贝莱斯芽孢杆菌HN-2次生代谢产物处理下黄单胞菌%28Xoo%29的转录组分析.pdf

文章编号：1674 7054(2023)04 0389 10贝莱斯芽孢杆菌 HN-2 次生代谢产物处理下黄单胞菌（Xoo）的转录组分析高雪，劳广术，谭峥，方渝凯，刘文波，靳鹏飞，缪卫国（海南大学 植物保护学院/热带农林生物灾害绿色防控教育部重点实验室，海口 570228）摘要：为探究贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezens）菌株 HN-2 正丁醇提取物对黄单胞菌(Xoo)的抑菌机制，分别用菌株 HN-2 正丁醇提取物和杆菌肽处理 12 h 后的 Xoo 进行转录组测序（RNA-seq）并利用 GO 数据库和KEGG 数据库对转录组数据进行分析。转录组数据分析结果表明，HN-2 正丁醇提取物和杆菌肽处理后Xoo 菌内均有大量差异表达基因（DEGs），HN-2 处理组共得到 1 512 个差异表达基因，其中上调表达基因871 个，下调表达基因 641 个；GO 富集分析发现 HN-2 正丁醇提取物处理后，Xoo 的差异表达基因主要聚类在代谢过程、细胞组分、大分子复合物、催化活性等方面；KEGG 聚类分析发现 HN-2 正丁醇提取物处理后，核糖体途径所包含的差异表达基因数目最多，差异最显著，其余主要参与的代谢途径有淀粉和蔗糖代谢、苯甲酸酯降解、甘油磷脂降解、细菌趋化性等。结果表明，HN-2 正丁醇提取物主要影响 Xoo 的核糖体途径、淀粉和蔗糖代谢途径、细菌趋化性途径。关键词：贝莱斯芽孢杆菌；黄单胞菌；抑菌活性；表达差异基因中图分类号：Q 78 文献标志码：A引用格式：高雪，劳广术，谭峥，等.贝莱斯芽孢杆菌 HN-2 次生代谢产物处理下黄单胞菌（Xoo）的转录组分析J.热带生物学报，2023,14（4）：389398.DOI：10.15886/ki.rdswxb.2023.04.006 水稻（Oryza sativa L.）白叶枯病是一种由黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）引起的细菌性病害，在各水稻种植区均有发生，并且危害严重，是我国水稻重要病害之一1。发病后叶片产生黄绿色病斑，最终变黄枯死，每年造成水稻产量减少 20%30%，严重时减产 50%，甚至绝收2。虽然目前有一些抗病品种，但是抗病性易随着时间而逐渐减弱。防治白叶枯病的化学药剂有铜制剂、有机磷、有机氮、噻唑类等3 8，这些药剂大部分在田间使用时易使病菌产生抗药性，对环境有影响。如噻枯唑在田间已有明显抗性9；5-氧吩嗪类药剂持效期短，病害易复发，水稻白叶枯病的防治形势依旧严峻。生物防治是一种高效且对环境友好的策略，可以用于植物病害的治理10。生防芽孢杆菌是目前应用最广泛的生防细菌之一，对各种真菌、细菌和病毒的侵染造成的植物病害，都能够有效地抑制11，并且还具有良好的促进植物增产、诱导植物抗病的能力。目前，越来越多生防芽孢杆菌被开发成农药，得到商品化产品12。芽孢杆菌能够产生次级代谢物质来抑制和杀灭有害微生物，这些活性代谢物质主要包括酶类、细菌素类，以及受到关注最多的脂肽类等13 14，如地衣形芽孢杆菌（Bacillus licheni formus）可以发酵产生一种具有良好的抑制细菌活性的脂肽类物质杆菌肽。杆菌肽目前作为一种多肽类抗生素已经被广泛地应 收稿日期：2022 04 28修回日期：2022 06 18基金项目：海南省基础与应用基础研究计划（自然科学领域）高层次人才项目（2019RC163）；海南省青年科技英才创新计划（QCXM201903）；国家自然基金地区科学基金项目（31960552）；海南省基础与应用基础研究计划（自然科学领域）高层次人才项目（322RC591）；海南大学校内科研启动经费项目 KYQD(ZR)1842第一作者：高雪（1997），女，海南大学植物保护学院 2019 级硕士研究生.E-mail：通信作者：靳鹏飞（1987），男，副教授.