赶黄草提取物对大鼠胆汁淤积性肝纤维化TGF-βSmad途径的影响.pdf

目 录1.赶黄草提取物对大鼠胆汁淤积性肝纤维化TGF-p/Smad途径的影响.11.1 中文摘要.11.2 英文摘要.31.3 前言.61.4 材料与方法.81.5 结果.151.6 讨论.341.7 结论.381.8 参考文献.391.9 英汉缩写对照表.442致谢.453综述转化生长因子于1在肝纤维化中的作用.46赶黄草提取物对大鼠胆汁淤积性肝纤维化 TGF-p/Smad途径的影响 摘 要目的：研究赶黄草提取物(th e extracts fro m Pen th o rum Ch in ese Pursh)在TGF-p/Smad途径上对胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝组织病理 改变的影响和治疗作用。方法：将雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠按胆 管结扎法建立胆汁淤积性肝纤维化模型。将建模成功的40只大鼠，随机分为单纯胆管结扎组，赶黄草高、低剂量治疗组(4g/kg-ld-l,2g/kgld-l)，熊去氧胆酸治疗组(30mg/kg)，每组 10 只。另随机取10只正常大鼠列为正常对照组进行对照研究。各组大 鼠均采用灌胃法进行干预，正常组与单纯胆管结扎组给予同等剂量的 生理盐水灌胃。分别于术后14天、28天抽心脏血检测血清透明质酸(h yaluro n ic acid,HA)、层粘连蛋白(lamin in,LN)、IV型胶原蛋白(co llagen type IV,CI V)水平检测肝功水平(ALT、AST、ALB、DBI L、TBI L)o同时，对5组大鼠行部分肝组织活检，若裸鼠在 实验过程中死亡，则及时尸检。HE染色观察肝组织病理变化，Masso n染色观察肝纤维化程度。免疫组化En visio n法检测转化生长 因子 pi(tran sfo rmin g gro wth facto r(31,TGF-pi)、Smad3、Smad7 和a-SMA的表达。结果：第14天和第28天时赶黄草高、低剂量 组和熊去氧胆酸组大鼠血清HA、LN、CI V值均低于单纯结扎组(P 0.05)o第14天和第28天时赶黄草高、低剂量组和熊去氧胆 酸组大鼠肝功指标(ALT、AST、DBI L、TBI L)值均低于单纯结扎 1组（P0.05）。第14天和第28天时赶黄草高、低剂量组和熊去 氧胆酸组大鼠肝组织TGF-Ph Smad3和a-SMA的表达水平均低于 单纯结扎组，差异均具有统计学意义（P0.05）o 干预28天时，赶黄草高、低剂量组、熊去氧胆酸组与单纯结扎组 比较肝纤维化程度明显降低（P 0.05）o结论 赶黄草提取物可减缓胆汁淤积性肝纤维化SD大鼠肝脏 纤维化进程。赶黄草提取物抗肝纤维化作用机制与通过抑制 TGF-0/Smad途径，减少肝纤维化关键物质如TGF-pl、Smad3、a-SMA 等的生成有关。关键词：赶黄草、肝纤维化、大鼠2Influence of The Extracts from Penthorum Chinese PurshOn TGF-p/Smad Signaling Pathways in Cholestasis Liver Fibrosis RatsAbstract:Objectives To in vestigate th e in fluen ce o f th e extracts fro m Pen th o rum Ch in ese Pursh o n path o lo gical ch an ges an d th erapeutic ben efits in ch o lestasis liver fibro sis rats th ro ugh TGF-p/Smad sign al path way.Methods:Ch o lestasis liver fibro sis mo del was set upby co mmo n bile duct ligatio n o f bo th en ds an d th en a middle cut-o ff in male SD rats.To tal 40 male SD rats with successful mo delin g were ran do mly divided in to fo ur gro