PD模型小鼠未定带GABA能神经元的放电变化.pdf

第5 9卷 第3期2 0 2 3年0 6月青 岛 大 学 学 报(医 学 版)J OUR NA LO FQ I N G D AOUN I V E R S I T Y(ME D I C A LS C I E N C E S)V o l.5 9,N o.3J u n e 2 0 2 3 收稿日期2 0 2 2-1 2-0 2;修订日期2 0 2 3-0 6-1 6 基金项目国家自然科学基金面上项目(3 2 1 7 1 1 3 2)第一作者李昂(1 9 9 8-),女,硕士研究生。通信作者石丽敏(1 9 8 2-),女,博士,副教授,硕士生导师。E-m a i l:l i m i n s h i q d u.e d u.c n。P D模型小鼠未定带GA B A能神经元的放电变化李昂,陈凤华,王紫君,石丽敏(青岛大学医学部基础医学院生理学与病理生理学系,山东 青岛 2 6 6 0 7 1)摘要 目的 探讨1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MP T P)诱导的帕金森病(P D)模型小鼠未定带-氨基丁酸(GA B A)能神经元的放电变化。方法 8周龄雄性C 5 7 B L/6小鼠1 4只,随机分为对照组及MP T P组,每组7只。MP T P组采用连续5d腹腔注射MP T P(3 0m gk g-1d-1)的方法制备P D小鼠模型,对照组注射等量生理盐水。利用免疫荧光技术观察小鼠黑质区酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元的数目变化,旷场实验观察小鼠运动行为变化,膜片钳技术观察未定带区GA B A能神经元的放电变化。结果 与对照组相比,MP T P组小鼠黑质区TH阳性神经元数目明显减少(t=2.7 7 5,P0.0 5);旷场检测结果显示,MP T P组小鼠在旷场中的运动距离较对照组明显减少(t=1 7.8 7 0,P0.0 0 1);MP T P组小鼠未定带区G A B A能神经元放电频率较对照组降低,差异具有统计学意义(t=5.8 9 5,P0.0 0 1)。结论 MP T P诱导的P D模型小鼠未定带GA B A能神经元放电频率显著降低。关键词 帕金森病;未定带;GA B A能神经元;电生理学;小鼠 中图分类号 R 3 3 8.2 文献标志码 A 文章编号 2 0 9 6-5 5 3 2(2 0 2 3)0 3-0 3 4 5-0 4d o i:1 0.1 1 7 1 2/j m s.2 0 9 6-5 5 3 2.2 0 2 3.5 9.0 9 6 开放科学(资源服务)标识码(O S I D)网络出版 h t t p s:/l i n k.c n k i.n e t/u r l i d/3 7.1 5 1 7.R.2 0 2 3 0 8 0 4.1 5 2 1.0 0 4;2 0 2 3-0 8-0 4 1 8:3 1:3 4C H A N G EI NG A B A E R G I CN E U R O NF I R I N GI NT H EZ O N AI N C E R T AI NAMO U S EMO D E LO FP A R K I N S O NSD I S E A S E L IA n g,CHENF e n g h u a,WANGZ i j u n,SH IL i m i n(D e p a r t m e n t o f P h y s i o l o g ya n dP a t h o p h y s i o l o g y,S c h o o l o fB a s i cM e d i c i n e,Q i n g d a oU n i v e r s i t yM e d i c a lC o l l e g e,Q i n g d a o2 6 6 0 7 1,C h i n a)A B S T R A C T O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t et h ef i r i n gc h a n g eo fg a mm a-a m i n o b u t y r i ca c i d(GA B A)-e r g i cn e u r o n s i nt h ez o n ai n c e r t a i nam o u s em o d e l o fP a r k i n s o nsd i s e a s e i n d u c e db y1-m e t h y l-4-p h e n y l-1,2,3,6-t e t r a h y d r o p y r i d i n e(MP T P).M e t h o d sF o u r t e e n8-w e e k-o l dm a l eC 5 7 B L/6m i c ew e r er a n d o m l yd i v i d e di n t oc o n t r o lg r o u pa n d MP T Pg r o u p,w i t hs e v e nm i c ei