正离子模式扫描和负离子模式扫描,多反应监测模式(MRM)采集数据,类真菌毒素及其对应同位素内标的质谱参数见表.表梯度表时间/m i n流速/m lm i n溶液A/甲醇/表梯度表时间/m i n流速/m lm i n水/乙腈/表类真菌毒素及其对应同位素内标的质谱参数毒素名称母离子(m/z)子离子(m/z)碰撞电压/V射频透镜电压/V采集模式F B /MH C F B /MHF B /MH C F B /MHA F B /MH C A F B /MHO T A /MH C O T A /MHT /MNH C T /MNHD ON /MH C D ON /MHZ ON /MH C Z ON /MH注:F B为伏马毒素B简写,F B为伏马毒素B简写,A F B为黄曲霉毒素B简写,O T A为赭曲霉毒素A简写,T 为T 毒素简写,D ON为呕吐毒素简写,Z ON为玉米赤霉烯酮简写;C为其相应的同位素内标简写.栾杰等:份玉米中类真菌毒素检测及污染情况分析/年第期 标准品的配制 混合标准品配制配制伏马毒素B和B质量浓度为 m g/L、黄曲霉毒素B质量浓度为 mg/L、玉米赤霉烯酮质 量 浓 度 为 m g/L、呕 吐 毒 素 质 量 浓 度为 m g/L、T 毒素质量浓度为 m g/L、赭曲霉毒素质量浓度为 mg/k g的混标.同位素内标配制配制伏马毒素B和B质量浓度为 mg/L、黄曲霉毒素B质量浓度为mg/L、玉米赤霉烯酮质量浓度为 mg/L、呕吐毒素质量浓度 mg/L、T 毒素质量浓度 mg/L、赭曲霉毒素质量浓度 mg/L的同位素内标混合标准品.基质标准曲线配制配制黄曲霉毒素B质量浓度为 、和 mg/L;赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T 毒素质量浓度为、和 mg/L;呕吐毒素、伏马毒素B和B质量浓度为、和 mg/L.取m l氮吹近干,加入m l空白玉米提取液,混匀,过固相萃取小柱.样品处理称取g样品各份,加入同位素内标 ml,其 中 一 份 加 入 m l 乙 腈 水,另 一 份 加入 m l 甲 醇 水,超 声 波 震 荡 提 取 m i n,r/m i n离心m i n,上清液过 mm有机滤膜,液相色谱串联质谱检测.国标样品处理称取g样 品,挤 入 m l 乙 腈 水(含 的 甲 酸),涡 旋 混 匀,震 荡 提 取 m i n,于 r/m i n离心m i n,取上清液m l过固相萃取小柱,收集滤液待测.结果分析 谱图A F B、T 、Z ON、O T A、F B、F B外标及同位素内标的S RM图见图图.图A F B外标及同位素内标的S RM图图T 外标及同位素内标的S RM图 栾杰等:份玉米中类真菌毒素检测及污染情况分析/年第期图D O N外标及同位素内标的S RM图图Z O N外标及同位素内标的S RM图图O T A外标及同位素内标的S RM图栾杰等:份玉米中类真菌毒素检测及污染情况分析/年第期 图F B外标及同位素内标的S RM图图F B外标及同位素内标的S RM图 回收率(见表)表类真菌毒素的回收率项目F BF BA F BZ OND ONT O T A添加水平 n g/g n g/g n g/g n g/g n g/g n g/g n g/g回收率 线性关系(见表)表类真菌毒素的线性关系项目相关系数线性范围/n g线性方程F B y x F B y x A F B y x Z ON y x D ON y x T y x O TA y x 两种方法结果对比 阴性结果对比对 份玉米的类真菌毒素的两种检测结果进行分析汇总,两种方法各得到 个数据,未检出数量 个,且两种方法未检出样品一一对应.