1株布氏乳杆菌的益生特性及其安全性研究.pdf

试验研究2023年第44卷第17期 总第686期1 株 布 氏 乳 杆 菌 的 益 生 特 性 及 其 安 全 性 研 究 石 艳1 彭 昊2 李 珣1 李 军2 李常挺2 白慧丽2 马春霞2 廖玉英2*（1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004；2.广西兽医研究所，广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001）摘 要：为了筛选抗菌效果好、益生特性优良的益生菌制剂，试验测定已分离鉴定出的布氏乳杆菌GXNN20210328-6（以下简称GX0328-6）的体外抑菌效果、生长曲线、产酸能力、耐受性及小鼠安全性以评估其益生特性及安全性。结果表明：GX0328-6对鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌均有抑菌效果，尤其对鼠伤寒沙门氏菌抑菌效果最强；pH=2.5强酸环境下6 h、60 高温环境下90 min，GX0328-6活菌数均在1106 CFU/mL以上；在0.5%高胆盐浓度下2 h保持存活率在50%以上（57.14%）；小鼠安全性试验显示，GX0328-6对小鼠的饮食、生理及精神状态均无不良影响，对小鼠的体重及免疫器官指数均无显著影响（P0.05）。此外，与CON组小鼠相比，LB组小鼠肝脏及肠道均未有损伤，提示GX0328-6对小鼠具有安全性。综上，GX0328-6具有良好的益生特性及安全性。本研究可为益生菌作为饲料添加剂提供一定的理论基础。关键词：益生菌；布氏乳杆菌；益生特性；安全性；耐受性doi:10.13302/ki.fi.2023.17.017中图分类号：S816.7 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）17-0098-07Study on The Probiotic Properties and Safety of a Lentilactobacillus buchneri StrainSHI Yan1 PENG Hao2 LI Xun1 LI Jun2 LI Changting2 BAI Huili2 MA Chunxia2 LIAO Yuying2*(1.College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Guangxi Nanning 530004,China;2.Guangxi Veterinary Research Institute/Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Guangxi Nanning 530001,China)Abstract：To screen probiotic preparations that have good antibacterial effect and good probiotic characteristics,the experiment measured the in vitro antibacterial effect,growth curve,acid production ability,tolerance,and mouse safety of the isolated and identified Lentilactobacillus buchneri GXNN20210328-6(Hereinafter referred to as GX0328-6)to evaluate its probiotic characteristics and safety.The result showed that GX0328-6 had bacteriostatic effect on Salmonella typhimurium,Staphylococcus aureus and Escherichia coli,especially on Salmonella typhimurium;under pH=2.5 strong acid environment for 6 hours and 60 high temperature environment for 90 minutes,the viable count of GX0328-6 was above 1 106 CFU/mL,and it still maintained high activity;the survival rate was more than 50%(57.14%)at 0.5%high bile salt concentration for 2 hours;the safety test of mice showed that GX0328-6 had no adverse effect on diet,physiology and mental state of mice,and had no significant effect on body weight and immune organ index of mice(P0.05).In addition,compared with the CON group mice,the LB group mice showed no damage to the liver and intestines,indicating that GX0328-6 is safe for mice.In summary,it is concluded that Lentilactobacillus buchneri GXNN20210328-6 has good probiotic character作者介绍：石艳，硕士，研究方向为基础兽医学。