1、Correspouxlman生物工程359.BME&ClinMed,May2023,Vol.27,No.3生物医学工程与临床2 0 2 3年5月第2 7 卷第3期网络出版时间:2 0 2 3-0 4-2 116:13:30 D0I:10.13339/j.c n k i s g l c.2 0 2 30 42 0.0 19网络出版地址:https:/ 5只,鼠龄1012周,体质量50 2 8 0 g。随机分为4组,即假手术组、模型组、miR-NC组和miR-181b组。除假手术组外,其他3组采用大脑中动脉线栓法建模,miR-NC组和miR-181b组大鼠分别尾静脉注射miR-NC及miR-181
2、b质粒。治疗2 周后,评价大鼠改良神经功能缺损评分(mNSS)。进行脑组织2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色,免疫荧光检测脑组织簇分化抗原34(CD34)、血管内皮生长因子(VEGF)表达。对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)进行转染,分为Control组(正常培养)、miR-NC组(转染miR-NC空质粒)及miR-181b组(转染miR-181bmimics质粒)。CCK-8检测细胞增殖能力。划痕实验检测细胞迁移能力。成管实验检测成管能力。荧光素酶报告实验检测miR-181b与磷酸酯酶-张力蛋白同源物基因(PTEN)的靶向关系。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞、组织mi
3、R-181b表达水平。Westernblot检测细胞、组织中PTEN蛋白表达水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠mNSS、脑梗死面积升高(t=17.420,34.000,P0.05)。与miR-NC组比较,miR-181b组大鼠mNSS、脑梗死面积降低(t=14.730,21.160,P0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠脑组织中miR-181b表达(0.140.0 2),CD34阳性细胞率(45.0 3%5.2 2%),VEGF阳性细胞率(2 5.0 6%5.11%),CD34、VEG F蛋白表达水平(0.2 50.0 6、0.2 10.0 4)下降,PTEN蛋白表达水平(0.930.0
4、5)升高(P0.05)。与miR-NC组比较,miR-181b组大鼠脑组织中miR-181b表达(3.0 2 0.45),CD34阳性细胞率(6 8.7 3%7.0 4%),VECF阳性细胞率(0.2 3%0.0 6%),CD34、V ECF蛋白表达水平(0.8 6 0.12、0.7 2 0.0 9)升高PTEN蛋白表达水平(0.37 0.02)下降(P0.05)。m iR-18 1b 组细胞miR-181b表达水平,细胞2 4h、48 h 及7 2 hOD值、迁移率,节段长度、分支长度、连接数和网孔数高于miR-NC组(P0.05)。m i R-18 1b 可负性调控PTEN表达。结论过表达
5、miR-181b可靶向PTEN改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能,促进血管新生。关键词:miR-181b;人张力蛋白同源物基因(PTEN);缺血性脑卒中;血管新生中图分类号:R743.3文献标识码:A文章编号:10 0 9-7 0 9 0(2 0 2 3)0 3-0 359-0 8Effect and mechanism of miR-181b in regulating angiogenesis after ischemic stroke via targeting PTENZHANGYe,ZHUANG Xue-ming,WANG Jing,XU Hai-ting,WANG Zhong-xi
6、ang,WANG Shi-bo,ZHANG Li,TANG Guang-(Department of Emergency,the 904th Hospital of Joint Support Force of the Chinese Peoples Liberation Army,W214000,Jiangsu,China)nding author:TANG Guang-man.E-mail:.Abstract:Objective To investigate the effect and mechanism of miR-181b on angiogenesis after ischemi