研究方向：微生物生物防治研究.E-mail：；缪卫国（1969），男，教授.研究方向：植物病理学研究.E-mail：M 第 14 卷 第 4 期热 带 生 物 学 报Vol.14 No.42023 年 7 月JOURNALOFTROPICALBIOLOGYJul.2023用于医学15。有研究16表明芽胞杆菌属（Bacillusspp.）能够产生具有较强拮抗 Xoo 的脂肽类活性物质。Bacillus strain D13 可以产生一种挥发性物质，该挥发性物质具有较好的抑制 Xoo 的活性17。解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens FZB42 分泌的抗生素类物质 bacilysin 和 difficidin 对水稻黄单胞菌 Xoo 具有显著的抑菌作用18。笔者所在实验室的研究19发现，贝莱斯芽孢杆菌 HN-2 产生的 C15surfactin A 对 Xoo 具有较强抗菌活性，能抑制 Xoo 的生长，并通过介导抗氧化剂相关酶的活性而引发过敏性反应，有效地诱导水稻对 Xoo 的抗性。虽然目前已经有一些关于芽孢杆菌抑制Xoo 的研究，然而贝莱斯芽孢杆菌抑制 Xoo 的作用机制尚不明确。因此，本研究以 HN-2 菌株发酵液正丁醇提取物处理 12 h 后的 Xoo 为研究对象，进行转录组测序和分析，拟求得 Xoo 应对 HN-2 抑菌活性成分的代谢途径基因表达差异图谱，为后续进一步揭示贝莱斯芽孢杆菌 HN-2 的抑植物病原细菌 Xoo 机理提供前期数据和理论参考。1材料与方法 1.1实验材料及样品准备 贝莱斯芽孢杆菌HN-2 为本实验室从土壤中分离保存，稻黄单胞菌Xoo（PXO99A）由笔者所在的实验室提供保存。杆菌肽（98%，分析纯）购自日本和光纯药株式会社有限公司。（1）HN-2 发酵活性物质的提取：接种HN-2 菌株于 LB 培养基 37，180 rmin1振荡培养 48 h 后，离心 10 min 弃去菌体，得到 HN-2 发酵液上清液。等比例并充分混合正丁醇和 HN-2 发酵上清液后，室温下静置过夜，用分液漏斗分离有机相得到上层正丁醇萃取液。在 67 下将得到的上层正丁醇萃取液进行旋转蒸发浓缩，蒸发浓缩后的沉淀用少量甲醇充分溶解并进行冷冻干燥12 h，得到 HN-2 抑菌活性成分粉末粗提物，80 保存备用，使用前称取 0.01 g 粗提物加入 1 mL的超纯水充分溶解，并用一次性细菌过滤器过滤。（2）样品处理：从平板上挑取黄单胞菌的单菌落接种至 PSA 液体培养基中，共接种 9 瓶，在 28，180 rmin1振荡培养至生长对数期（OD600=0.300）。此时向第一组菌液中加入 HN-2 正丁醇提取物至终浓度为 MIC50值（2.36 mgmL1），第二组菌液加入杆菌肽至终浓度为 MIC50值（11.96mgmL1），第三组菌液不做任何处理，继续振荡培养 12 h，3 次重复，将 HN-2 正丁醇提取物处理 12 h的样品命名为“Xoo-HN-2”，杆菌肽处理 12 h 的样品命名为“Xoo-G”，对照组命名为“Xoo-CK”。1.2转录组测序和生物信息学分析 样品Xoo 总 RNA 的提取使用天根 RNA 提取试剂盒，并将提取的 RNA 送到广州基地奥生物科技公司进行质检，以保证所有样品最终都获得高质量的总 RNA。利用 Illumina HiSeq X Ten 测序平台（Illumina Inc,CA,USA）进行转录组建库测序及分析。步骤：（1）去除核糖体 RNA；（2）RNA 随机打断为 200 nt 片段；（3）加入六碱基随机引物、缓冲液、dNTPs、RNase H 和 DNA 聚 合 酶 合 成cDNA 第一条链；（4）使用 dUTP 代替 dTTP，合成cDNA 第二条链；（5）末端修复 3、5端，加 A 尾，连接接头；（6）使用 UNG 酶降解 cDNA 第二条链，以保留 RNA 方向信息；（7）PCR 扩增产生 DNA 的聚集片段，完成文库制备；（8）利用 Illumina 测序平台对构建好的文库进行双末端测序，将所得数据过滤后用于后续的转录组分析20。