ups:co mmo n bile duct ligatio n gro up,h igh an d lo w do se(4g/kg_ 1 d-1,2g/kg 1,d-1)o f th e extracts fro m Pen th o rum Ch in ese Pursh gro upgro up,urso deo xych o lic acid gro up(3Omg/kg)with 10 rats in each gro up.An o th er 10 male SD rats were served as co n tro l gro up ran do mly.Medicin es were all taken by gavage,n o rmal an d co mmo n bile duct ligatio n gro up rats were given equal do se o f n o rmal salin e.Th e rats were an aesth etized at th e en d o f 2n d an d 4th week after o peratio n to take th e blo o d fro m h eart fbr detectin g n o t o n ly th e serum level o f(h yaluro n ic acid,HA),(lamin in,LN),(co llagen type I V,CI V),but also liver fun ctio n in dexes(ALTs AST、ALB、DBI L、TBI L),mean wh ile,partial h epatic tissues o f all 5 gro ups rats were taken fbr bio psy.I f th e n ude mice died in th e experimen tal pro cess,An auto psy sh o uld be do n e in time.All th e h epatic tissues were fixed in 10%n eutral 3fo rmalin,embedded in paraffin an d stain ed with HE to o bserve th e path o lo gical ch an ges o f h epatic tissue an d th e degree o f h epatic fibro sis,besides th e dyein g parts an d stain in g in ten sity o f TGF-pi(tran sfo rmin g gro wth facto r pl,TGF-pl),Smad3,Smad7 an d a-SMA were determin ed by immun o h isto ch emistry En visio n meth o d.Results:Serum Level o f HA,LN,pcDI,cI Vamo n g urso deo xych o lic acid gro up an d bo th h igh an d lo w do se o f th e extracts fro m Pen th o rum Ch in ese Pursh gro up were all in ferio r to th o se o f co mmo n bile duct ligatio n gro up o n 14th an d 28 th day in SD rats,(p 0.05).Hepatic fun ctio n in dexes(ALT、AST、ALB、DBI L、TBI L)amo n g urso deo xych o lic acid gro up an d bo th h igh an d lo w do se o f th e extracts fro m Pen th o rum Ch in ese Pursh gro up were all in ferio r to th o se o f co mmo n bile duct ligatio n gro up o n 14th an d 28 th day in SD rats(p 0.05).Th e