7、c stroke.MethodsA total of 65 SPF grade male SD rats were sacrificed,with age of 10-12 weeks and body mass of 50-280 g.All of the ratswere randomly divided into 4 groups:sham group,model group,miR-NC group and miR-181b group.Except control group,other three groups were modeled by middle cerebral art
8、ery occlusion method,the rats in miR-NC group and miR-181b groupwere injected with miR-NC and miR-181b plasmid through tail vein,respectively.After treatment for 2 weeks,the modifiedneurological severity score(mNSS)was evaluated.The expression of cluster differentiation antigen 34(CD34)and vascular
9、en-dothelial growth factor(VEGF)in brain tissue was detected by immunofluorescence.The human umbilical vein endothelial cell(HUVEC)were transfected and divided into control group(normal culture),miR-NC group(transfected miR-NC empty plasmid)and miR-181b group(transfected miR-181b mimics plasmid).The
10、 cell proliferation ability was detected by cell counting kit-8(CCK-8)assay;cell migration ability was detected by scratch assay;tube formation assay was used to detect tube formationaility;the targeting relationship between miR-181b and human tensin homologue gene(PTEN)was detected by luciferase re
11、-porter assay;quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction(qRT-PCR)was used to detect expression level ofmiR-181b in cells and tissues;Western blot was used to detect expression levels of PTEN,CD34 and VEGF protein in cells and作者单位:中国人民解放军联勤保障部队第九四医院急诊科,江苏无锡2 140 0 0作者简介:张烨(198 4一),
12、男,江苏徐州市人,本科,主治医师,主要从事急诊脑卒中、胸痛中心和外周血管手术治疗工作。电话:0 510-8 5142 16 0。E-mail:。基金项目:无锡市卫生健康委员会科研项目(Z201909)通信作者:唐广满(198 5),男,山东泰安市人,研究生,主治医师,主要从事脊柱侧弯治疗工作。电话:158 52 50 6 96 3。E-mail:40 9536 37 0 q q.c o m。版权保护,不得翻录。360-BME&Clin Med,May 2023,Vol.27,No.3生物医学工程与临床2 0 2 3年5月第2 7 卷第3期tissues.Resultss Compared wi
13、th sham group,mNSS and cerebral infarction area of model group were increased(t=17.420,34.000,P 0.05).Compared with miR-NC group,mNSS and cerebral infarction area in miR-181b group were decreased(t=14.730,21.160,P 0.05).Compared with sham group,the expression of miR-181b(0.14 0.02),CD34 positive rat