ne a c hg r o u p.A MP T Pm o d e lw a sp r e p a r e db y i n t r a p e r i t o n e a l i n j e c t i o no fMP T P(3 0m gk g-1d-1)f o rc o n t i n u o u sf i v ed a y s i nt h eMP T Pg r o u p.T h ec o n t r o l g r o u pw a s i n j e c t e dw i t ha ne q u a l a m o u n to fn o r m a l s a l i n e.T h en u m b e ro f t y r o s i n eh y d r o x y l a s e(TH)-p o s i t i v en e u r o n s i nt h es u b s t a n t i an i g r aw a sd e t e r m i n e db yt h e i mm u n o f l u o r e s c e n c e t e c h n i q u e.T h e l o c o m o t o ra c t i v i t yo fm i c ew a so b s e r v e db yt h eo p e nf i e l dt e s t.T h ef i r i n gc h a n g eo fGA B A e r g i cn e u r o n s i nt h ez o n ai n c e r t aw a sm e a s u r eu s i n gt h ep a t c hc l a m pt e c h n i q u e.R e s u l t s C o m p a r e dw i t ht h a to f t h ec o n t r o l g r o u p,t h en u m b e ro fTH-p o s i t i v en e u r o n s i nt h es u b s t a n t i an i g r ao f t h eMP T Pg r o u pw a s s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d(t=2.7 7 5,P0.0 5).T h eMP T Pg r o u p s h o w e da s i g n i f i c a n t l y s h o r t e r d i s t a n c e o fm o v e m e n ti nt h eo p e nf i e l dt h a nt h ec o n t r o l g r o u p(t=1 7.8 7 0,P0.0 0 1).T h e f i r i n gr a t eo fGA B A e r g i cn e u r o n s i nt h e z o n a i n c e r t aw a s s i g-n i f i c a n t l y l o w e r i nt h eMP T Pg r o u pt h a ni nt h ec o n t r o lg r o u p(t=5.8 9 5,P0.0 0 1).C o n c l u s i o n I nt h eMP T P-i n d u c e dP Dm o d e l i nm i c e,t h e f i r i n gr a t eo fGA B A e r g i cn e u r o n s i nt h ez o n a i n c e r t aw a ss i g n i f i c a n t l yr e d u c e d.K E Y WO R D S P a r k i n s o nd i s e a s e;z o n a i n c e r t a;GA B A e r g i cn e u r o n s;e l e c t r o p h y s i o l o g y;m i c e 帕金森病(P D)是一种常见的神经退行性疾病,主要发生于老年人1,其神经病理学基础是黑质致密带多巴胺能神经元选择性丢失,纹状体轴突末梢多巴胺含量减少,基底神经核直接和间接通路失平衡2-3,从而引起一系列运动症状,包括静止性震颤、运动迟缓、僵硬和姿势不稳等4。脑深部电刺激是临床治疗P D运动症状的高效治疗手段,被认为能干预被刺激核团神经元的放电活动,并影响相关神经传导通路的信息传递,从而调控脑区的功能5。丘脑底核和苍白球内侧部是最经典的刺激靶点,最近的研究表明未定带也可作为脑深部电刺激的靶点,未定带电刺激与丘脑底核电刺激相比效果相似甚至更优6-8,且无明显副作用,病人术后吞咽、认知和语言功能均未受影响9。脑深部电刺激改善P D病人运动症状的机制可能是影响了神经元的放电活动1 0,但在P D状态下未定带神经元的放电是否发生了变化目前尚不清楚。