微生物遗传学.pptx

四、原生质体融合四、原生质体融合（protoplast fusion）1.定义：定义：经过人为方法，使遗传性状不一样两个细胞原生经过人为方法，使遗传性状不一样两个细胞原生 质体进行融合，以取得兼有双亲遗传性状稳定重组质体进行融合，以取得兼有双亲遗传性状稳定重组 子过程。子过程。融合子（融合子（fusant）意义：意义：打破了微生物种界界限，可实现远缘菌株基因重组。打破了微生物种界界限，可实现远缘菌株基因重组。可使遗传物质传递更为完整、取得更多基因重组机会。可使遗传物质传递更为完整、取得更多基因重组机会。可与其它育种方法相结合，如把常规诱变和原生质体诱变所取得可与其它育种方法相结合，如把常规诱变和原生质体诱变所取得优良性状，组合到一个单株中。优良性状，组合到一个单株中。微生物遗传学1/32 两亲本菌株选择和遗传标识制作两亲本菌株选择和遗传标识制作（选择不一样营养缺点型，（选择不一样营养缺点型，（A:a+b-,B:a-b+）对药品抗性差异）对药品抗性差异）原生质体制备原生质体制备（高渗条件）（高渗条件）原生质体再生（测定再生率）原生质体再生（测定再生率）融合融合（PEG、离心沉淀、电脉冲等）离心沉淀、电脉冲等）融合子检出融合子检出（直接检出法和间接检出法）（直接检出法和间接检出法）实用性菌株筛选实用性菌株筛选2.操作过程：操作过程：微生物遗传学2/32五、五、微生物基因组结构微生物基因组结构1.1.基因组（基因组（genomegenome）：）：指存在于细胞或病毒中一整套遗传信息。指存在于细胞或病毒中一整套遗传信息。（一个物种单倍体全部染色体及其所包含遗传信息总称）（一个物种单倍体全部染色体及其所包含遗传信息总称）原核生物，多为单倍体（在普通情况下只有一条染色体）真核微生物，通常为双倍体（多条染色体，啤酒酵母有16条染色体。）微生物遗传学3/322.微生物与人类基因组计划微生物与人类基因组计划人类基因组计划（Human Genome Project）1985年提出；1990年正式开始实施；2月，测序工作完成后基因组时代（Postgenome Era）微生物遗传学4/32微生物基因组测序工作是在人类基因组计划促进下开始，最开始是作为模式生物，以后不停发展，已成为研究微生物学最有力伎俩。微生物遗传学5/32被选择进行全基因组测序微生物：（1）人类基因组计划中模式生物主要性）人类基因组计划中模式生物主要性a）技术上从低等入手，建立技术、积累经验。技术上从低等入手，建立技术、积累经验。经过对基因组结构相对简单生物，尤其是微生物基因组测序，对大规模测序策略及技术进行检验，积累经验；b）理论上利用基因组在进化上连续性进行比较研究理论上利用基因组在进化上连续性进行比较研究 经过对不一样进化程度基因组分析、比较揭示更多基本生物学信息。经过研究较为简单基因组而解回复杂人类基因组问题，微生物遗传学6/32被选择进行全基因组测序微生物：（2）与人类生活关系亲密微生物）与人类生活关系亲密微生物（1）人类基因组计划中模式生物主要性）人类基因组计划中模式生物主要性医疗健康:主要致病菌工业生产:工业生产菌农业种植:植物病原菌（3）对说明生物学基本问题有价值微生物）对说明生物学基本问题有价值微生物 一些古生菌：如Methanococcus jannaschii(詹氏甲烷球菌)等，它们是微生物世界多样性代表，它们序列比较有利于找出其进化关系。微生物遗传学7/323.微生物基因组结构特点微生物基因组结构特点3.1 原核生物（细菌、古生菌）基因组原核生物（细菌、古生菌）基因组（1）染色体为）染色体为双链环状双链环状DNA分子（单倍体）；分子（单倍体）；链环状染色体在细胞中以紧密缠绕成较致密不规则小体形式存在于细胞中，该小体称为拟核拟核(nucliod)，其上结合有类组蛋白蛋白质和少许RNA分子，使其压缩成一个手脚架形致密结构。例外：布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)染色体是线状微生物遗传学8/323.1 原核生物（细菌、古生菌）基因组原核生物（细菌、古生菌）基因组（1）染色体为）染色体为双链环状双链环状DNA分子（单倍体）；分子（单倍体）；（2）基因组上遗传信息含有连续性；）基因组上遗传信息含有连续性；基因数基本靠近由它基因组大小所预计基因数微生物基因组DNA绝大部分用来编码蛋白质、RNA；用作为复制起点、开启子、终止子和一些由调整蛋白识别和结合位点等信号序列。