*通讯作者：廖玉英，研究员。收稿日期：2023-05-31基 金 项 目：广 西 重 点 研 发 计 划 项 目 AB21238003、AB21220005-4；国家水禽产业技术体系建设专项CARS-42-55；广西肉鸡产业创新团队建设专项nycytxgxcxtd；南宁市重点研发计划项目20212023；良庆区重大科技专项202118；防城港市重点研发计划项目AB21014016；武鸣区重点研发项目20210102；江南重点研发项目20220620-298SILIAO GONGYE2023年第44卷第17期 总第686期在畜禽养殖生产中，抗生素等抗菌药物在预防疾病、治疗疾病以及促进动物生长中都发挥着极其重要的作用1。但近年来，抗生素的滥用导致了其残留于肉产品或者粪污之中，最终通过食物链传播，从而影响人类的健康2。我国农业农村部于2020年7月发布194号公告，要求在饲料中全面禁止添加促生长类抗生素3。因此，亟需寻找代替抗生素的新型抗菌药物以预防或治疗动物疾病。此外，遵循科学、绿色养殖是畜禽养殖业可持续发展的重要一步。益生菌作为“有助于肠道微生物平衡的生物体和物质”的新型微生物制剂4-5，可以通过调节免疫系统、限制病原体定植、控制炎症性肠道疾病和代谢性疾病来影响免疫系统6。在预防或治疗动物疾病等方面可作为抗菌药物的良好代替品。布氏乳杆菌（Lentilactobacillus buchneri）是一种自然存在于不同生态环境中的益生菌，通常与食品生产和发酵过程有关7。其具有独特的代谢途径，在厌氧和酸性条件下可将乳酸转化为乙酸和1,2-丙二醇，有助于维持细胞活力8。这些特性使得布氏乳杆菌在许多农场中成为一种有用的发酵剂，此外，布氏乳杆菌还可以防止霉菌和酵母引起的需氧变质9-12。目前关于布氏乳杆菌的报道，多数都是在研究布氏乳杆菌发酵青贮饲料，而布氏乳杆菌益生特性及安全性研究鲜有报道。因此，本研究通过测定体外抑菌能力、生长曲线、产酸能力、耐酸、耐高温及耐胆盐等试验评估其益生特性，通过小鼠安全性试验以评估其生物安全性，以期为未来布氏乳杆菌在畜禽养殖业中的应用奠定基础。1 材料与方法 1.1 主要试验材料1.1.1 试验菌株来源与试验动物布氏乳杆菌GXNN20210328-6（以下简称GX0328-6），分离于广西地区传统发酵食品酸菜中并保种于广西兽医研究所。4周龄C57BL/6小鼠20只，无特定病原体（SPF）级，体重（152）g，购于长沙市天勤生物技术有限公司，自由采食和饮水。1.1.2 指示菌及试验试剂大肠杆菌标准株（ATCC25922）及金黄色葡萄球菌标准株（ATCC6583），购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心；鼠伤寒沙门氏菌（SM022），由美国杜克大学分子遗传学和微生物学实验室惠赠。培养基（MRS、LB、MH）及肉汤（MRS、LB），均购于北京陆桥技术股份有限公司；PBS缓冲液，购于南京森贝伽生物科技有限公司；4%多聚甲醛，购自北京兰杰柯科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购于北京康为世纪生物科技有限公司。1.1.3 仪器设备 电热恒温培养箱，购自上海浦东荣丰科学仪器有限公司；2.5 L厌氧产气包，购自青岛海博生物技术有限公司；可见分光光度计，购自上海棱光技术有限公司；pH计购自上海Methler toledo仪器有限公司；正置光学显微镜购自尼康映像仪器销售有限公司。1.2 试验方法1.2.1 试验菌株的培养方法取已分离纯化后的GX0328-6按5%接种量接种至含有MRS肉汤的15 mL无菌试管中，将已接种的菌悬液放入2.5 mL的厌氧产气包中，于37 下培养24 h。1.2.2 体外抑菌试验 无菌条件下三种指示菌悬液分别取200 L涂布于MH固体培养基上，将牛津杯置于已接种指示菌的MH固体培养基内，取200 L GX0328-6菌悬液放入牛津杯内，4 冰箱过夜。待菌悬液充分扩散后，于37 下培养24 h。用游标卡尺测量抑菌圈直径，进行3次平行试验，最终求3次试验的平均值。1.2.3 生长曲线及产酸能力测定 参照谢曈等13的益生菌产酸能力测定方法，取5 mL已纯化的GX0328-6菌悬液于45 mL的MRS肉汤中，37、160 r/min条件下培养，分别在0、4、8、12、16、20、24、28 h取样以评价其产酸能力及菌体生长繁殖能力。1.2.4 耐酸试验取200 L纯化的GX0328-6菌悬液接种至10 mL MRS肉汤中，37 静置培养至对数期。