Ion Torrent半导体测序联合MLPA技术检测神经纤维瘤患者的致病突变.pdf

：临床检验技术研究 半导体测序联合 技术检测神经纤维瘤患者的致病突变王玉国，马定远，刘刚，张菁菁，曾华沙，罗春玉，胡平，许争峰（南京医科大学附属妇产医院 南京市妇幼保健院遗传医学中心，南京）摘要：目的 建立临床适用的神经纤维瘤病（）的分子遗传分析方法，对 进行分子遗传诊断和遗传咨询，并对 家庭进行产前诊断。方法 以南京医科大学附属妇产医院遗传咨询门诊收治的 例 患者为研究对象，收集患者及其家属的外周血标本并提取基因组，应用 半导体测序技术进行 基因测序并结合多重连接探针扩增反应（）检测，筛选致病突变并用 测序验证，结合亲子二代的分子遗传检测结果，制定适当的临床干预和随访计划。在 家系母亲再次妊娠时，对胎儿进行产前诊断。结果 应用 半导体测序技术检测出 例致病突变和 例可疑致病突变，其中包括 个未报道过的新突变；应用 技术检测出 例拷贝数大片段缺失。对其中 个家系的孕妇行羊膜腔穿刺术抽取羊水进行产前诊断，其胎儿均不携带家系的致病突变。结论 基于 半导体测序及 技术建立的基因诊断方法可为 临床诊断及遗传咨询提供分子遗传学依据，具有较高的临床应用价值。关键词：半导体测序；神经纤维瘤病；基因中图分类号：文献标志码：，（，）：（），（），：；神经纤维瘤病（，）是发生于神经主干或末梢神经轴索鞘神经膜细胞及神经束膜细胞的良性肿瘤，属常染色体显性遗传病。约的 患者为神经纤维瘤病 型（），发病率约为 ，致病基因 结构复杂且未发现明显的突变热点，目前尚没有一种检测临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，基金项目：国家重点研发计划（）。作者简介：王玉国，年生，男，主管技师，硕士，从事单基因遗传病的分子诊断工作。通信作者：许争峰，主任医师，：。方法能鉴定所有类型的突变。神经纤维瘤病型（）较为罕见，发病率约为 万。发病机制十分复杂，多项研究表明，其与 基因突变、表观遗传修饰和细胞通路异常调控等因素有关。约 的 患者具有明确的家族遗传病史，且由新发突变引起。本研究拟建立临床适用的 及 的分子遗传分析方法，并对 患者进行分子遗传诊断，以期指导 家族的遗传咨询及产前诊断。研究对象与方法 研究对象 采集 年 月至 年 月南京市妇幼保健院遗传咨询门诊收治的 个家系的 例 患者为研究对象，其中包括 个家系的产前诊断病例。纳入标准：（）入组患者均经临床医生诊断最终证实；（）患者临床资料完整；（）患者对于本次研究内容知情同意。排除标准：（）患者存在精神障碍或沟通障碍；（）患者临床资料不完整；（）患者不愿意参与本次研究；（）患者存在影响本次研究结果的其他情况。本研究通过南京市妇幼保健院伦理委员会审核批准（宁妇伦字号），所有研究对象及家属均知情同意。主要仪器及试剂 分光光度计、扩增仪、基因分析仪及其配套试剂（美国 公司），全自动核酸纯化仪（厦门恺硕生物科技公司），、芯片（美国 公司）。检测试剂盒、检测试剂盒（荷兰 公司），血液基因组 提取试剂盒、培养细胞 提取试剂盒（厦门恺硕生物科技公司），、和性染色体倍型检测试剂盒（上海晶准生物医药公司），、（美国 公司），胶回收试剂盒（北京天根生化科技公司）。实验所有试剂均检验合格，按要求保存并在有效期内使用。方法标本采集和 提取受检者、分别为 年 月至 年 月于我院行羊膜腔穿刺术抽取胎儿羊水细胞，离心后置于 管中 冻存。其他受检者均采集外周血样本，置于 抗凝管中 保存。按血液基因组 培养细胞 提取试剂盒说明书提取 样本。采用 分光光度计检测 样本的浓度和纯度，血液基因组 浓度 ，吸光度（）在 内；培 养 细 胞 浓 度 ，在 内。样本置于 保存，应避免反复冻融。