普通不含内含子，遗传信息是连续而不是中止。真核生物基因组一个主要特点就是含有内含子个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌)和古生菌rRNA和tRNA基因中也发觉有内含子或间插序列微生物遗传学9/323.1 原核生物（细菌、古生菌）基因组原核生物（细菌、古生菌）基因组（1）染色体为）染色体为双链环状双链环状DNA分子（单倍体）；分子（单倍体）；（2）基因组上遗传信息含有连续性；）基因组上遗传信息含有连续性；（3）功效相关结构基因组成操纵子结构；）功效相关结构基因组成操纵子结构；（4）结构基因单拷贝及）结构基因单拷贝及rRNA基因多拷贝；基因多拷贝；（5）基因组重复序列少而短；）基因组重复序列少而短；古生菌基因组在结构上类似于细菌。不过信息传递系统(复制、转录和翻译)则与细菌不一样而类似于真核生物。操纵子（操纵子（operonoperon）：）：p195p195 功效相关几个基因前后相连，再加上一个共同功效相关几个基因前后相连，再加上一个共同调整基因调整基因和一组共和一组共同控制位点（同控制位点（开启子、操纵基因开启子、操纵基因等）在基因转录时协同动作。等）在基因转录时协同动作。微生物遗传学10/323.2 真核微生物（啤酒酵母）基因组真核微生物（啤酒酵母）基因组（1）经典真核染色体结构；）经典真核染色体结构；（2）没有显著操纵子结构；）没有显著操纵子结构；啤酒酵母基因组大小为13.5106bp，分布在16条染色体中。（3）有间隔区（即非编码区）和内含子序列；）有间隔区（即非编码区）和内含子序列；（4）重复序列多；）重复序列多；内含子（内含子（intron）:真核细胞基因DNA中间插序列，这些序 列被转录成RNA，但随即被剪除而不翻译。外显子（外显子（exon）:真核细胞基因DNA中编码序列，这些序 列可被转录为RNA并进而翻译为蛋白质。微生物遗传学11/324.基因组测序方法基因组测序方法全基因组鸟枪测序步骤：用超声波将基因组随机打断成相当小片段，这些片段与质粒载体结合，产生质粒克隆文库。制备克隆和提纯DNA，然后进行测序。用专门计算机程序将已测序DNA片段经过片段之间核苷酸序列重合比较，可装配成比较长DNA序列。重合大片段按适当次序排队，得到完整DNA序列。微生物遗传学12/32 DNA自动测序结果自动测序结果注：DNA自动测序是对Sanger方法改进：(1)用不一样颜色荧光标识ddNTP；(2)4种反应混合进行，并一块进行电泳；(3)对凝胶上含有不一样颜色荧光带(a)进行扫描，可快速确定待测DNA序列(b)。微生物遗传学13/325.基因组序列注释和意义基因组序列注释和意义基因组序列注释目标是确定特定基因在基因组图谱中位置。另外，还能提供一些关于转座因子、操纵子、重复序列及其它基因组特征一些信息。流感嗜血菌基因组测序结果和注释见下列图。外同心圈用不一样颜色代表不一样功效编码区(比如，氨基酸生物合成、能量代谢、复制、转录、翻译及调整功效等)；外圈周围显示Nat I、Rsr II、Sam I等限制性酶切位点；从外数第二圈显示高G+C含量和高A+T含量区域；第三圈显示由噬菌体克隆所包含片段；第四圈显示rRNA操纵子、tRNA和类似Mu原噬菌体；第五圈显示简单串联重复序列和可能复制起点和潜在终止序列。微生物遗传学14/32微生物遗传学15/32第七节第七节 真核微生物基因重组真核微生物基因重组微生物遗传学16/32真核生物基因重组方式主要有以下四种1）有性杂交）有性杂交 （2）准性杂交）准性杂交 （3）原生质体融合 （4）转化微生物遗传学17/32 一一、有性杂交（、有性杂交（sexual hybridization）1.定义：不一样遗传型两性细胞间发生接合和 随之进行染色体重组，进而产生新 遗传型后代一个育种技术。凡能产有性孢子酵母菌、霉菌和蕈（Xun）菌，标准上都能应用与高等动、植物杂交育种相同有性杂交方法进行育种。微生物遗传学18/322.酵母菌接合型遗传酵母菌接合型遗传 单倍体能够是或a两种接合型其中之一，一个单倍体酵母细胞是型还是a型是由其本身遗传特征所决定，是一个稳定遗传特征。一个接合型单倍体细胞有时会发生转变，即由型变成a型或再回到型。微生物遗传学19/323.