14、e(45.03%5.22%),VEGF positive rate(25.06%5.11%),CD34 and VEGF protein expression levels(0.25 0.06,0.21 0.04)in braintissue of model group were decreased,and PTEN protein expression level(0.93 0.05)increased(P 0.05).Compared with miR-NC group,miR-181b expression(3.02 0.45),CD34 positive rate(68.73%7.0
15、4%),VEGF positive rate(0.23%0.06%),CD34 and VECF protein expression levels(0.86 0.12,0.72 0.09)in brain tissue of miR-181b group were increased,whilePTEN protein expression level(0.37 0.02)decreased(P 0.05).MiR-181b negatively regulated PTEN expression.The expres-sion level of miR-181b,optical densi
16、ty(OD)value,migration rate,segment length,branch length,connection number and meshesof cells at 24-hour,48-hour and 72-hour in miR-181b group were higher than those in miR-NC group(P 0.05).The miR-181b negatively regulated PTEN expression.Conclusion It is demonstrated that overexpression of miR-181b
17、 could target PTENto improve neural function and promote vascularization in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury.Key words:miR-181b;human tensin homologue gene;ischemic stroke;vascular neurogenesis缺血性脑卒中是脑血管疾病常见类型,也是老年人死亡的常见病因,主要病理为脑血管灌注不足,导致脑组织局部缺血、坏死,进而出现神经功能障碍。在脑动脉阻塞后,脑梗死恢复区的血管内皮细胞增殖,形成
18、新生血管,保护神经细胞。因此,如何促进血管新生成为缺血性脑卒中治疗的关键点。微小RNA(mircoRNA,miRNAs)是一类非编码RNA,在调控细胞各种生物学功能中发挥重要作用。最近研究发现,miRNAs在调控脑梗死血管新生中扮演着重要角色2 4。miR-181b是最近发现的一种miRNA,在调控肿瘤、心脑血管疾病中发挥作用5,6 。葛丽等7 研究发现,miR-181b在动脉粥样硬化血管内皮细胞中低表达,上调miR-181b可抑制细胞调亡、促进细胞增殖。但miR-181b与缺血性脑卒中后血管新生的关系尚不清楚。人张力蛋白同源物基因(phosphate and tensionhomology
19、deleted on chromosome 10,PTEN)是一种与侵袭和血管生成过程有关的致癌基因,上调PTEN可抑制多种疾病的血管生成8 10 。研究发现,miR-21-5p可通过PTEN/肌醇磷脂-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threoninek-inase,AKT)通路调控脑梗死后血管内皮细胞功能叫但miR-181b是否亦能调控PTEN影响血管新生尚不清楚。笔者研究通过构建大鼠脑缺血模型,观察miR-181b对大鼠脑组织血管生成的影响,并通过体外实验探讨miR-181b对血管内皮细胞增殖、迁移的影响
20、及可能机制1材料与方法1.1实验材料1.1.1实验动物65只SPF级雄性SD大鼠,鼠龄10 12 周,体质量50 2 8 0 g。购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司,动物许可证号SCXK(苏)2 0 18-0 0 0 8。动物饲养于无锡恒泰实验动物养殖有限公司,昼夜交替12h,温度2 4,湿度45%。动物实验经中国人民解放军联勤保障部队第九四医院伦理委员会批准(20220012)。1.1.2细胞与主要试剂人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical veinendothelialcells,H U VEC)(上海弘顺生物科技有限公司,中国)。达氏修正伊氏培养液/营养混合(Dulbec