羊水标本母体污染检测 采用、和性染色体倍型检测试剂盒（荧光 毛细管电泳法）对胎儿羊水细胞基因组 及其父母外周血基因组 进行扩增，参照试剂盒说明书对 个 位点进行分析，并排除母体 污染。多重链接探针扩增反应（，）检测 基因和 基因大片段缺失按照 检测试剂盒说明书对 基因 个外显子的缺失和重复突变进行检测。试剂盒包含 对不同的探针，其中 对为参照探针；试剂盒包含 对探针，其中 对为参照探针。采用 检测试剂盒对 基因 个外显子和 个内含子的缺失和重复突变进行检测，试剂盒包含 对探针，其中 对为参照探针。具体操作步骤均按照试剂盒及仪器说明书进行。半导体测序步骤包括：（）文库构建：采用 进行 多重 扩增，采用 进行文库构建，对样本加上序列标签及测序接头。（）乳液 和 富集：采用 在 上进行乳液，对模板阳性磁珠颗粒（，）在 上进行富集。（）平台测序：采用 及 芯片在 平台进行测序反应。数据分析 采用 软件进行 数据提取、序列比对及 和 提取，得到的 和 经 （：）数据库过滤后，检索（：）、（：）等数据库及 相关文献，匹配已被报道的致病位点，对于发现的致病突变经 测序验证。测序法进行突变位点检测分别针对受检者相应突变位点设计 引物（表）进行 扩增，基因参照序列为，临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，基因参照序列为。反应体系：，（），（），模板 ，补足至 。循环参数：预变性 ；，循环 次；。扩增产物经 琼脂糖凝胶电泳后，采用 胶回收试剂盒纯化 片段，再用同样的引物进行 测序反应。测序反应产物纯化后，用 基因分析仪进行 测序检测。测序结果应用 软件包中的 程序进行序列比对。表 受检者的 引物序列受检者扩增区域引物名称引物序列（）退火温度（）产物大小（）、结果 测序结果分别对 共 个样本的 基因的全部 个编码外显子进行检测，编码区覆盖度，各外显子的平均测序深度均可达到。此外，对 基因的全部 个编码外显子进行检测，编码区覆盖度，各外显子的平均测序深度均可达到。测序结果显示，例患者中共检测出 种类型的突变（表）。检测出的内含子变异和同义突变（表）评估为非致病性变异。表 基因检测及致病性预测结果患者基因突变突变类型氨基酸改变基因型致病性 无义突变杂合致病无义突变杂合致病错义突变杂合可疑致病无义突变杂合致病无义突变杂合致病移码突变杂合致病无义突变杂合致病剪接突变杂合致病移码突变杂合致病无义突变杂合致病 注：，人类基因变异数据库；，无相关信息。检测结果对 测序结果为阴性的样本，应用 技术对上述受检者 基因 个外显子和 基因的 个外显子的缺失和重复突变进行检测，发现 患者的 基因及其上下游区域（基因 端上游和 端下游）的位点均杂合性缺失，为单一拷贝，其 基因未临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，见明显异常（图）。表 基因检测可能非致病的多态性变异患者基因位置突变基因型：（内含子变异）杂合：（）杂合：（内含子变异）杂合：（）杂合：（内含子变异）杂合：（内含子变异）杂合：（内含子变异）纯合：（内含子变异）杂合：（）纯合：（内含子变异）纯合：（内含子变异）杂合：（内含子变异）纯合：（内含子变异）纯合：（内含子变异）杂合：（内含子变异）纯合：（内含子变异）杂合：（）杂合：（内含子变异）杂合：（内含子变异）杂合：（内含子变异）杂合：（内含子变异）纯合：（内含子变异）纯合：（内含子变异）纯合：（）纯合：（内含子变异）杂合：（）纯合：（内含子变异）纯合注：、，基因 个外显子均为杂合性缺失，基因拷贝数未见明显异常。图 样本 检测结果临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，测序结果对 检测出的突变位点进行 验证，验证结果均与 测序结果一致（图）。