本实验选用神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MP T P)制备P D小鼠模型,利用脑片膜片钳技术观察其未定带-氨基丁酸(GA B A)能神经元的放电变化,为了解未定带 3 4 6青 岛 大 学 学 报(医 学 版)5 9卷在P D进展和治疗中的作用提供实验依据。1 材料与方法1.1 实验动物及主要试剂S P F级8周龄C 5 7 B L/6小鼠,由北京维通利华公司提供。小鼠饲养于2 5、1 2h昼夜循环光照条件下,可自由饮水、摄食、活动。动物手术符合青岛大学动物伦理学要求。MP T P购自美国S i g m a公司,酪氨酸羟化酶(TH)抗体购于美国M i l l i p o r e公司。参考文献方法配制人工脑脊液及冷冻切片液进行脑片膜片钳实验1 1。1.2 分组及给药方法将2 6只小鼠随机分为对照组和MP T P组,每组1 3只,其中7只小鼠用于旷场实验和免疫荧光实验,6只小鼠用于脑片膜片钳实验。MP T P组小鼠连续5d腹腔注射MP T P(3 0m gk g-1d-1),对照组小鼠连续5d腹腔注射等量生理盐水。1.3 旷场实验在给药结束2 4h后进行旷场实验,将小鼠放于旷场测试盒里,让其自由活动,利用E t h v i s i o nX T 7系统设定好旷场程序,将待测小鼠放在测试盒的中心位置,点击开始,计时1 0m i n记录小鼠的运动情况。每次检测结束后用体积分数0.7 5的乙醇及擦手纸擦拭,彻底清理测试盒,散去味道后开始下一只小鼠的测试,避免陌生味道对小鼠行为产生干扰。1.4 脑标本采集旷场实验结束之后进行脑标本的采集。麻醉小鼠,固定其四肢,暴露心脏,将静脉注射针头小心插入左心室同时剪开右心耳。先用9g/L的N a C l对小鼠进行灌注,再应用4 0g/L的多聚甲醛溶液(用0.1m o l/L的P B S配制,p H值7.27.4,现用现配,4避光保存)对小鼠进行灌注。待小鼠肝脏由红色变为黄白色且四肢和尾部出现僵直时,停止灌注操作。立刻取出小鼠大脑,在4 0g/L多聚甲醛溶液中固定过夜,再用2 0 0g/L蔗糖溶液(用0.1m o l/L的P B S配制)脱水,大脑沉底后,转入到3 0 0g/L蔗糖溶液中脱水,大脑沉入底部提示脱水完成。1.5 脑组织切片及免疫荧光染色用恒温冷冻切片机(L e i c a,CM 1 9 5 0)进行冷冻切片。切片之前将机器预冷至-2 0,将脑组织用包埋剂O C T(S a k u r aF i n e t e k)包埋并固定在冻头托上。将小鼠脑组织切成厚度为2 0m的脑片,黑质区脑片切成完整的4套,将脑片置于含有0.0 1m o l/LP B S溶液的1 2孔板中放在4保存,进行免疫荧光实验时取出完整的1套进行染色。使用TH一抗(稀释比为110 0 0,r a b b i t)和P B S T稀释的荧光二抗(d o n k e ya n t i-r a b b i t 5 5 5,稀释比为15 0 0),参照文献方法进行免疫荧光染色1 2。在O l y m p u s光学显微镜下拍片,应用O l y V I A软件进行计数。计数该套脑片在2 0倍物镜下黑质区TH阳性神经元个数,再乘以4即可得到黑质区TH阳性神经元的个数。统计黑质区每个高倍视野(4 0 0倍)内的阳性细胞数目并取平均值。1.6 离体未定带脑片制备及电生理学记录记录电极由水平拉制仪拉制而成,尖端直径为12m。选取电阻为49M的玻璃电极进行实验。参考文献的方法进行离体未定带脑片的制备及电生理学记录1 1。1.7 统计学分析应用G r a p hP a dP r i s m6软件进行统计学分析。实验结果以xs表示,组间比较采用t检验。P0.0 5表示差异具有统计学意义。2 结 果2.1 P D模型小鼠黑质TH阳性神经元数目及运动行为的变化免疫荧光染色结果显示,与对照组相比,MP T P组小鼠黑质区TH阳性神经元数目减少,差异具有统计学意义(t=2.7 7 5,P0.0 5),提示小鼠出现黑质区多巴胺能神经元损伤。旷场实验结果显示,与对照组相比,MP T P组小鼠在旷场中的运动距离明显减少(t=1 7.8 7 0,P0.0 0 1),提示小鼠出现运动障碍,P D模型制备成功。见图1及表1。表1 两组小鼠黑质区T H阳性神经元数目及旷场运动距离比较(n=7,xs)组别TH阳性神经元(个)运动距离(l/c m)对照组39 4 78 2 324 7 6.7 92 5 4.7 6MP T P组 27 8 56 1 2*5 3 2.0 3 7 8.7 0*与对照组比较,*t=2.7 7 5,P0.0 5;*t=1 7.8 7 0,P0.0 0 1。2.2 P D模型小鼠未定带GA B A能神经元的放电变化在全细胞记录形成之后,转为电流钳模式,给予神经元-2 0 0p A的超极化电流刺激,神经元膜电位未出现显著的内向整流特征,且在G a pf r e e模式下,神经元表现出较快且规则的自发放电活动,判断 3期李昂,等.P D模型小鼠未定带GA B A能神经元的放电变化3 4 7为GA B A能神经元1 3。本实验记录到的未定带神经元放电频率约为2 4.1 7H z,动作电位时程较短,半宽高为(1.3 60.6 5)m s,符合GA B A能神经元的放电特征。