21、cosmodified Eagles medium/nutrient mixture F-12,DMEM/F-12)、胰酶及青霉素/链霉素(上海如吉生物科技发展有限公司,中国);miR-NC质粒、miR-181bmimics质粒、野生型(wildtype,W T)-PT EN载体、突变型(mutant,MUT)-PTEN载体及聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEC)包备的脂质体(北京擎科生物有限公司,中国);Lipofectamine 2000,CCK-8(c e l l c o u n t i n g k i t-8)试剂盒及Matrigel胶(武汉卡诺斯科技有限公司,中国)
22、;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenylte-trazoliumchloride,TTC)试剂(武汉华翔科洁生物技术有限公司,中国);荧光素酶报告试剂盒(艾美捷科技有限公司,中国);Mir-XmiRNAFirst-StrandSynthesisKit(TAKARA生物有限公司,日本);兔抗鼠簇分化抗原34(clusterofdifferentiation34,CD34)、山羊抗鼠血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、兔抗鼠磷酸酯酶-张力蛋白同源物(phos-phatase and tensin homolog,
23、PTEN)、二抗(北京普鲁顿生物科技有限公司,中国);异硫氰酸荧光素(fluores-cein isothiocyanate,FITC)、藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标记的二抗及4,6-二基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino 2-phenylindole,DAPI)(北京中杉金桥生物有限公司,中国)。1.1.3仪器酶标仪(南京贝灯医疗器械有限公司,中国);聚361生物医学工程与临床2 0 2 3年5月第2 7 卷第3期BME&Clin Med,May2023,Vol.27,No.3合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪(A BI公司
24、,美国);ZEISSAxioZoom.V16蔡司荧光显微镜(蔡司,德国)。1.2方法1.2.1动物实验1.2.1.1动物模型制备与分组随机将6 5只大鼠分为假手术组15只,其余50 只大鼠进行建模。50 只大鼠成功建模45只,成功率90%。将45只建模成功的大鼠随机分为模型组、miR-NC组及miR-181b组,每组15只。使用大脑中动脉线栓法进行大鼠脑缺血再灌注模型的制备。具体步骤如下:将SD大鼠采用乙醚麻醉后,放置于操作台上,消毒;解剖出右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉;在颈内、外动脉交汇处用丝线将颈内动脉挂线阻塞,2 h后解除丝线;等待大鼠清醒后采用Zea-Longa神经功能评分法判断建
25、模的成功与否(评分2 分提示建模成功,2 分提示建模失败)。1.2.1.2大鼠治疗方法假手术组大鼠暴露颈内、外动脉后不进行结扎,其他组处理与模型组大鼠一样。术后6 h对各组大鼠进行干预:miR-NC组大鼠给予尾静脉注射PEG-miR-NC(2mg/kg,1次/天);miR-181b组大鼠给予尾静脉注射PEG-miR-181b(2mg/kg,1次/天);模型组、假手术组大鼠给予尾静脉注射PEG包备的空载脂质体(2 mg/kg,1次/天)。所有大鼠治疗2周后进行后续实验1.2.1.3大鼠改良神经功能缺损评分分别于治疗前、治疗后14d,对大鼠进行大鼠改良神经功能缺损评分(modified neuro
26、logical severity score,mNSS),该评分共包括运动、感觉、平衡木、反射消失或动作异常等项目,满分18 分,分值越高,神经系统损伤越重。1.2.1.4 脑组织TTC染色治疗14d后安乐死各组大鼠,无菌下获取脑组织,于-8 0 条件下冷冻,制备2mm的冰冻切片。在室温下使用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染料孵育30 min。然后将切片在4条件下用4%多聚甲醛中固定、保存。采用ImageJ软件计算梗死面积(梗死部位呈灰白色)。1.2.1.5免疫荧光检测脑组织中CD34、V EG F表达将各组大鼠脑