注：，样本 基因 杂合突变；，样本 基因 杂合突变；，样本 基因 杂合突变；，样本 基因 杂合突变；，样本 基因 杂合突变；，样本 基因 杂合突变；，样本 基因 杂合突变；，样本 基因 杂合突变；，样本 基因 杂合突变；，样本 基因 杂合突变。图 基因突变的 测序验证结果 各家系产前诊断结果 进一步针对 个家系的羊水样本行基因检测，测序结果提示胎儿均不携带家系的致病突变（表）。表 个家系突变检测及产前诊断结果家系编号先证者基因突变突变类型是否致病孕妇携带者穿刺孕周产前诊断结果 是否 周 不携带 是否 周 不携带 是否 周不携带 是否 周不携带 是否 周不携带 讨论 基因结构复杂，对 基因进行特异性检测较为困难。国内外大量报道过 基因的突变类型，但研究结果均提示 基因没有突变“热临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，点”，大多数病例所发现的突变都是新发突变。基因是已知的人类基因中自发突变率最高的基因之一。有学者报道 基因有 个突变位点，包括染色体畸变、外显子缺失、插入、终止突变、氨基酸替代、内含子变异及 端非翻译区突变等。除少部分属大片段缺失或插入突变外，其余类型的突变均可通过直接测序来检测。数据库报道的 基因突变位点有 多种，其中以小片段缺失 插入最多，约占，其次是无义突变和错义突变，约占；再次为剪接突变，约占；大片段缺失也占据一定比例，约为；其余为罕见突变，如复合重排、大片段插入等。由于 基因突变位点和方式的多样性，目前没有一种方法可以同时检测出所有的突变类型。目前用于检测 基因突变的方法有多种，如单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、杂交分析以及变性高效液相色谱技术等。上述几种方法各有优缺点：单链构象多态性技术对点突变有较高的检出率，但无法检出内含子和启动子区域的点突变，也不能检测大片段的缺失，且存在一定的环境污染；变性梯度凝胶电泳则需要标记引物，存在放射性污染，这两种方法都比较费时费力；杂交分析技术可发现基因的部分或全部删除，但不适合基因点突变的检测；变性高效液相色谱技术则只能检测杂合性突变等。半导体测序技术具有独特的优势，它的优点是速度快、效率高、成本低，可以同时检测多个样本。与传统 测序相比，测序不需要进行荧光标记，也不需要进行电泳分离，对环境污染较其他方法大大降低，又可以明显缩短测序时间和降低成本，因此越来越多地应用于复杂疾病的临床研究。是近几年发展起来的一种针对待检 序列进行定性和半定量分析的新技术。技术高效、特异、快速且简便，能在一次反应中检测多达 个核苷酸序列拷贝数的改变，已经应用于多个领域、多种疾病的研究。笔者应用 半导体测序技术结合 检测技术检测出无义突变 个，错义突变 个，移码突变 个，剪接突变 个，还有 例拷贝数大片段缺失。除样本 突变位点位于 基因，其他突变均位于 基因。其中包括 个暂未见文献报道的突变位点，为新发突变。两种方法联合使用可以有效筛查 的突变类型并降低漏筛率。基因检测不仅可早期确诊突变类型，更能进一步预测病情的发生规律，也是家系进行疾病筛查的重要手段。在患者出现症状前进行基因测序，有助于临床早期制定治疗和长期护理方案。笔者还对其中 个家系进行了产前咨询和诊断，结果提示胎儿均不携带致病性突变，减轻了家庭的精神负担和经济负担。参考文献，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：朱艳慧，胡朝晖，毕欣，等 测序技术检测 型神经纤维瘤病患者 基因突变 临床检验杂志，（）：，：（收稿日期：）（本文编辑：许晓蒙）临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，