expressio n levels o f TGF-pl,Smad3 an d a-SMA amo n g urso deo xych o lic acid gro up an d bo th h igh an d lo w do se o f th e extracts fro m Pen th o rum Ch in ese Pursh gro up were all in ferio r to th o se o f co mmo n bile duct ligatio n gro up o n 14th an d 28 th day in SD rats(p 0.05).Degrees o f liver fibro sis amo n g urso deo xych o lic acid gro up an d bo th h igh an d lo w do se o f th e extracts 4fro m Pen th o rum Ch in ese Pursh gro up were all in ferio r to th o se o f co mmo n bile duct ligatio n gro up o n 28 th day in SD rats(p 0.05).Conclusion:Th e extracts fro m Pen th o rum Ch in ese Pursh can slo w th e pro gressio n o f ch o lestasis-in duced liver fibro sis in SD rats.Th e an ti-h epatic fibro sis mech an isms o f th e extracts fro m Pen th o rum Ch in ese Pursh may be related to its in h ibitin g TGF-pl/smad sign al tran sductio n path ways an d reducin g th e pro ductio n o f TGF-01、Smad3、a-SMA,etc wh ich were crucial to liver fibro sis.Keywords:th e extracts fro m Pen th o rum Ch in ese Pursh;h epatic fibro sis;Rat5-1刖 百肝纤维化是多种因素导致的肝纤维结缔组织过度沉积，纤维增生 和分解不平衡的结果1o转化生长因子-01(tran sfo rmin g gro wth facto r-p,TGF-pi),其调节细胞的存活、分化、转移、黏附和细胞外基 质(extracellular matrix,ECM)的合成，是目前已知的最强致纤维化 因子,其能强烈促进肝星状细胞(h epatic stellate cell,HSC)的活化、增 殖和分化，TGF-P1在肝纤维化的发生、发展和形成中表现出至关重 要的作用3,研究发现，肝纤维化在一定条件有逆转至正常的可能 I,但肝硬化则不能，故早期及时的对各种病因所致的肝纤维化进 行干预，延缓甚至终止肝纤维化向肝硬化进展，从而改善病人生活质 量和提高病人存活率。为研究肝纤维化，目前已成功建立多种病因所 致的肝纤维化动物模型，如CCL4构建的中毒性肝损伤所致的肝纤维 化模型、酒精性脂肪肝模型、猪血清或人血白蛋白注射构建的自身免 疫性肝纤维化模型、胆汁淤积性肝纤维化模型等17区9。肝纤维化是影响患者生存质量的常见病变，淤胆性肝纤维化在临 床上较为常见11o目前治疗肝纤维化的药物较少，具有一定的开发 意义。中药制剂往往有其独特的优势，在传统医药中，很早就有赶黄 草等中药治疗肝病的报道，近年来，其用于酒精性脂肪肝、病毒性肝 炎、中毒性肝损伤等治疗也取得了一定疗效。研究赶黄草提取物 对胆汁淤积性肝纤维化的治疗作用和可能机制，可为该药物在治疗上 的广泛应用奠定良好的药理学基础。6本研究利用结扎胆总管大鼠建立淤胆性肝纤维化疾病模型，利用 赶黄草提取物(th e extracts fro m Pen th o rum Ch in ese Pursh)对其进行干 预，通过对其干预后血清肝功和纤维化指标的测定，运用免疫组化方 法检测肝组织TGF-01、调节型Smad3和抑制型Smad7及肝纤维化指 标a-SMA，探讨赶黄草提取物是否具有治疗胆管梗阻所致肝纤维化 的作用，同时通过其对TGF-0/Smad信号通路的影响，探讨其可能的 作用机制。