阳性结果对比对 份玉米的类真菌毒素的两种检测结果进行分析汇总,两种方法各得到 个数据,有检出的数据 个,对两种方法的这 个数值进行偏差分析,偏差以内共计 个,偏差 以内 栾杰等:份玉米中类真菌毒素检测及污染情况分析/年第期 个,偏差 以内 个,偏差 以内个,两种方法所有数据偏差均未超 总结通过对比两种方法所有未检出样品均能一一对应;有检出样品的偏差均在 以内,可用该方法检测玉米样品中的类真菌毒素.整体污染情况对 份玉米的类真菌毒素检测结果进行分析汇总,所有样品均未检出赭曲霉毒素和T 毒素.份玉米中有份玉米不含有这类真菌毒素,份玉米只含有类真菌毒素,份玉米含有类真菌毒素,份玉米含有类真菌毒素,份玉米含有类真菌毒素.区域分布情况依据 份样品分布区域进行划分,对种真菌毒素进行分析汇总(见表),西北地区玉米受真菌毒素污染的种类最少,污染程度最低;华中地区、华北地区、西南地区和东北地区毒素污染情况较重;华东地区和华南地区玉米受真菌毒素污染的种类和程度最高.表种真菌毒素区域分布情况毒素种类华东华南华中华北西南西北东北总计 总计 从地域分布看,毒素污染整体趋势是从西北到东南逐渐加重,受污染玉米比重增加,毒素污染种类也增多.主要还是跟气候潮湿程度有关以及温度有关.因此,应加大炎热潮湿地区的粮食及饲料中真菌毒素的检测.超限情况 对 份玉米的类真菌毒素检测结果进行分析汇总依据G B 饲料卫生标准 限量要求进行超限判断(见表),超限样品共计 份,其中份样品一类真菌毒素超限,剩余份样品两类真菌毒素超限.针对赭曲霉毒素和T 毒素含量,所有样品均合格;此外,其余毒素超限情况如下:伏马毒素BB、黄曲霉毒素B、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的超限样品份数分别为:份、份、份和份,其对应的超限率分别为 、和 .表部分饲料原料中类真菌毒素检测标准及限量要求项目产品名称检测标准限量黄曲霉毒素B玉米加工产品、花生饼(粕)NY/T mg/k g赭曲霉毒素A谷物及其加工产品G B/T mg/k g玉米赤霉烯酮玉米及其加工产品NY/T m g/k g呕吐毒素植物性饲料原料G B/T m g/k gT 毒素植物性饲料原料NY/T m g/k g伏马毒素BB玉米及其加工产品NY/T m g/k g 对 份玉米的类真菌毒素检测结果进行分析汇总依据G B 食品安全国家标准食品中真菌毒素限量 要求进行超限判断(见表),超限样品共计 份,其中 份样品一类真菌毒素超限,剩余 份样品两类真菌毒素超限.针对赭曲霉毒素含量,所有样品均合格;此外,其余毒素超限情况如下:黄曲霉毒素B、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的超限样品份数分别为:份、份和 份,其对应的超限率分别为 、和 .表部分食品中类真菌毒素检测标准及限量要求项目食品类别检验方法限量黄曲霉毒素B玉米、玉米面及玉米制品G B mg/k g赭曲霉毒素A谷物及其制品G B mg/k g玉米赤霉烯酮玉米、玉米面(渣、片)G B mg/k g呕吐毒素玉米、玉米面(渣、片)G B mg/k g 单类毒素分析由于所有样品均未检出赭曲霉毒素和T 毒素,故只对其余类真菌毒素进行单独分析.伏马毒素B和伏马毒素B对 份玉米的伏马毒素B和伏马毒素B检测结果进行分析汇总,有检出样品数量为 份,占比 ,检测结果在 m g/k g,中位值为 m g/k g;整体污染水平为 m g/k g,阳性污染水平为 m g/k g.黄曲霉毒素B对 份玉米的黄曲霉毒素B检测结果进行分析汇总,有检出样品数量为 份,占比 ,检测结果在 mg/k g,中位值为 mg/k g;整体 污 染 水 平 为 mg/k g,阳 性 污 染 水 平为 mg/k g.(下转第 页)胡蓉等:高温溶剂萃取滤袋法快速测定油料、饼粕中粗脂肪含量的方法研究/年第期 结论本研究建立了高温溶剂萃取滤袋法测定油料、饼粕中粗脂肪含量的测定方法,与常规索式抽提法相比,高温溶剂萃取滤袋法具有方法耗时短、有机溶剂用量少且同批次处理样品量多的优点,可以弥补常规索式抽提法的方法耗时长、有机溶剂用量大且同批次处理样品量少的缺点,经济环保、安全性高和简便高效.