27、组织用甲醛溶液浸泡48 h后,石蜡包埋,制备切片5m;依次通过二甲苯、梯度酒精脱水,柠檬水高压修复抗原,山羊血清室温封闭1h后加人CD34(1:2 0 0)、VEG F(1:2 50)一抗4冰箱过夜,其次复温后加入对应的二抗室温避光孵育1h,洗涤3次后加人含有DAPI的封片剂封片;干燥,倒置荧光显微镜拍照,用ImageJ软件分析荧光强度。1.2.2体外实验1.2.2.1细胞培养及分组对HUVEC使用DMEM/F-12培养液(含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素)。培养条件:体积分数5%CO2、37 待细胞融合达到80%时传代。取传3代的细胞进行转染,使用Lipo-fectamine2000将不
28、同物质转染至HUVEC,分为Control组(正常培养)miR-NC组(转染miR-NC空质粒)及miR-181b组(转染miR-181bmimics质粒)。各组细胞继续培养2 4h后进行后续实验1.2.2.2实时荧光定量聚合酶链反应收集各组细胞及脑组织,加人1mLTrizol试剂提取总RNA。使用miRNA逆转录试剂盒、TBGreen荧光定量试剂盒检测miR-181b表达水平,U6为内参。反应体系(2 5L):TBGreenAdvantagePremix(2X)12.5L,上下游引物各 0.5 L,ROX Dye(50X)0.5 L,cDNA 2.0 L,ddH09L。循环条件:955s,6
29、02 0 s,共40 个循环。检测细胞、组织miR-181b表达水平。相对表达量用2-AC法计算。miR-181b上、下游引物:5-ATGGTTCGTGGGTTCA-CA-3,5-GTGGCTAAGTTCCGACG-3;U6上、下游引物:5-TACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG-3,5-ACACGATTCGTGAAGCGTTCCATA-3。1.2.2.3CCK-8检测细胞增殖能力制备单细胞悬液,将2 10 3个细胞接种到96 孔板。培养2 4h、48 h及7 2 h后加人10 LCCK-8溶液,于37 条件下避光培养4h,用酶标仪检测450 nm处的光密度(opti-cal d
30、ensity,OD)值。1.2.2.4划痕实验检测细胞迁移能力取对数生长期的细胞,用胰酶消化后,按照每孔2 10 5个细胞接种到6 孔板,待细胞融合达到8 0%时在板底部使用白色枪头划线,再磷酸盐缓冲溶液(phosphate bufferedsaline,PBS)洗涤3次后,换成无血清培养液继续培养24h;然后再光学显微镜下拍照,测量细胞间距离。迁移率(%)=(0 h细胞间距离-2 4h时细胞间距离)/0 h细胞间距离10 0%。1.2.2.5成管实验首先把Matrigel胶与无血清培养液按照1:2 比例铺到2 4孔板中。然后将制备好的细胞悬液,按照310 4/孔细胞接种到板中,继续培养4h后
31、光学显微镜下拍照,任意选取5个视野,测量内皮细胞伸出分支的长度即为成管长度。两个细胞之间的连接数量即为连接数,细胞之间形成的网孔即为网362-BME&Clin Med,May 2023,Vol.27,No.3生物医学工程与临床2 0 2 3年5月第2 7 卷第3期孔数,取平均值。1.2.2.6荧光素酶报告实验通过 TargetScan 在线网站(http:/www.targetscan.org/)预测miR-181b 与PTEN的靶向关系。将miR-NC或miR-181bmimics分别与WT-PTEN、M U T-PT EN载体共转染至HU-VEC细胞,继续孵育48 h后收集各孔细胞,裂解各
32、组细胞并收集上清液,然后按照试剂盒说明检测细胞荧光素酶相对活性。1.2.2.7Westernblot检测收集各组细胞及脑组织,加人细胞裂解溶液提取总蛋白,于10 0 煮5min后检测蛋白浓度及纯度。制备10%分离胶及5%浓缩胶,每孔中加人30 g蛋白样品,在110 V电压下将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上,用5%无脂牛奶室温下封闭1h,加人PTEN(1:1000)、-actin(1:1000)一抗,4C条件下过夜。次日将PVDF膜与二抗室温下孵育1h,加入发光液,曝光,用ImageJ分析灰度值,采用目标蛋白/-actin表示蛋白相对表达量。检测细胞、组织中PTEN表达水平1.3统计学方法使用SPS