1.3差异基因表达分析 对样品中的 Mappedreads 数目和转录本长度进行归一化处理，使用RAEM 软件，采用 FPKM（Fragments Per Kilobaseof transcript per Million fragments mapped）作为衡量转录本的指标21，采用皮尔森相关系数（PearsonCorrelation Coefficient，PCC）法检测重复样品之间的相关性，并利用 DESeq R 包分析不同处理后 Xoo的差异表达基因。为进一步控制该过程中的错误发现率（false discovery rate，FDR），使用 edgeR22软件对不同样品间差异表达基因定量分析。采用 FDR（false discovery rate）与 log2(FoldChange)（log2FC）来作为差异表达基因筛选的关键指标，筛选条件为 FDR1。1.4基因功能富集分析 将筛选得到的差异基因进行 GO 富集分析，用特定的 GO terms 给差异表达基因的表达模式注释；利用 KEGG 数据库找出在差异表达基因中，富集最显著的前 20 条代谢通路画图展示。2结果与分析 2.1RNA-seq 数据质控结果 转录组原始数据质控过滤前后的黄单胞菌 Xoo（PXO99A）转录组390热 带 生 物 学 报2023 年测序数据统计情况见表 1。由表 1 可见，CK 组、HN-2 组、杆菌肽组的样本通过测序获得的原始碱基数（Raw Data）分别为3 669 218 400、3 356 470 200和 5 089 554 000。3 组原始序列经过质控后获得的 Clean data 分别为 3 490 096 417、3 232 110 301和 502 049 243。过滤后的总碱基数占原始序列的比例分别为 98.55%、98.53%和 97.32%，Q20 分别为98.03%、98.03%和97.32%，Q30 分别为94.89%、94.89%和 92.0%，GC 含量分别为 61.61%、61.06%和 60.93%，这些结果表明过滤后所获得的序列质量较好，可靠性高，Clean reads 可以用于后续的生物信息学分析。表1Reads 过滤前后碱基信息统计结果样品碱基信息样本名Xoo-CKXoo-HN-2Xoo-G过滤前Raw data/bp3 669 218 4003 356 470 2005 089 554 000Q20/%3 596 827 023(98.03%)3 293 722 095(98.03%)4 948 281 317(97.22%)Q30/%3 481 614 115(94.89%)3 188 133 592(94.98%)4 674 417 659(91.84%)N/%5 182(0.0%)4 797(0.0%)41 169(0.0%)GC/%2 260 575 649(61.61%)2 049 438 853(61.06%)3 095 193 280(60.82%)Clean data/bp3 490 096 4173 232 110 3015 020 492 431过滤后Q20/%3 439 489 923(98.55%)3 184 723 700(98.53%)4 886 066 551(97.32%)Q30/%3 336 281 653(95.59%)3 087 417 164(95.52%)4 618 772 865(92.0%)N/%4 928(0.0%)4 619(0.0%)40 606(0.0%)GC/%2 158 506 542(61.85%)1 978 705 819(61.22%)3 059 001 170(60.93%)注：Raw data：原始下机数据碱基总数（bp）；Clean data：过滤低质量reads后获得的有效数据碱基总数及占raw data的百分比；Q20（%）：测序碱基正确率达99%以上的碱基数及占过滤前/后碱基总数的比例；Q30（%）：测序碱基正确率99.9%以上的碱基数占过滤前/后碱基总数的比例；N(%)：N碱基的数目及百分比；GC(%)：GC碱基数目及百分比。