7材料与方法1.实验材料、动物与仪器1.1实验动物雄性SD大鼠50只（由西南医科大学动物实验中心提供）o鼠龄：9-H周，体重:200-250克。饲养环境如下：温度控制在24,湿度 维持在50%,每小时通风换气8至12次，12小时白-黑周期。喂养7天后健康大鼠入选。1.2 手术器械医用棉签医用纱布缝合用线无菌医用缝合针无菌注射器一次性灭菌橡胶手术手套银子、剪刀等手术器械一次性使用备皮刀1.3 主要药物赶黄草提取物熊去氧胆酸革巴比妥钠聚维酮碘溶液0.9%氯化钠注射液福尔马林固定液75%酒精西南医科大学实验室北京市科护医疗器械有限公司 河南泽垣医疗器械销售有限公司 河南泽垣医疗器械销售有限公司 上海羽朵生物科技有限公司 上海优选生物科技有限公司 西南医科大学外总实验室河南泽垣医疗器械销售有限公司四川古蔺肝苏药业有限公司 四川科瑞德制药有限公司 沃芬（天津）药业有限公司 昌恒（武汉）生物医药有限公司 上海君瑞生物技术有限公司 西南医科大学附属医院病理科成都星运实业公司81.4 主要试剂及试剂盒Masso n染色试剂 生化全套试剂盒PBS缓冲液DAB染色液Smad7Smad3TGF-pia-SMA透明质酸（HA）层粘连蛋白（LN）四型胶原蛋白（CI V）1.5 主要实验仪器 分析电子天平 自动生化分析仪 免疫组化染色仪 高速离心机 手动轮转切片机 光学显微镜 分体式石蜡切片机2.实验分组与干预珠海贝索生物技术有限公司 Siemen s（德国）公司生产 上海永叶生物科技有限公司 上海羽朵生物科技有限公司 北京博奥生物技术有限公司Bio wo rld Tech n o lo gy,I n c武汉博士德生物工程有限公司武汉博欧特生物科技有限公司上海海研医学生物技术有限公司 上海海研医学生物技术有限公司 上海海研医学生物技术有限公司西南医科大学中心实验室 日本HI TACHI公司制造 美国sigma公司制造美国PURE公司制造西南医科大学病理科提供 日本Olympus公司制造 西南医科大学附属医院病理科2.1 由西南医科大学动物实验中心提供雄性SD大鼠（鼠龄：9-11周，体重200-250g），采用胆总管结扎制作肝纤维化模型口3采用随机数 字表法将建模成功的大鼠共计40只分成4组：（1）单纯胆总管结扎 9组（即模型组），10只；（2）赶黄草提取物高剂量组，10只；（3）赶黄草提取物低剂量组，10只；（4）熊去氧胆酸组，10只。另取正 常雄性大鼠10只做正常对照，列为正常对照组。正常鼠食喂养，试 验结束后予以处死大鼠。2.2 动物模型建立及干预术前12小时禁食，不禁水，称重后以2%苯巴比妥100mg/kg 注入腹腔麻醉大鼠，麻醉完全后将大鼠固定于手术台上，备皮刀备皮，利用碘伏和75%的酒精消毒，于脐上腹正中切口 2-2.5cm入腹，用消 毒棉签轻压十二指肠，把肝左右叶稍分拨开即可见透明的大鼠胆总管（直径约0.1-0.2cm）,稍分离胆总管，用两根4-0无菌丝线穿过胆总 管下方，在靠近十二指肠处双线结扎胆总管，结扎完毕后在两结之间 剪断胆总管后腹腔内滴入0.2ml左氧氟沙星注射液，关腹膜及皮肤层 后术闭。术后当天禁食水。赶黄草高低剂量组和单纯胆总管结扎组于 术后第二天给予赶黄草提取物（4g/kg-ldl,2g/kgld1）1和等量生 理盐水灌胃，熊去氧胆酸组于术后第二天给予30mg/kgl-d-l熊去氧 胆酸灌胃口4为保证灌胃时老鼠安全，灌胃量均配制为4mlo3.实验标本的获取与检测3.1 肝功能检测分别于术后14天和28天抽取大鼠心脏血4ml离心机3000r/min 离心后取血清，部分-2（TC冰箱保存。应用日本HI TACHI公司制造全 自动生化分析仪检测大鼠ALT、AST.TBI L、DBI L及ALB水平。3.2肝纤维化指标检测10应用时间分辨荧光免疫分析法检测各组大鼠血清透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、IV型胶原（CI V）水平。3.3 肝组织病理活检和纤维化Masso n染色分别于术后14天和28天采用2%苯巴比妥100mg/kg腹腔注射麻 醉大鼠后，沿原切口切开腹部，暴露腹腔，各组动物均切取肝右叶部 分组织，约0.5cm*0.5cm*0.5cm,10%甲醛固定，梯度脱水，二甲苯 透明，石蜡包埋，切5um切片，分别行HE染色和Masso n染色，光 学显微镜下采集图像，观察肝组织病理变化及肝纤维化分期,参照文 献评定肝纤维化程度分期。