本实验在每组6只小鼠中各记录1 0个神经元,对照组和MP T P组小鼠未定带GA B A能神经元放电频率分别为(2 4.1 78.6 0)和(6.7 32.1 8)H z,MP T P组小鼠未定带GA B A能神经元放电频率较对照组显著降低(t=5.8 9 5,P0.0 0 1)。提示在P D状态下,未定带GA B A能神经元放电活动发生了变化。见图2。图1 P D模型小鼠黑质区T H阳性神经元数目变化图2 P D模型小鼠未定带G A B A能神经元的放电变化3 讨 论未定带是底丘脑的重要核团,被认为是中脑网状结构的吻部延伸,主要含GA B A能神经元1 4。在啮齿类动物中,未定带大致分为4个亚区(吻侧区、背侧区、腹侧区和尾侧区),各亚区与不同的大脑区域具有纤维联系,如背侧区和吻侧区的GA B A能神经元投射到皮质和丘脑,腹侧区的GA B A能神经元投射到基底前脑和脑干,尾侧区接收来自小脑的纤维投射。此外,未定带内部的GA B A能神经元之间也有互相联系7。通过复杂的纤维投射,未定带在机体多种功能的调控中均发挥重要作用,影响摄食、姿势与运动、睡眠与觉醒、大脑皮质发育、神经病理痛等多种生理病理过程1 4-1 7。未定带与P D的研究近年来也受到较多关注。有临床研究观察到,在未定带实施脑深部电刺激术可显著改善P D病人的运动症状1 8,这提示在P D疾病状态下,未定带神经元出现异常的电活动。已知大脑的许多功能都与神经元的电活动相关,脑深部电刺激术被认为能干预被刺激核团神经元的异常放电活动,并影响相关神经传导通路的信息传递,从而调控脑区的功能5。本实验首次在MP T P制备的P D模型小鼠中,利用脑片膜片钳技术观察比较未定带GA B A能神经元的自发放电活动变化。本 3 4 8青 岛 大 学 学 报(医 学 版)5 9卷研究首先通过免疫荧光染色观察到黑质TH阳性神经元数目减少,证实多巴胺能神经元受损,旷场行为学检测进一步证明P D模型建立成功,然后观察到未定带GA B A能神经元自发放电频率在模型小鼠中显著降低。以往研究也表明,在P D动物模型中,多个与P D发病相关核团神经元的电活动都出现了变化。例如,内侧苍白球神经元放电频率较正常动物增加2 0%5 0%,其中爆发式的放电类型显著增加1 9;P D大鼠模型中黑质网状带区GA B A能神经元自发放电频率显著增高,并且簇状放电的神经元增多2 0。但神经元电活动出现变化的具体机制还不明确,推测可能与离子通道的开放程度有关。探索P D状态下神经元电活动的变化可为脑深部电刺激提供可选择的刺激靶点。鉴于本团队前期研究已经证实未定带神经元数目在P D小鼠模型中减少2 1,我们推测,在P D状态下未定带神经元出现损伤,同时放电活动降低。本实验为进一步了解未定带神经元在P D中的病理改变提供了实验依据。参考文献1B L O EM BR,OKUN M S,K L E I N C.P a r k i n s o nsd i s e a s eJ.L a n c e t,2 0 2 1,3 9 7(1 0 2 9 1):2 2 8 4-2 3 0 3.2T AO MZ,D OUKX,X I EYJ,e t a l.T h ea s s o c i a t i o n so f c e-r e b r o s p i n a lf l u i db i o m a r k e r s w i t hc o g n i t i o n,a n dr a p i de y em o v e m e n t s l e e pb e h a v i o rd i s o r d e r i ne a r l yP a r k i n s o nsd i s e a s eJ.F r o n t i e r s i nN e u r o s c i e n c e,2 0 2 2,1 6:1 0 4 9 1 1 8.3J E L L I N G E R K A.T h ep a t h o b i o l o g i c a lb a s i so fd e p r e s s i o ni nP a r k i n s o nd i s e a s e:c h a l l e n g e sa n do u t l o o k sJ.J o u r n a lo fN e u r a lT r a n s m i s s i o n,2 0 2 2,1 2 9(1 2):1 3 9 7-1 4 1 8.4P A J A R E SM,IRO J OA,MAN D AG,e t a l.I n f l a mm a t i o n i nP a r k i n s o nsd i s e a s e:m e c h a n i s m sa n dt h e r a p e u t i c i m p l i c a t i o n sJ.C e l l s,2 0 2 0,9(7):1 6 8 7.5YUANGH,Z HE N GYJ,WAN GY,e t a l.M u l t i s c a l e e n t r o-p ya n ds m a l l-w o r l dn e t w o r ka n a l y s i s i nr s-f MR I-n e wt o o l s t oe v a l u a t ee a