将菌体悬浮于等体积、pH分别为2.0、2.5、3.0、3.5、7.4的MRS肉汤中，37 培养，分别于 0、2、4、6 h 取样，取 100 L istics and safety.This study can provide a theoretical basis for probiotics as feed additives.Key words：probiotics;Lentilactobacillus buchneri;probiotic characteristics;security;tolerance99试验研究2023年第44卷第17期 总第686期GX0328-6 菌悬液均匀涂布于 MRS 固体培养基上，37 培养，24 h后活菌计数。1.2.5 耐高温试验 前处理方法同 1.2.4，将菌体悬浮于等体积的MRS中，于37、40、50、60、70、80 分别培养0、30、60、90 min后取样检测。1.2.6 耐胆盐试验前期处理方法同1.2.5，将菌体悬浮于等体积、猪胆盐浓度为 0、0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、1.5%的 PBS中，37 恒温振荡器培养，于0、2、4、6 h分别取样检测。以0 h的活菌数为对照。存活率（%）=A2/A1100式中：A1在不同胆盐浓度的PBS缓冲液中培养0 h的活菌数（CFU/mL）；A2在不同胆盐浓度的PBS溶液中培养2、4、6 h的活菌数（CFU/mL）。1.2.7 小鼠安全性试验 20只小鼠适应环境7 d后随机分为两组，对照组（CON 组）：每只小鼠灌胃 0.2 mL 生理盐水，试验组（LB 组）：每只灌胃 0.2 mL 浓度为 1109 CFU/mL 的GX0328-6 活菌液，持续 10 d14。自由采食和饮水。每隔2 d于灌胃前记录小鼠体重、毛色、整体精神状态及粪便形态。10 d后，安乐死小鼠并取其胸腺、脾脏称重，计算免疫器官指数；采集肝脏、空肠及结肠组织放于4%多聚甲醛中固定，石蜡切片制作，苏木精-伊红（H.E.）染色，显微镜下观察小鼠肝脏及肠道组织形态学变化。免疫器官指数（%）=100免疫器官重（g）/小鼠体重（g）1.3 数据分析 试验所得数据用SPSS25.0进行平均值、T检验及two-way ANOVA 分析，P0.05），“*”和“#”表示与PBS组相比差异显著（P0.05），“#”表示与PBS组相比差异极显著（P0.05）。2.6.2 小鼠组织切片 如图6所示，CON组与LB组的小鼠肝脏组织均完整，清晰可见肝索，肝脏组织均无明显病变。由图7所示，CON组与LB组的小鼠空肠及结肠组织结构完整，均未见明显病理变化，肠道绒毛完整。3 讨论金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及鼠伤寒沙门氏菌引起的感染不仅给养殖业造成巨大的经济损失，还严重威胁人类健康15-17。越来越多的国家要求禁止在食用性动物的饲料中添加抗生素，而目前作为抗生素的替代品，益生菌已被广泛研究18-20。研究发现，益生菌可以通过产生代谢物或抗菌化合物21、改变胃肠道微生物菌群结构、抑制食源性病原体的产生等方式促进机体肠道微生物群的平衡22-23。益生菌的益生特性是评估益生菌生物活性的重要因素，而具有潜在益生特性的益生菌需要具备耐酸性、胆盐耐受性、无获得性耐药、对潜在致病菌有抗菌活性等特点24。本试验通过检测GX0328-6的抑菌能力、生物学特性及安全性以研究GX0328-6的益生潜力。小鼠平均体重(g)32220181614126CON组LB组0912ns时间（d）（a）体重免疫器官指数(%)LB组6420胸腺脾脏CON组nsnsLB组CON组组别（b）免疫器官指数注：ns表示无显著差异。图5 GX0328-6对小鼠体重及免疫器官的影响布氏乳杆菌可产生细菌素、有机酸等抗菌物质，表现出广谱抑菌活性25-26。贡汉生等27报道，从传统乳制品中分离的布氏乳杆菌对这大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌均有抑菌效果，且对金黄色葡萄球菌101试验研究2023年第44卷第17期 总第686期及沙门氏菌抑菌效果最佳。这与本试验中从传统发酵食品酸菜中分离出的GX0328-6的试验结果一致。本试验中，GX0328-6对三种指示菌均有不同的抑菌作用，尤其是对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌效果最强，抑菌圈高至17.50 mm。此外，测定微生物生长和代谢产物生成曲线有助于微生物制剂研制中对数生长期和稳定期的选择及了解微生物的生长特性28。由于对数生长期的菌株活力较好，益生菌制剂的制备及使用通常选取该时期的菌29。研究表明，乳酸菌在37 下培养616 h为对数生长期30。在本试验中，GX0328-6CON组LB组1040图6 GX0328-6对小鼠肝脏组织的影响（10）CON组LB组空肠结肠图7 GX0328-6对小鼠肠道组织的影响（10）102SILIAO GONGYE2023年第44卷第17期 总第686期在37 培养4 h即可进入对数生长期且持续时间长。在环境适宜的情况下乳酸菌能迅速繁殖,并能分泌大量有机酸类,使发酵液 pH 迅速下降31。GX0328-6在 08 h 时 pH 缓慢下降，在 820 h 时变化比较平稳，此时正是其生长对数期，于20 h后又开始缓慢降低。GX0328-6的产酸能力不显著。