2.2样品重复性相关性检测 本实验共有 3 个样本（CK 组，HN-2 组，G 组），通过主成分分析（PCA）可以评价样品重复性、找出离群样品、评估组间差异等。使用 R 语言获得各个样本在第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）2 个综合变量中的数值大小，作二维坐标图。如图 1 所示，PC1 可以解释原所有基因的表达量总体方差的 71.3%，PC2 可以解释原所有基因的表达量总体方差的28.7%，PC1 与 PC2 共可以解释总体方差的 100%，表明样品重复性高，组间差异小。通过 R 计算3 个样本及每个样本的 3 个生物学重复间的皮尔森相关系数（Pearson Correlation Coefficient，PCC）。如图 2 所示，可以看到每个样本的 3 个生物学重复之间的相关系数呈对角线分布，表明测序数据具有较强的重复性和较高的可信度，可以用于后续的差异表达分析。2.3差异基因表达统计分析 如图 3 所示，HN-2组和杆菌肽组相比，共筛选到 1 226 个差异基因，其中有 612 个基因在 HN-2 组中上调，614 个基因 第一主成分(71.3%)样品Xoo-GPCAXoo-GXoo-CKXoo-CKXoo-HN-2Xoo-HN-225 00020 00010 000010 00020 00030 000025 00050 000第二主成分(28.7%)图 1 主成分分析 PCA 图坐标轴标签括号中的数值代表主成分解释总体方差的百分比。第 4 期高 雪等:贝莱斯芽孢杆菌 HN-2 次生代谢产物处理下黄单胞菌（Xoo）的转录组分析391在 HN-2 组中下调。杆菌肽组和 CK 组相比，共筛选到 1 146 个差异基因，其中，有 730 个基因在杆菌肽组中上调，416 个基因在杆菌肽组中下调。HN-2 组和 CK 组相比，共筛选到 1 512 个差异基因，其中有 871 个基因在 HN-2 组中上调，641 个基因在 HN-2 组中下调。此外无论是加入 HN-2还是杆菌肽，上调表达基因都多于下调表达基因，并且 HN-2 组表达差异的表达基因总数多于杆菌肽组，说明经 HN-2 处理后，Xoo 有更多的基因被调控来参与到对 HN-2 处理后的适应过程中。本研究重点关注的是不同处理之间的差异，因此对两两比较的差异基因绘制了韦恩图（图 4）。图 4可见，与杆菌肽组相比，HN-2 组有 275 个差异表达基因为其特有，是 HN-2 提取物与杆菌肽抑菌机制不同导致，这些 HN-2 组特有的差异基因有助于进一步研究 HN-2 对 Xoo 的作用机理。因此，在后续对于 HN-2 组的差异表达基因定性分析时，这275 个差异基因将作为重点研究分析对象。202259213552275472202Xoo-CK-vs-Xoo-GXoo-CK-vs-Xoo-HN-2Xoo-G-vs-Xoo-HN-2图 4 差异表达基因韦恩图 2.4GO 功能分析和 KEGG 通路分析 2.4.1 差异表达基因差异表达基因的的 G GO O 统计统计 从图 57 中可以看出，在生物过程中，HN-2 组的差异基因主要集中在单体有机体过程、代谢过程和细胞进程等功能条目中，其中，单体有机体过程包含 33 个差异基因，代谢过程包含 35 个差异基因；细胞进程中包含 20 个差异基因，在细胞组分中，HN-2 组的差异基因主要富集在细胞、细胞成分和大分子复合物等功能条目中，其中，细胞核细胞成分均包含 17 个差异基因；在分子功能中，HN-2 组的差异基因主要富集在结合、催化活性和结构分子活性等功能条目中，其中，结合过程包含 26 个差异基因，催化活性包含 24 个差异基因，结构分子活性包含 9 个差异基因。