33、S21.0统计软件进行分析。计量资料使用均数标准差表示,数据呈正态分布时,多组间行ANOVA检验,两组间使用SNK-q检验。P0.05)。治疗14d后,与假手术组比较,模型组大鼠mNSS升高(g检验统计量=17.42 0,P0.05);与miR-NC组比较,miR-181b组大鼠mNSS降低(t=14.730,P0.05)。提示造模成功。见表1。表14组大鼠mNSS比较Tab.1Comparison of mNSS of rats in 4 groups项目假手术组模型组miR-NC 组miR-181b 组治疗前0.54 0.0414.54 2.0414.51 1.7814.49 2.04治疗
34、后0.53 0.0314.52 3.1114.48 2.115.84 0.840.7750.0210.04015.190P0.4450.9840.9670.0012.1.24组大鼠脑梗死面积比较与假手术组(0.0 8 0.0 1)比较,模型组大鼠脑梗死面积增加(79.11 9.05。t =34.0 0 0,P 0.0 5)。与业miR-NC组(7 1.0 17.2 3)比较,miR-181b组大鼠脑梗死面积降低(2 4.12 5.32。t=21.160,P0.05)。见图1。假手术组模型组miR-NC 组miR-181b 组图14组大鼠脑梗死面积比较Fig.1Comparison of cer
35、ebral infarction area of rats in 4 groups363-生物医学工程与临床2 0 2 3年5月第2 7 卷第3期BME&Clin Med,May 2023,Vol.27,No.32.1.34组大鼠脑组织中miR-181b表达水平比较与假手术组(0.7 40.11)比较,模型组大鼠脑组织中miR-181b表达下降(0.140.0 2。t=20.780,P0.05)。与miR-NC组(0.16 0.0 3)比较,miR-181b组大鼠脑组织中miR-181b表达升高(3.0 2 0.45。t=24.56,P0.05)2.1.44组大鼠脑组织中CD34、V EC F
36、蛋白表达水平比较与假手术组比较,模型组大鼠脑组织中CD34、VECF阳性细胞率(45.0 3%5.2 2%vs76.11%6.02%、2 5.0 6%5.11%v s 8 9.43%8.0 7%)及蛋白表达水平(0.2 50.0 6 vs0.910.09.0.210.04vs0.890.11)下降(t=15.37、2 6.2 7、2 3.6 3、2 2.50,P 0.0 5)。与miR-NC组比较,miR-181b组大鼠脑组织中CD34、VEGF阳性细胞率(6 8.7 3%7.0 4%vs43.76%5.17%、21.43%5.02%vs0.23%0.06%)及蛋白表达水平(0.91 0.09
37、 vs 0.86 0.12、0.7 2 0.0 9 v s 0.19 0.0 2)升高(t=11.26、14.8 8、18.19、2 2.2 6,P0.05);而miR-181b组细胞miR-181b表达水平(2.310.32)高于miR-NC组(t=10.890,P0.05。迁移率:t=0.480,P0.05)。m iR-181b组细胞48 h及7 2 hOD值、迁移率高于miR-NC组(0.47 0.0 5vs0.340.04,0.990.06vs 0.630.05、为影响364-BME&Clin Med,May 2023,Vol.27,No.3生物医学工程与临床2 0 2 3年5月第2
38、7 卷第3期0.870.11vs 0.34 0.06)(0D值:t=6.245、17.2 9,P0.05。迁移率:t=7.326,P0.05)。m i R-18 1b 组成管长度(2 48 410 5)、分支长度(12 3410 3)、连接数(536)和网孔数(2 13)高于 miR-NC组(t=14.43、14.97、9.311、8.337,P0.05);而miR-181b组细胞PTEN蛋白表达水平(0.12 0.0 2)低于miR-NC组(t=6.301,P0.05)。Control 组miR-NC 组miR-181b 组图5过表达miR-181b对HUVEC成管作用的影响Fig.5Dia
39、grams of effect of overexpression miR-181b on angiogenesis of HUVEC与假手术组比较,模型组大鼠脑组织PTEN蛋白表达水平(0.930.0 5vs0.310.04)升高(t=16.770,P0.05)。与miR-NC组比较,miR-181b组大鼠脑组织PTEN蛋白表达水平(0.37 0.0 2 vs0.960.08)降低(t=12.390,P 0.05)。miR-181b与PTEN核苷酸存在结合位点。WT-PTEN+miR-181b组细胞荧光素酶活性低于WT-PTEN+miR-NC 组(0.2 1 0.0 1 vs 1.00 0.