r l yb a s a lG a n g l i ad y s f u n c t i o ni nd i a b e t i cp e r i p h e r a ln e u r o p a t h yJ.F r o n t i e r s i nE n d o c r i n o l o g y,2 0 2 2,1 3:9 7 4 2 5 4.6B AUMGA R T N E RAJ,THOMP S ONJA,K E RNDS,e t a l.N o v e l t a r g e t s i nd e e pb r a i ns t i m u l a t i o n f o rm o v e m e n t d i s o r d e r sJ.N e u r o s u r g i c a lR e v i e w,2 0 2 2,4 5(4):2 5 9 3-2 6 1 3.7O S S OWS KAK.Z o n a i n c e r t a a s a t h e r a p e u t i c t a r g e t i nP a r k i n-s o nsd i s e a s eJ.J o u r n a lo fN e u r o l o g y,2 0 2 0,2 6 7(3):5 9 1-6 0 6.8MA R C O R D,B HA R GAVA D,MA C E R O L L O A,e ta l.C o u l dZ Ih a v ear o l e i nD B Sf o rP a r k i n s o nsd i s e a s e?A no b-s e r v a t i o n a l s t u d yt oo p t i m i z eD B St a r g e t l o c a l i z a t i o nJ.J o u r-n a l o fC l i n i c a lN e u r o s c i e n c e,2 0 2 0,7 7:8 9-9 3.9P H I L I P S ONJ,B L OM S T E D T P,F R E D R I C K S A,e ta l.S h o r t-a n d l o n g-t e r mc o g n i t i v e e f f e c t s o f d e e pb r a i ns t i m u l a t i o ni nt h ec a u d a l z o n a i n c e r t av e r s u sb e s tm e d i c a l t r e a t m e n t i np a-t i e n t sw i t hP a r k i n s o nsd i s e a s eJ.J o u r n a lo fN e u r o s u r g e r y,2 0 2 0,1 3 4(2):3 5 7-3 6 5.1 0AU B I GNA T M,L E F R AN C M,T I R M,e ta l.D e e pb r a i ns t i m u l a t i o np r o g r a mm i n g i nP a r k i n s o nsd i s e a s e:i n t r o d u c t i o no fc u r r e n ti s s u e sa n dp e r s p e c t i v e sJ.R e v u eN e u r o l o g i q u e,2 0 2 0,1 7 6(1 0):7 7 0-7 7 9.1 1C HAN GXL,MAZG,S H ILM,e t a l.E f f e c t so f g h r e l i no nt h ee l e c t r i c a la c t i v i t i e so fs u b s t a n t i an i g r ad o p a m i n e r g i cn e u-r o n st r e a t e d w i t h MP PJ.N e u r o c h e m i s t r yI n t e r n a t i o n a l,2 0 2 0,1 3 8:1 0 4 7 8 0.1 2I M K,MA R E N I NOVS,D I A ZMP,e t a l.A n i n t r o d u c t i o n t op e r f o r m i n g i mm u n o f l u o r e s c e n c es t a i n i n gJ.M e t h o d si n M o-l e c u l a rB i o l o g y,2 0 1 9,1 8 9 7:2 9 9-3 1 1.1 3T R A G E S E RJC,B UR K EK A,MA S R IR,e ta l.S t a t e-d e-p e n d e n tg a t i n go f s e n s o r y i n p u t sb yz o n a i n c e r t aJ.J o u r n a l o fN e u r