此外，可以看到虽然 HN-2 组和杆菌肽组的富集结果大致相似，但是 HN-2 组的差异基因数目（共 148 个差异基因）显著多于杆菌肽组的差异基因数目（共 117 个差异基因）。2.4.2 转录组数据转录组数据的的 KEGKEGG G 通路分析通路分析 对杆菌肽与 HN-2 正丁醇提取物处理后，菌株 Xoo 的代谢通路显著性富集分析，选取了富集最为显著的20 条代谢通路画图（图 810）展示。图 8 表明，与对照组相比，杆菌肽处理后，富集程度较高、富集较为显著且包含差异基因数目较多的途径有鞭毛组装、核糖体途径、细菌趋化性和双组分系统氧化磷酸化等；图 9 表明，与对照组相比，HN-2 正丁醇提取物处理后，核糖体途径所包含的差异表达基因富集的程度最高、富集最显著且差异表达基因的数目最多，其余主要参与的代谢途径有淀粉和 1.000 0 1.000 01.000 00.572 10.568 0 0.578 30.722 4 0.739 30.736 11.000 0 1.000 01.000 00.569 90.577 4 0.593 40.741 1 0.726 00.729 71.000 0 1.000 01.000 00.579 00.579 2 0.579 30.719 1 0.705 50.714 80.572 1 0.569 90.579 01.000 01.000 0 1.000 00.660 0 0.671 00.674 00.568 0 0.577 40.579 21.000 01.000 0 1.000 00.692 1 0.681 30.683 10.578 3 0.593 40.579 31.000 01.000 0 1.000 00.689 4 0.689 70.690 40.722 4 0.741 10.719 10.660 50.692 1 0.689 41.000 0 1.000 01.000 00.739 3 0.726 00.705 50.671 20.681 3 0.689 71.000 0 1.000 01.000 00.736 1CKCKCKCK1.00.90.80.70.6CKCKHN-2HN-2HN-2HN-2HN-2HN-2GGGGGG0.729 70.714 80.674 00.683 1 0.690 41.000 0 1.000 01.000 0 图 2 相关性热图皮尔森相关系数越趋近于 1 颜色越深，代表相关性越高。基因数目/个Xoo-G-vs-Xoo-HN-202506126147304168716415007501 000Xoo-CK-vs-Xoo-HN-2Xoo-CK-vs-Xoo-G 图 3 样品间差异基因统计红色代表上调表达的基因，蓝色代表下调表达的基因。392热 带 生 物 学 报2023 年 生物过程051015基因数目/个生物过程细胞成分组织或生物发生细胞进程定位运动代谢过程刺激反应单有机体过程细胞细胞组分大分子复合物膜膜组分细胞器细胞器组分结合催化活性结构分子活性转运蛋白活性细胞组分分子功能 图 5 样品间差异基因 GO 分类图（CK vs 杆菌肽）红色代表上调表达的基因，绿色代表下调表达的基因。生物过程061224基因数目/个生物过程细胞成分组织或生物发生细胞进程定位代谢过程刺激反应单有机体过程细胞细胞组分大分子复合物膜膜组分细胞器细胞器组分结合催化活性核酸结合转录因子活性结构分子活性转运蛋白活性细胞组分分子功能18 图 6 样品间差异基因 GO 分类图（CK vs HN-2）生物过程051015基因数目/个生物过程细胞成分组织或生物发生细胞进程定位运动代谢过程刺激反应单有机体过程细胞细胞组分大分子复合物膜膜组分细胞器细胞器组分结合催化活性核酸结合转录因子活性结构分子活性转运蛋白活性细胞组分分子功能 图 7 样品间差异基因 GO 分类图（杆菌肽 vs HN-2）第 4 期高 雪等:贝莱斯芽孢杆菌 HN-2 次生代谢产物处理下黄单胞菌（Xoo）的转录组分析393蔗糖代谢、苯甲酸降解、甘油磷脂降解、细菌趋化性等。因此，在后续对相关代谢途径的生物学验证中，可以重点关注和研究核糖体途径的淀粉蔗糖代谢中的差异表达基因。