肝纤维化分级标准按照年全国肝病会议通 过的病毒性肝炎防治方案。所述标准分级，依据肝内有过多胶原 沉积及对肝结构破坏范围、程度和对肝微循环影响的大小划分为1 4期（S1-4）:0期，无肝纤维化；1期，汇管区、汇管区周围纤维化，限局窦周纤维化或小叶内纤维瘢痕，肝小叶结构完整；2期，纤维间 隔纤维化，肝小叶结构大部仍保留；3期，出现大量纤维间隔，分隔 并破坏肝小叶，小叶结构紊乱，但尚无肝硬化；4期，肝硬化早期表 现叫4.操作步骤4.1 HE染色步骤1）二甲苯（I）30min2）二甲苯（H）30min3）无水乙醇（I）5min4）无水乙醇（H）5minii5）95%乙醵（I）5min6）95%乙醇（U）5min7）50%乙醇 5min8）70%乙醵 5min9）蒸储水 5min10）苏木精液染色 5min11）流水稍洗去苏木精液3s12）1%盐酸乙醇 3s13）0.5%伊红液染色 3min14）蒸馈水稍洗 3s15）80%乙醇稍洗3s16）95%乙醇（I）3s17）95%乙醵（口）3s18）无水乙醇 5min19）二甲苯（I）5min20）二甲苯（口）5 min21）二甲苯（I I I）5min22）中性树胶封固4.2 Masso n染色步骤1）组织固定于Bo uin氏液或Zen ker氏液，流水冲洗过夜，常规脱水 包埋；122）切片脱蜡至水；3）Weigert铁苏木素（Weigert铁苏木素A、B液等比例混合液）染 5-10min,流水稍洗；4）1%盐酸酒精分化，流水冲洗数分钟；5）丽春红酸性品红染液染（5-10）分钟，流水稍冲洗；6）磷锯酸溶液处理约5min,不用水洗直接用苯胺蓝染液复染5min；7）1%的醋酸处理1分钟，95%酒精脱水多次；8）无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。4.3 En visio n法免疫组织化学检测肝组织TGF-01、Smad3、Smad7 和 a-SMA：4.3.1 一抗工作液的配制：大鼠Smad3、TGF-惧、a-SMA抗体工作 浓度为1：200,兔抗大鼠Smad7抗体工作浓度为1：300,PBS缓冲 液代替一抗作阴性对照。观察TGF-ph Smad3、Smad7染色的部位 及强度，工作液保存在4汽冰箱内。4.3.2 En visio n法免疫组化操作流程1）石蜡切片常规脱蜡至水；二甲苯（I）lOmin一二甲苯（U）8 min无水乙醇 5min-400%乙醇 5min-90%乙醇 5mino2）抗原修复EDTA修复液（PH=9.0）高压修复，上汽6min；柠檬酸缓冲液（PH,6.0）高压修复，上汽3分钟。自然冷却至室 汩 zniio133)3%甲醇H2O2浸泡lOmin,以消除内源性过氧化物酶活性，PBS缓 冲液冲洗3次，每次3min；4)滴加一抗，27Y孵育60min,PBS冲洗3次，每次3min；5)滴加二抗,27久孵育30min,PBS冲洗3次,每次3min；6)DAB显色，室温5s-lmin,显微镜下掌控，自来水冲洗终止显色；7)流水冲洗5min；8)苏木素复染2min；9)0.1%稀盐酸分化，饱和碳酸锂反兰；10)脱水、透明、封片：95%乙醇(I)1 min-95%乙醇(H)5min-100%乙醇(I)5min-400%乙酉享(H)5min一二甲苯2min中性树脂胶封固。5.疫组化图像分析TGF-01、Smad3、Smad7、和 a-SMA 免疫组化结果使用 I mage pro plus分析软件系统测定积分光密度(I OD),每张切片随机选取10个高 倍视野，检测结果以均数土标准差(xS)表示。6.统计学分析所得数据计量资料以(i土S)表示。应用SPSS17.0统计软件分 析，多组间均数比较采用单因素方差分析，计数资料采用卡方检验。以P0.05为差异具统计学意义。14结果L 一般情况正常组大鼠食欲良好，活动敏捷，眼睛明亮，毛色光泽。胆总管 结扎的大鼠在术后24小时开始见16只大鼠耳朵及尾巴出现黄染，48 小时后全部出现黄染、尿液变黄。单纯胆总管结扎组黄疸出现后程度 逐渐加重，7天后维持稳定，活动量、饮食较正常组减少。赶黄草治 疗高、低剂量组用药后大鼠相对活跃，黄染程度有减轻，赶黄草治疗 高、低剂量组黄染程度无明显差异。熊去氧胆酸组大鼠活动、黄染程 度与赶黄草高、低剂量组比较无明显差异。