o p h y s i o l o g y,2 0 0 6,9 6(3):1 4 5 6-1 4 6 3.1 4YAN GY,J I AN GT,J I AXY,e t a l.Wh o l e-b r a i nc o n n e c t o m eo fGA B A e r g i cn e u r o n s i nt h em o u s ez o n ai n c e r t aJ.N e u r o-s c i e n c eB u l l e t i n,2 0 2 2,3 8(1 1):1 3 1 5-1 3 2 9.1 5Y E Q Y,Z HAN G X B.S e r o t o n i na c t i v a t e sp a r a v e n t r i c u l a rt h a l a m i cn e u r o n s t h r o u g hd i r e c td e p o l a r i z a t i o na n di n d i r e c td i-s i n h i b i t i o nf r o mz o n ai n c e r t aJ.T h eJ o u r n a lo fP h y s i o l o g y,2 0 2 1,5 9 9(2 1):4 8 8 3-4 9 0 0.1 6OH S G,HWAN G Y G,L E E H S.L I M h o m e o b o x6(L h x 6)+n e u r o n s i n t h ev e n t r a l z o n a i n c e r t ap r o j e c t t o t h e c o r ep o r t i o no f t h el a t e r a ls u p r a m a mm i l l a r yn u c l e u s i nt h er a tJ.B r a i nR e s e a r c h,2 0 2 0,1 7 4 8:1 4 7 1 2 5.1 7HUTT,WAN GRR,D UY,e t a l.A c t i v a t i o no f t h e i n t r i n-s i cp a i n i n h i b i t o r y c i r c u i t f r o mt h em i d c i n g u l a t eC g 2 t o z o n a i n-c e r t aa l l e v i a t e sn e u r o p a t h i cp a i nJ.T h eJ o u r n a lo fN e u r o-s c i e n c e,2 0 1 9,3 9(4 6):9 1 3 0-9 1 4 4.1 8S T E NMA R KP E R S S ONR,NO R D I NT,HA R I ZG M,e t a l.D e e pb r a i ns t i m u l a t i o no fc a u d a l z o n ai n c e r t af o rP a r k i n s o nsd i s e a s e:o n e-y e a rf o l l o w-u pa n de l e c t r i cf i e l ds i m u l a t i o n sJ.N e u r o m o d u l a t i o n,2 0 2 2,2 5(6):9 3 5-9 4 4.1 9HOOV E RJE,S T R I C KPL.T h eo r g a n i z a t i o no fc e r e b e l l a ra n db a s a l g a n g l i ao u t p u t s t op r i m a r ym o t o rc o r t e xa sr e v e a l e db yr e t r o g r a d e t r a n s n e u r o n a l t r a n s p o r to fH e r p e ss i m p l e xv i r u st y p e1J.T h e J o u r n a l o fN e u r o s c i e n c e:t h eO f f i c i a l J o u r n a l o ft h eS o c i e t yf o rN e u r o s c i e n c e,1 9 9 9,1 9(4):1 4 4 6-1 4 6 3.2 0B O L AMJP,HAN L E YJ J,B OO THPA,e t a l.S y n a p t i c o r-g a n i s a t i o no f t h eb a s a lG a n g l i aJ.J o u r n a l o fA n a t o m y,2 0 0 0,1 9 6(P t 4):5 2 7-5 4 2.2 1曹中凯,陈凤华,谢俊霞,等.帕金森病模型小鼠P V和NO S阳性神经元数目变化J.青岛大学学报(医学版),2 0 2 2,5 8(3):3 4 5-3 4 8.(本文编辑 马伟平)