鞭毛组装基因数目102030401.000.750.500.25Q 值核糖体细菌趋化性蛋白质输出光合作用双组分系统氧化磷酸化NOD 样受体信号通路脂肪酸生物合成通路RNA 聚合酶碳青霉烯类生物合成次生代谢物的生物合成-未分类生物膜形成-大肠杆菌群体感应植物-病原菌相互作用苯丙氨酸代谢细菌分泌系统链霉素生物合成C5-支化二元酸代谢青霉素和头孢菌素生物合成富贵因子0.40.60.81.0 图 8 差异表达基因 KEGG 显著富集通路结果图（CK vs 杆菌肽）横坐标富集因子越大，表示该代谢通路富集的程度越高。Q 值越趋近于 0，颜色越偏红，表示该代谢通路的富集越显著。圆点的大小代表富集的基因数目的多少，圆点越大代表富集的基因数目越多。核糖体基因数目20103040500.750.500.25Q 值苯甲酸盐降解光合作用组氨酸代谢甘油磷脂代谢牛磺酸和亚牛磺酸代谢淀粉和蔗糖代谢细菌趋化性植物-病原体相互作用通路精氨酸生物合成氮代谢碳青霉烯类生物合成次生代谢物的生物合成-未分类其他聚糖降解膦酸盐和次膦酸盐代谢RNA 聚合酶氧化磷酸化芳香族化合物的降解肽聚糖生物合成半乳糖代谢富贵因子0.60.81.0 图 9 差异表达基因 KEGG 显著富集通路结果图（CK vs HN-2）394热 带 生 物 学 报2023 年3讨论黄单胞菌能够引起的水稻白叶枯病，是水稻生产上的一类重要细菌病害1。生防细菌贝莱斯芽胞杆菌 Bacillus velezensis 由 Ruiz-Garcia 等23发现并命名，因其具有对人畜和环境友好，菌株不易产生抗药性、在自然环境中易降解等特点而受到广泛的研究和关注24。贝莱斯芽孢杆菌具有优越的抑制细菌能力，它能够产生许多抑菌活性物质，其中关注度最高的是脂肽类物质15。本实验室的前期研究结果发现，贝莱斯芽孢杆菌 HN-2 菌株发酵液的正丁醇提取物对 Xoo 具有很强的抑菌活性，通过分离纯化，得到了正丁醇提取物中的主要活性成分，并利用高效液相色谱-质谱/质谱联用(HPLC-MS/MS)技术对其结构进行了鉴定，结果表明贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HN-2 正丁醇提取物中的 C15 surfactin A 对 Xoo 具有较强抗菌活性，能抑制 Xoo 的生长19，但其具体的抑菌机制尚不明确。已有研究通过对药剂处理前后转录组测序来探究抑菌物质对 Xoo 的作用机理，如 Fan 等25对邻香豆酸处理30 min、1 h、3 h、6 h 的Xoo 菌与DMSO对照处理的 Xoo 菌进行转录组测序，KEGG 聚类分析结果表明：在处理 30 min 后，差异表达基因没有明显聚类，主要都集中在代谢途径方面；处理1 h 后，氧化磷酸化途径富集最显著；处理 3 h 后，差异表达基因聚类在氧化磷酸化和蛋白质合成途径中；处理 6 h 后，差异表达基因集中在糖代谢途径、组氨酸代谢途径和细菌趋化性等方面。并且还发现，MarR 家族蛋白基因簇在 4 个时间段内都显著上调表达。据报道25MarR 家族蛋白与病原细菌转运抗生素有关。Liang 等26对经过噻枯唑处理 4.5 h 和 9 h 后的 Xoo 转录组进行分析，发现Xoo 的组氨酸代谢途径显著被噻枯唑所抑制。Chen 等27为了研究褪黑激素作为抗生素如何抑制黄单胞菌的生长，分析了 200 gmL1浓度褪黑素处理 21 h 的 Xoo 的转录组数据，结果表明，138 个基因的 mRNA 转录水平发生了变化，以应对褪黑激素的攻击。上调基因主要集中在鞭毛成分、转运蛋白活性等途径，而催化活性、金属结合活性、碳水化合物代谢和氨基酸代谢等途径显著下调表达。在本实验中，为进一步明确 HN-2 的抑菌机制，将杆菌肽和 HN-2 正丁醇提取物处理12 h 后 的 Xoo 菌 进 行 转 录 组 测 序。杆 菌 肽（Bacitracin）是 一 类 由 地 衣 芽 孢 杆 菌（Bacilluslicheni formus）发酵生产的一类脂肽类物质，具有良好的抑制细菌活性28。