实验过程中共有7只大鼠 死亡，单纯胆总管结扎组死亡2只（其中一只于术后8天死亡，尸检 发现腹水浑浊恶臭，疑死于术后感染，另一只于术后26天死亡，尸 检时发现肝肿大发黄，质地粗糙，有淡黄色腹水约6ml,疑死于肝衰 竭）。赶黄草高剂量组于术后第10天死亡1只，尸检发现腹腔内肠 管充气扩张明显，疑死于急性粘连性肠梗阻。熊去氧胆酸组于术后第 4天死亡1只，尸检发现腹腔内有较多金黄色透亮液，疑死于胆汁性 腹膜炎，另一只于术后14天麻醉取肝组织时死亡。赶黄草低剂量组 死亡2只，均于术后14天采血后死亡。2.各组大鼠第14天、28天血清HA、LN、CIV水平比较干预后第14天，正常组、赶黄草高剂量组、赶黄草低剂量组、熊去氧胆酸组HA、LN、CI V值明显较单纯总管结扎组降低，差异有 统计学意义（P 0.05）,血清CI V水平差异有统计学 意义（P0.05）o见表1表1赶黄草提取物对大鼠血清HA、LN、CI V的影响（第14天）Tabic 1.Th e in fluen ce o f th e extracts fro m Pen th o rum Ch in ese Pursh o n HA,LN an d CI V in ch o lestasis liver fibro sis rats（14th day）.组别Gro upnHA(n g/ml)LN(n g/ml)CI V(n g/ml)正常对照组10*88.610.2*6.201.11*6.501.0单纯胆总管结扎组9288.226.514.02.6518.323.38赶黄草高剂量组9*#102.612.6*#7.01.128.31.0赶黄草低剂量组10*120.512.6*8.21.07*10.681.92熊去氧胆酸组9*#104.610.87*7.61.3*9.801.08注：与单纯胆总管结扎组比较，*P0.05与 熊去氧胆酸组比较,P0.05.干预后第28天，正常组、赶黄草高剂量组、赶黄草低剂量组、熊去氧胆酸组HA、LN、CI V值较胆总管结扎组明显降低，差异显著 具有统计学意义（P0.05）。赶黄草高剂量与 熊去氧胆酸组比较，血清HA、LN、CI V水平差异无统计学意义（P 0.05）o 见表 2O16表2赶黄草提取物对大鼠血清HA、LN、CI V的影响(第28天)Table 2.Th e in fluen ce o f th e extracts fro m Pen th o rum Ch in ese Pursh o n HA,LN an dCI V in ch o lestasis liver fibro sis rats(28lh day)组别Gro upnHA(n g/ml)LN(n g/ml)CI V(n g/ml)正常对照组10*83.553.82*5.801.64*6.401.35单纯胆总管结扎组8701.4540.239.27.146.688.88赶黄草高剂量组9*#125.4414.28.221.5*#11.82.13赶黄草低剂量组8*146.519.07*11.662.54*15.12.3熊去氧胆酸组8*#129.7512.95*#9.661.65*#12.91.33注：与单纯胆总管结扎组比较,*P0.05,与 熊去氧胆酸组比较,P0.05.3.各组大鼠第 14 天、28 天肝功（AST、ALT、ALB、TBIL、DBIL）水平比较第14天，正常组、赶黄草高剂量组、赶黄草低剂量组、熊去氧 胆酸组AST、ALT、ALB、TBI L、DBI L值显著低于单纯胆总管结扎 组，差异有统计学意义（PO.05）,与赶黄草低剂量组比较，赶黄草 高剂量组、熊去氧胆酸组血清AST、ALT、ALB、TBI L、DBI L水平 差异无统计学意义（P 0.05）o与熊去氧胆酸组比较，赶黄草高、低剂量血清AST、ALT、TP、TBI L、DBI L水平差异无统计学意义（P 0.05）o 见表 3表3赶黄草提取物对大鼠血清肝功的影响（第14天）Table 3.Th e in fluen ce o f th e extracts fro m Pen th o rum Ch in ese Pursh o n ALT in ch o lestasis liver fibro sis rats(14I hday).17组别Gro upnALT(U/L)AST(U/L)ALB(g/L)TBI L(umo l/L)DBI L(umo l/L)正常组10*61.28.3*126.713.036.51.6*0.820.29*0.760.227胆管结扎组9140.113.0426.142.730.72.291.217.289.416.6赶黄草高剂量组9*#73.47.2*#13714.3#34.13.2*#26.64.5*#254.2赶黄草低剂量组10*75.38.3*141.716.2*33.93.5*30.35.0*27.94.6熊去氧胆酸组9*#71.88.08*#138.010.431.61.97*#28.64.2*#26.53.8注：与单纯结扎组比较，*P0.05,与熊去氧 胆酸组比较,P0.05.