布氏乳杆菌可产生细菌素或有机酸等抗菌物质25-26，而本研究中GX0328-6产酸能力不显著，但他却能表现出广谱的抑菌活性。提示GX0328-6的抑菌机制可能是产生细菌素等抗菌物质以抑制病原菌的生长，但其抑菌机制还需进一步研究。益生菌对酸性环境及胆盐耐受性也是其益生特性的重要指标，益生菌需通过胃酸环境到达机体消化吸收的主要场所小肠，小肠的肠腔内为胆盐环境32。因此，益生菌能否在胃肠道存活取决于其对胃肠道环境中酸和胆盐的耐受能力33。本试验中，04 h 时，GX0328-6在pH为2.53.5的环境下降较缓慢，于4 h时还能保持较高浓度的活菌数。在04 h 时，GX0328-6在0.1%、0.3%胆汁酸盐环境下存活率在50%以上，具有较高的存活率。该特性保证了GX0328-6在胃肠道环境存活的可能。GX0328-6在胆盐浓度中的存活率呈浓度依赖性降低，这可能与高胆盐浓度在细胞外产生高渗透压导致菌株耐受力下降有关34。尽管益生菌耐高温试验的研究相对比较少，但研究表明菌株耐高温能力的比较反映了菌种在后期储存、加工过程中的稳定性13。因此，本试验测定了GX0328-6在高温环境下的耐受性，结果发现GX0328-6在4060 高温下孵育90 min仍能保持较高的活性。在70 高温下60 min时及80 高温下30 min时仍能存活。提示GX0328-6 具 有 较 高 的 高 温 耐 受 能 力，这 表 明GX0328-6在存储及加工过程中具有较大的优势。综上GX0328-6具有潜在的益生潜力。尽管GX0328-6具有潜在的益生特性，但其安全性也是不可忽视的。益生菌候选菌株的必备前提条件是具备良好的生物安全性能35。欧盟专家组认为，将布氏乳杆菌添加至饲料中，能产生较多的乙酸并提高饲料的有氧稳定性，延长饲料的保存期36。但布氏乳杆菌饲喂后对动物机体的安全性却鲜少有报道。研究报道，干酪IMV B-7280菌株在小鼠口服给药后是安全的，并对肠道微生物群具有积极影响37。朱广素等38研究发现饲喂青春双歧杆菌Z25和罗伊氏乳杆菌138-1对妊娠期大鼠生殖功能及胚胎形成无影响，未见胎仔内脏和外观畸形。本试验给小鼠持续灌胃10 d GX0328-6，发现其对小鼠生长和饮食均无不良影响，小鼠的生理状态及粪便形状均正常，未出现腹泻等症状，且小鼠活泼，无精神沉郁等不良症状，无发病和死亡。此外，小鼠免疫器官指数及体重变化与对照组相比无显著差异。研究表明，益生菌对断奶仔猪的平均日增重和饲料利用率具有显著的促进作用39，本试验在灌胃GX0328-6菌液第4天后，发现与CON组相比，LB组的体重呈增加的趋势，但无显著差异。推测这可能与饲喂时间过短有关。通过形态学分析发现GX0328-6对小鼠体内脏器均无影响，肝脏组织H.E.染色结果发现小鼠肝索清晰，肝细胞完整，无细胞变性、炎性病灶及充血等病理现象；小鼠肠道组织切片结果显示小鼠空肠及结肠绒毛未有损伤，纹状缘较完整。上述结果均表明GX0328-6对小鼠具有安全且无致病性的特征。4 结论综上所述，GX0328-6具有良好的生长特性，在高温、高胆盐及强酸环境下具有良好的耐受性及安全无致病性等特性。GX0328-6的分离鉴定可为控制病原菌的益生菌制剂的开发提供一个选择，同时也为后期试验提供研究基础。参考文献1 BARTON M D.Antibiotic use in animal feed and its impact on human healtJ.Nutrition Research Reviews,2000,13(2):279-299.2 NISCHAL P M.First global report on antimicrobial resistance released by the WHOJ.The National Medical Journal of India,2014,27(4):241.3 蔺春文.有关药物饲料添加剂退出的监督执法初探 农业农村部 194号公告实施后的监督执法实践探讨J.湖南饲料,2019(5):17-19.4 OTOOLE P W,COONEY J C.Probiotic bacteria influence the composition and function of the intestinal microbiotaJ.Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases,2008,2008:175285.5 SANDERS M E.Impact of probiotics on colonizing microbiota of the gutJ.Journal of Clinical Gastroenterology,2011,45:S115-S119.6 GANJI-ARJENAKI M,RAFIEIAN-KOPAEI M.Probiotics are a good choice in remission of inflammatory bowel diseases:a meta analysis and systematic reviewJ.Journal of Cellular Physiology,2018,233(3):2091-2103.7 HEINL S,GRABHERR R.Systems biology of robustness and