杆菌肽的作用机制明确，它通过抑制细胞壁的合成，对细胞膜造成损伤，使细胞质中离子和氨基酸外泄来发挥抑菌作用29。基因数目1051520250.750.500.25Q 值通路核糖体淀粉和蔗糖代谢细菌趋化性精氨酸生物合成星形孢菌素生物合成牛磺酸和亚牛磺酸代谢多环芳烃降解氮代谢缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成氨基糖和核苷酸糖代谢其他聚糖降解芳香族化合物的降解果糖和甘露糖代谢聚酮糖单元生物合成富贵因子0.60.81.00.4鞭毛组装生物膜形成-大肠杆菌苯甲酸盐降解阿卡波糖和有效霉素生物合成苯丙氨酸代谢细菌分泌系统 图 10 差异表达基因 KEGG 显著富集通路结果图（杆菌肽 vs HN-2）第 4 期高 雪等:贝莱斯芽孢杆菌 HN-2 次生代谢产物处理下黄单胞菌（Xoo）的转录组分析395与地衣芽孢杆菌一样，贝莱斯芽孢杆菌也能够通过非核糖体途径合成一些具有抑菌活性的脂肽类物质，因此本实验选择杆菌肽作为对比来检验贝莱斯芽孢杆菌 HN-2 的主要抑菌机制与杆菌肽是否具有相似性。转录组测序分析后发现 Xoo 的核糖体途径、淀粉和蔗糖代谢途径、细菌趋化性途径等在受到HN-2 正丁醇提取物的影响后显著上调表达，说明HN-2 正丁醇提取物很可能通过影响这些代谢途径而发挥抑菌能力。由图 4 可以看到，HN-2 组与杆菌肽组中相同的差异基因仅占 HN-2 组所有差异基因的 45.3%，HN-2 组还有 54.7%差异基因为其特有，因此，可以得出结论，HN-2 正丁醇提取物的抑菌活性与杆菌肽可能有部分相似性，但是其主要抑菌机理仍需要进一步探究与分析。通过KEGG 富集分析结果发现，HN-2 正丁醇提取物处理后，核糖体途径富集的程度最高、富集最显著、且包含的差异表达基因数目最多。在核糖体途径中发现显著上调表达的 rpoB，rpoB 基因是结核分枝杆菌（M.tuberculosis）中编码 RNA 聚合酶 亚基的基因。万智敏等30的研究结果表明，rpoB基因耐药决定区（rifampin resistance-determiningregion，RRDR）的突变可以引起 96%以上的结核分枝杆菌临床分离株对利福平耐药，并且 rpoB 基因不同的突变模式对利福平产生的耐药程度有显著的差异。由此可以推测菌株 HN-2 正丁醇提取物与利福平的抑菌机理可能存在一定相似性。此外，还发现核糖体途径中 secY、secE 和 secG 基因显著上调表达，secY、secE 和 secG 基因所编码的蛋白是分泌途径中主要的 3 种膜蛋白31，大多数细菌蛋白的运送都由 secYEG 复合体完成，可以推测HN-2 正丁醇提取物可能影响了 Xoo 中蛋白的分泌与运输，从而影响 Xoo 菌与外界的物质交换。同时还发现 HN-2 正丁醇提取物处理后 Xoo 内淀粉和蔗糖代谢途径中的差异基因数目较多，差异较显著，可以推测 HN-2 正丁醇提取物可能使Xoo 对淀粉和蔗糖等物质的代谢利用能力发生了改变。本研究中，对 Xoo 经过 HN-2 正丁醇提取物和杆菌肽处理 12 h 转录组的分析结果表明，HN-2 正丁醇提取物主要影响 Xoo 的核糖体途径、淀粉和蔗糖代谢途径、细菌趋化性途径。为进一步明确HN-2 对 Xoo 的抑菌机理提供了理论基础。参考文献：1 李争,熊鹂,纪志远,等.白叶枯病菌和细菌性条斑病菌多样性的 TALE 效应蛋白调控水稻抗(感)病性机理与利用策略J.中国农业科学,2013,46（14）:2894 2901.2 MANSFIELD J,GENIN S,MAGORI S,et al.Top 10plant pathogenic bacteria in molecular plant pathologyJ.Molecular Plant Pathology,2012,13（6）:614 629.3 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