表4赶黄草提取物对大鼠血清肝功的影响（第28天）Table 4.Th e in fluen ce o f th e extracts fro m Pen th o rum Ch in ese Pursh o n ALT in ch o lestasis liver fibro sis rats(28thday).组别Gro upnALT(U/L)AST(U/L)ALB(g/L)TBI L(umo l/L)DBI L(umo l/L)正常组10*61.28.3*126.713.036.51.6*0.820.29*0.760.227胆总管结扎组816323.9494.379.329.12.190.017.787.617.0赶黄草高剂量组9*#75.14.5*13314.735.22.04*#20.94.3*#18.84.4赶黄草低剂量组878.17.0915014.333.93.5*29.25.1*36.74.7熊去氧胆酸组8*#77.86.27*#14519.8#31.61.97*#26.15.4*#24.15.8注：与单纯胆总管结扎组比较,*P0.05,与 熊去氧胆酸组比较,P0.054.肝脏病理学检查结果肝脏形态的变化：正常组大鼠肝脏表面平整，质地柔软，包膜光滑，颜色鲜红，边缘锐利，形态大小正常（见图1A）。单纯胆总管18结扎组大鼠28天时见结扎上段胆总管明显扩张增粗，直径约2.5cm,肝肿胀，质地变硬，色泽黄染明显，边缘变钝，腹腔内淡黄色渗液明 显增多，约5ml,脏器不同程度的粘连（见图1B）。赶黄草高剂量 组28天时肝组织红润，表明光滑，色泽良好，质地柔软，可见胆总 管增粗约0.8 cm腹腔内脏器有一定程度粘连，无腹水形成见图I C X 熊去氧胆酸胆酸组28天时肝组织仍红润，质地软，边缘锐利，腹腔 内无腹水，上段胆总管稍增粗，直径约1cm见图（I D）。赶黄草低 剂量组28天时肝脏有轻微黄染，胆总管稍增粗，直径约1.2cm，肝 黄染程度较胆总管结扎组明显减轻，腹腔内无明显腹水，肝质地仍较柔软（见图I E）o图1A正常大鼠肝组织Figure 1A.No rmal liver in rats图I B胆总管结扎28天时肝脏Figure I B.Liver in rats with co mmo n bile duct ligatio n fo r 28 day19图1C赶黄草高剂量组干预28天 时肝脏Figure A3.Liver in rats treated with h igh do se th e extracts fro m Pen th o rum Ch in ese Pursh fo r 28 days图1C熊去氧胆酸组干预28天时 肝脏Figure A3.Liver in rats treated with with urso deo xych o lic acid fbr 28 days图I C赶黄草低剂量组干预28天 时肝脏Figure A5.Liver in rats treated with Lo w do se th e extracts fro m Pen th orum Ch in ese Pursh fbr 28 days5.各组大鼠肝组织病理改变（HE染色和Masson染色）正常组大鼠肝脏组织肝小叶结构完整，无肝细胞水肿、脂肪变性、坏死、炎症细胞浸润，细胞排列整齐，无纤维增生。单纯胆总管结扎 组28天时不能见清晰的肝小叶结构，小叶结构紊乱，中央静脉扩展 淤血，汇管区扩大变形，伴纤维化间隔形成，肝细胞大面积水肿变性 呈空泡样变，可见肝细胞片状坏死，肝实质可见不同程度的胶原沉积，20以汇管区和中央静脉周围明显，病理分期以S3、S4期为主。赶黄草 高剂量组和熊去氧胆酸组28天时汇管区增生较模型组明显减轻，纤 维组织增生少，少见点、灶状坏死，肝小叶结构趋于正常，部分肝细 胞可见空泡样变，肝小叶结构仍清晰可见，肝实质内极少见有胶原蛋 白沉积，胶原蛋白沉积主要在汇管区和中央静脉，且较胆总管结扎组 明显减少，病理分期以SI、S2期为主。