flexibility:Lactobacillus buchneri-a show caseJ.Journal of Biotechnology,2017,257:61-69.8 OUDE E S,KROONEMAN J,GOTTSCHAL J C,et al.Anaerobic conversion of lactic acid to acetic acid and 1,2-propanediol by 103试验研究2023年第44卷第17期 总第686期Lactobacillus buchneriJ.Applied and Environmental Microbiology,2001,67(1):125-132.9 MIYAJI M,INOUE H,KAWAIDE T,et al.Effect of different methods for conserving rice grain on in situ ruminal degradation and in vivo nutrient digestion and rumen fermentation in steersJ.Journal of Animal Science,2018,89(7):972-978.10 MUCK R E,NADEAU E,MCALLISTER T A,et al.Silage review:recent advances and future uses of silage additivesJ.Journal of Dairy Science,2018,101(5):3980-4000.11 MARI L J,SCHMIDT R J,NUSSIO L G,et al.Short communication:an evaluation of the effectiveness of Lactobacillus buchneri 40788 to alter fermentation and improve the aerobic stability of corn silage in farm silosJ.Journal of Dairy Science,2009,92(3):1174-1176.12 NISHINO N,YOSHIDA M,SHIOTA H,et al.Accumulation of 1,2-propanediol and enhancement of aerobic stability in whole crop maize silage inoculated with Lactobacillus buchneriJ.Journal of Applied Microbiology,2003,94(5):800-807.13 谢曈,吕虹雨,朱佳佳,等.几株益生菌的性能比较研究J.动物医学进展,2021,42(12):26-30.14 王楠,田晗,张文晓,等.两株具有潜在益生作用的人源链球菌的安全性评价J.食品与发酵工业,2021,47(5):12-16.15 ZHOU K,LI C,CHEN D,et al.A review on nanosystems as an effective approach against infections of Staphylococcus aureusJ.International Journal of Nanomedicine,2018,13:7333-7347.16 FEGAN N,GOBIUS K S.Pathogenic Escherichia coli and one health implicationsJ.Current Topics in Microbiology and Immunology,2013,366:49-62.17 HERRERO-FRESNO A,OLSEN J E.Salmonella typhimurium metabolism affects virulence in the host-a mini-reviewJ.Food Microbiology,2018,71:98-110.18 WU T,SHI Y,ZHANG Y,et al.Lactobacillus rhamnosus LB1 alleviates enterotoxigenic Escherichia coli-induced adverse effects in piglets by improving host immune response and anti-oxidation stress and restoring intestinal integrityJ.Frontiers in Cellular and Infection Microbiology,2021,11:724401.19 WANG B,ZHOU Y,MAO Y,et al.Dietary supplementation with Lactobacillus plantarum ameliorates compromise of growth performance by modulating short-chain fatty acids and intestinal dysbiosis in broilers under clostridium perfringens challengeJ.Frontiers in Nutrition,2021,8:706148.20 SONG F,LIU J S,ZHAO W Y,et al.Synergistic effect of eugenol and probiotic Lactobacillus Plantarum Zs2058 against salmonella infection in C57bl/6 miceJ.Nutrients,2020,12(6):1611.21 李瑞盈.