40、01)(t=BME&ClinMed,IMay2023.Vol.27.No.3365-生物医学工程与临床2 0 2 3年5月第2 7 卷第3期61.19,P0.05)。这些结果提示两者存在靶向调控关系。见图6。ACDEBPTEN470005.CCCUGCCCCGCCCCUCUCCAA.33.AGUUUGACGGAAAGAGAGGU.3-actin42.000C:Control 组;D:miR-NC 组;E:miR-181b组图6 3组细胞PTEN蛋白表达水平电泳图(A)和miR-181b与PTEN基因核苷酸结合位点(B)Fig.6Electrophoretogram of PTEN protei
41、n expression level(A)and nucleotide binding site of miR-181b and PTEN(B)in 3 groups3讨论缺血性脑卒中是一种全球性疾病,其发病率和死亡率均较高,目前尚无有效的治疗方法。普遍认为,在脑卒中后脑功能的恢复高度依赖于血液供应的有效恢复。血管生成是一种生理过程,通过现有血管的延伸或扩展来形成新的血管。这一过程依赖于内皮细胞,并受到多种血管生成刺激因子和抑制因子的调控。miRNAs是一种约2 2 nt的RNA,通过与mRNA目标的3 非翻译区(3-untranslated region,3-UTR)结合,介导转录后调控。研
42、究表明,miRNAs在多种缺血性疾病中血管生成的调控中发挥重要作用12 14。然而,血管生成相关的miRNAs在血管生成的调控机制还有待进一步探讨。miR-181b是近年来发现的miRNA重要类型,在调控血管生成中发挥重要作用。WangY等15 发现miR-181b促进食管癌的血管生成,而另外研究表明miR-181b抑制HUVEC在体外的迁移和管形成0。最近研究发现,miR-181b在缺血性脑卒中动物模型及细胞模型中表达17 ,但miR-181b是否参与调控了缺血性脑卒中血管生成尚不清楚。笔者研究结果表明,miR-181b在脑缺血再灌注模型大鼠脑组织中低表达,与前面研究结果一致。mNSS是评价
43、脑缺血严重程度及治疗效果的常用指标。研究结果显示,模型大鼠mNSS明显降低,说明脑缺血再灌注大鼠存在严重的脑缺血损伤,提示造模成功;miR-181b过表达质粒治疗后,模型大鼠的mNSS明显下降,提示miR-181b上调改善了脑缺血大鼠的神经功能。脑梗死面积是评价神经元损害最为直接的指标。笔者研究结果显示,miR-181b过表达质粒治疗后的脑梗死面积显著下降,提示miR-150可改善脑缺血梗死面积的增加。上述结果证明miR-181b过表达对脑缺血大鼠具有一定的改善功能。为进一步探索miR-181b对脑缺血大鼠脑组织中血管生成的影响,笔者观察了脑组织中CD34、VEGF的表达,结果发现,miR-1
44、81b过表达质粒治疗后的大鼠脑组织高表达CD34、V EG F。V EG F是调控血管生成的关键因子,与受体结合后促进血管内皮细胞的增殖、迁移等,促进血管新生,改善微循环,保护神经细胞。CD34是血管内皮细胞的标志物,其表达水平与血管数量成正比。随后体外实验观察了miR-181b对HUVEC增殖、迁移及成管的影响,结果表明,上调miR-181b可促进HUVEC增殖、迁移及成管,提示miR-181b过表达可促进血管新生。miRNAs一般与下游的靶基因结合后发挥作用,通过生物信息学网站预测发现,miR-181b与PTENmRNA核苷酸存在结合位点,提示两者可能存在调控关系。PTEN在调控细胞侵袭和
45、血管生成中扮演着重要角色18 。最近研究发现,多种miRNAs可靶向PTEN调控缺血性疾病,如miR-499a可通过靶向PTEN减轻缺血性脑卒中的星形细胞介导的炎症反应19。此外,microRNA-221通过调控PTEN/PI3K/AKT途径调节内皮细胞功能参与缺血性脑卒中的研究2 0 。笔者研究结果显示,缺血再灌注大鼠脑组织高表达PTEN蛋白,经过miR-181b过表达质粒治疗后PTEN表达水平明显降低。随后的体外实验进一步表明,过表达miR-181b的HUVEC低表达PTEN,提示miR-181b与PTEN存在靶向关系。最后荧光素酶实验结果提示miR-181b可负性调控PTEN。但笔者研究
46、也存在一些问题需要进一步解决。第一,miR-181b在缺血性脑卒中患者外周血中表达情况需要进一步明确;其次,PTEN对HUVEC功能的影响需要基础研究探索。综上所述,miR-181b在缺血再灌注损伤大鼠脑组织中低表达,上调miR-181b可通过负性调控PTEN促进新生血管生成从而保护脑组织,有望成为缺血性脑卒中的治疗靶点。参考文献:1 Paul S,Candelario-Jalil E.Emerging neuroprotective strate-366-BME&Clin Med,May 2023,Vol.27,No.3生物医学工程与临床2 0 2 3年5月第2 7 卷第3期gies for
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