赶黄草低剂量组28天时汇管 区小胆管增生稍明显，点、灶状坏死较高剂量组稍明显，肝细胞水肿 较高剂量组稍增多，少量炎症细胞浸润，肝实质内有散在的胶原蛋白 沉积，但不及单纯胆总管结扎组，仍以SI、S2期为主。见图2 图2干预28天各组大鼠肝组织HE染色结果图2A正常肝组织HE染色(200 x)Figure 2A.No rmal liver tissue(HE-st-ain in g200 x)图2B单纯胆总管结扎28天肝组织HE 染色(200 x)Figure 2B.Liver tissue in rats with co mmo n bile duct ligatio n fo r 28 days(HE-stain in g,200 x)21图2C高剂量赶黄草干预28天肝组织HE 染色(200 x)Figure 2C.Liver tissue in rats treated with h igh do se th e extracts fro m Pen tho rum Ch in ese Pursh fo r 28 days(HE-st-ain in g,200 x)图2D低剂量赶黄草干预28天肝组织HE 染色(200 x)Figure 2D.Liver tissue in rats treated with lo w do se th e extracts fro m Pen th o rum Ch in ese Pursh fbr 28 days(HE-stain-in g,200 x)图2E熊去氧胆酸干预28天肝组织HE 染色（200 x）Figure 2E.Liver tissue in rats treated with urso deo xych o lic acid fbr 28 days(HE-stain in g,200 x)6.各组大鼠肝纤维化程度检测（Masson染色）干预28天时，赶黄草高低剂量组、熊去氧胆酸组与单纯结扎组 比较肝纤维化程度明显降低（P 0.05）。详见表5,图3表5干预28天各组大鼠肝纤维化程度分期Table 5.Stages o f th e degree o f fibro sis in mice o n 28th day分期（s）组别 N 0 12 3 4正常组*#10 10结扎组 86 2赶黄草高剂量组*#9 81赶黄草低剂量组*8 62熊去氧胆酸组*#8 71注：与胆总管结扎组比较，*P0.05,与熊去氧胆酸组比较,P0.05o图3各组大鼠干预28天时肝组织Masso n染色结果图3A正常肝组织Masso n染色(200义)Figure 3 A.No rmal liver tissue in rats(M-asso n-stain in g,200 x)图3B单纯胆总管结扎28天肝组织Masso n 染色(200 x)Figure 3B.Liver tissue in rats with co mmo n bile duct ligatio n fo r 28 days(Mas-s o n-st ai n i n g 200 x)图3C高剂量赶黄草干预28天大鼠肝 组织Masso n染色(200义)Figure C3.Liver tissue in rats treated with h igh do se th e extracts fro m Pen th orum Ch in ese Pursh fo r 28 days(Masso n-stain in g,200 x)图3D低剂量赶黄草干预28天大鼠肝组 织Masso n染色(200义)FigureC4.Liver tissue in rats treated with h igh do se th e extracts fro m Pen th orum Ch in ese Pursh fo r 28 days(Masso n-stain in g,200 x)图3E熊去氧胆酸干预28天大鼠肝组 织 Masso n 染色(20O)Figure C5.Liver tissue in rats treated with urso deo xych o lic acid fo r 28 days(Masso n-stain in g,200 x)7.各组大鼠肝组织TGF-01、Smad3x Smad7s aSMA免疫组化结果第14天和28天时，正常