高温溶剂萃取滤袋法的方法精密度在 ,与索式抽提法的方法相对相差结果在 ,表明方法的精密度高且稳定性好.高温溶剂萃取滤袋法能满足快速、结果准确、精度高的要求,适用于油料、饼粕样品中粗脂肪含量的快速批量测定.参考文献李巧琪,马盛龙,罗浩,等饲料中粗脂肪含量的测定研究J广东化工,():何凤芹,李拥军,林庆昶,等国家标准法和 快速溶 剂 萃 取(A S E)法对饲料中粗脂肪含量的测定效果比较J畜牧与饲料科学,():尤梦圆,苏宇辰,王凤香,等滤袋法测定油料及粕含油量的研究J中国油脂,():曹玉华,杨慧萍,孙香玲几种油料粗脂肪测定方法的对照J中国油脂,():张凤枰,冉莉,张蓉健,等粮食、油料及饲料粗脂肪测定方法比较J粮食储藏,():李旺,王占彬,武晓红几种粗脂肪测定方法的优缺点J四川畜牧兽医,():金凯,丁萍,蔡燕斌索氏抽提仪测定粗脂肪的方法研究J现代食品,():国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会植物油料含油量测定:G B/T S北京:中国标准出版社国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会动物饲料 试样的制备:G B/T S北京:中国标准出版社 国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局食品安全国家标 准 食品中脂肪 的测定:G B S北京:中国标准出版社 万延岩,柳建,高爽大豆含水量和粉碎细度对索式抽提法测粗脂肪 含量的影响J口岸 卫 生 控 制,():张愉佳,张伟,佟庆龙进口大豆粉碎细度对索式抽提法粗脂肪含量的影响J粮食储藏,():楚屹然,郭静,卢美娟索氏抽提法测美国大豆粗脂肪含量的影响因素分析J现代食品,():李帅,贺群岭,雷红霞,等不同检测方法对花生粗脂肪含量的检测分析J粮食科技与经济,():马莉,刘大伟,刘超群饲料用大豆粕粗脂肪含量测定不同方法的比较J农业与技术,():周需要,曾嘉荣,邱代飞索氏抽提油重法与自动脂肪仪酸水解法测定饲料 粗 脂 肪 含 量 的 比 较 J广 东 饲 料,():(责任编辑:梅竹)(上接第 页)玉米赤霉烯酮对 份玉米的玉米赤霉烯酮检测结果进行分析汇总,有检出样品数量为 份,占比 ,检测结 果 在 m g/k g,中 位 值 为 m g/k g;整体污染水平为 m g/k g,阳性污染水平为 m g/k g.呕吐毒素对 份玉米的呕吐毒素检测结果进行分析汇总,有检出样品数量为 份,占比 ,检测结果在 m g/k g,中位值为 m g/k g;整体污 染 水 平 为 m g/k g,阳 性 污 染 水 平为 m g/k g.讨论目前,从技术角度讲,饲料中真菌毒素检测共涉及到大类,检测标准项,前处理方法不一,净化产品各异,对人员、操作、设备要求苛刻,给检测带来严峻的挑战;从污染源分析,一种真菌可能产生多种毒素,一种原料会受到多种真菌感染,往往是单个饲料样品需要检测多种真菌毒素;从现实情况来看,饲料受真菌毒素污染情况较严重,且分布不均匀,需要加强其毒素监测.本文所述的一步法检测,采用直提的方式,同位素校正的手段,在保证结果准确的前提下,最大程度降低操作难度,缩短检测周期,同时也控制了实验成本.综上,本研究不仅为饲料中类真菌毒素的检测提供有效的方法支撑,同时也为饲料中真菌毒素残留的检测方向提供指导,为保证饲料产品的质量提供帮助.参考文献王艳霞饲料及原料中真菌毒素的危害、降解和检测技术研究J饲料研究,():孙梅峰,豆小文,张磊,等真菌毒素毒性及其在生物样本中检测技术研究进展J中国药理学与毒理学杂志,():张徽,孙金旺,刘媛,等农产品真菌毒素污染生物控制关键技术创新与应用J中国科技成果,():(责任编辑:刘斌嘉)