鼠李糖乳杆菌B6代谢产物对氧化受损PC12细胞的保护作用及机制初探D.硕士学位论文.上海:上海海洋大学,2022.22 KHAN S,MOORE R J,STANLEY D,et al.The gut microbiota of laying hens and its manipulation with prebiotics and probiotics to enhance gut health and food safetyJ.Applied and Environmental Microbiology,2020,86(13):e600-e620.23 RICKE S C,LEE S I,KIM S A,et al.Prebiotics and the poultry gastrointestinal tract microbiomeJ.Poultry Science,2020,99(2):670-677.24 徐雅芫.猪源益生菌筛选及其益生作用机理的研究D.博士学位论文.合肥:安徽农业大学,2017.25 常峰,梁波,朱何东,等.布氏乳杆菌CF10所产类细菌素Lactobacillin FC-10的初步研究J.酿酒科技,2005(6):36-39.26 关今韬.布氏乳杆菌转化合成苯乳酸及其晶胶分离特性研究D.博士学位论文.杭州:浙江大学,2018.27 贡汉生,孟祥晨,刘红娟.一株布氏乳杆菌所产类细菌素的初步纯化与部分特性J.微生物学通报,2008(2):193-199.28 STEVENSON K,MCVEY A F,CLARK I,et al.General calibration of microbial growth in microplate readersJ.Scientific Reports,2016,6:38828.29 苏馨.嗜酸乳杆菌的体外筛选及优良菌株的高密度发酵研究D.硕士学位论文.呼和浩特:内蒙古农业大学,2021.30 王明艳.犬源植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其对犬腹泻的防治效果初探D.硕士学位论文.北京：中国农业科学院,2020.31 尹珺伊,刘秋瑾,田秋丰,等.一株干酪乳杆菌的分离鉴定及生物学特性研究J.中国畜牧兽医,2021,48(2):516-524.32 金正雨,邓永军,杨泽敏,等.瑶鸡粪便中乳酸菌的分离鉴定及筛选J.中国生物制品学杂志,2022,35(4):413-417.33 DAVOREN M J,LIU J,CASTELLANOS J,et al.A novel probiotic,Lactobacillus johnsonii 456,resists acid and can persist in the human gut beyond the initial ingestion periodJ.Gut Microbes,2019,10(4):458-480.34 崔美岩.青藏高原不同材料来源乳酸菌极端环境耐受性及优良菌株益生性的初步研究D.硕士学位论文.郑州:郑州大学,2017.35 张素平,林晓颖,徐明超,等.棒状腐败乳杆菌Lc7的生物学特性及益生作用J.微生物学报,2022,63(1):319-332.36 BAMPIDIS V,AZIMONTI G,BASTOS M L,et al.Assessment of the feed additive consisting of Lentilactobacillus buchneri(formerly Lactobacillus buchneri)DSM 16774 for all animal species for the renewal of its authorisation(Lactosan GmbH&Co.KG)J.EFSA Journal,2021,19(7):e6696.37 LAZARENKO L M,BABENKO L P,GICHKA S G,et al.Assessment of the safety of Lactobacillus casei IMV B-7280 probiotic strain on a mouse modelJ.Probiotics and Antimicrobial Proteins,2021,13(6):1644-1657.38 朱广素,王刚,王园园,等.两株具有缓解代谢综合征功能的人源益生菌的安全性评价J.食品与发酵工业,2018,44(8):57-64.39 刘辉,季海峰,王四新,等.益生菌对生长猪生长性能、粪便微生物数量、养分表观消化率和血清免疫指标的影响J.动物营养学报,2015,27(3):829-837.（编辑：沈桂宇，）104