酿酒酵母有性杂交育种程序：酿酒酵母有性杂交育种程序：两亲本菌株选择单倍体细胞分离与验证单倍体细胞遗传标识制作杂交杂合子检出优良性状个体筛选与性能测试微生物遗传学20/32 二、准性杂交二、准性杂交/生殖（生殖（parasexual hybridization /reproduction）1.定义定义：同种生物两个不一样菌株同种生物两个不一样菌株体细胞体细胞（即带有不一样遗（即带有不一样遗传传 性状两个单倍体细胞或菌丝）性状两个单倍体细胞或菌丝）经融合后，经融合后，不经减数不经减数 分裂分裂而造成低频率基因重组并产生重组子生殖而造成低频率基因重组并产生重组子生殖 方式。方式。准性生殖是丝状真菌，尤其是不产生有性孢子丝状真菌（半知菌亚门真菌）特有遗传现象。微生物遗传学21/322.过程过程：1）菌丝联结；）菌丝联结；2）异核体形成；）异核体形成；（同时含有一个以上不一样遗传型细胞核细胞）3）核融合和杂合二倍体形成；）核融合和杂合二倍体形成；（细胞核中含有2个不一样起源染色体组菌体细胞。发生机会为百万分之一。）4）单倍体化）单倍体化 （杂合二倍体极不稳定，在其有丝分裂过程中，有极少数细胞，其同源染色体两条染色单体之间发生交换，在体细胞分裂时，产生1个或1个以上标识纯合现象，从而形成新性状单倍体杂合子。其单元化不是一次有丝分裂结果，而要经过若干次有丝分裂过程，每次分裂都有可能从二倍体核中失去部分染色体，最终才回复成单倍体核。）微生物遗传学22/323.有性生殖与准性生殖比较比较项目准性生殖有性生殖参加接合亲本细胞形态相同体细胞形态或生理上有分化性细胞独立生活异核体阶段有无接合后双倍体细胞形态与单倍体基本相同与单倍体显著不一样双倍体变为单倍体路径经过有丝分裂经过减数分裂接合发生几率偶然发生，几率低正常出现，几率低微生物遗传学23/32三、酵母菌线粒体遗传三、酵母菌线粒体遗传线粒体内含线粒体内含1个个DNA片段片段（核外遗传系统，为线粒体行使功效所核外遗传系统，为线粒体行使功效所需需rRNA、tRNA及一些酶如细胞色素、及一些酶如细胞色素ATP合成酶编码），是一合成酶编码），是一个细胞质遗传，也称非孟德尔遗传。个细胞质遗传，也称非孟德尔遗传。酵母菌中酵母菌中经典细胞质遗传经典细胞质遗传现象是现象是小菌落突变型遗传小菌落突变型遗传：在培养酵母群体中，常有在培养酵母群体中，常有1%2%细胞自发出现小菌落表型细胞自发出现小菌落表型“小菌落小菌落”（呼吸缺点型菌落）：（呼吸缺点型菌落）：酵母菌因为线粒体DNA严重缺损或大部分丢失，缺失细胞色素a、b及细胞色素c氧化酶，即使在通气条件下，细胞生长也很迟缓，在葡萄糖培养基上只能形成小菌落。功效：功效：细胞呼吸作用场所，为生命活动提供细胞呼吸作用场所，为生命活动提供ATP。真核生物真核生物动力车间动力车间”。微生物遗传学24/32中性小菌落(0 0)：+0 0：野生型:小菌落=4:0 抑制性小菌落(-)：+-：野生型:小菌落=0:4 分离型小菌落：野生型:小菌落=2:2 小菌落突变株小菌落突变株三种类型：三种类型：野生型mtDNA：(+)；中性小菌落(neutral petite)(0 0)：mtDNA全部丧失 抑制性小菌落(suppressive petite)(-)：mtDNA部分缺失突变分离型小菌落(segregational petite)：染色体基因突变判别方法：判别方法：微生物遗传学25/32基因工程定义：利用利用PCR扩增技术或在体外从某扩增技术或在体外从某种生物基因组中分离感兴趣基因，或是种生物基因组中分离感兴趣基因，或是用人工合成方法获取基因，然后经过一用人工合成方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重系列切割，加工修饰，连接反应形成重组组DNA分子，再将其转入适当受体细胞，分子，再将其转入适当受体细胞，以期取得基因表示过程以期取得基因表示过程.微生物遗传学26/32基因工程操作过程基因工程操作过程基因工程操作过程主要由以下步骤组成：基因工程操作过程主要由以下步骤组成：载体和目标基因分离；载体和目标基因分离；载体和目标载体和目标基因切断；基因切断；载体和目标基因重组；载体和目标基因重组；重组重组DNA转化和扩增；转化和扩增；重组重组DNA筛选筛选和判定。和判定。微生物遗传学27/32基因工程三大理论DNA结构和中心法则发觉质粒发觉限制性内切酶发觉微生物遗传学28/32基因工程三大技术转化技术DNA体外重组技术琼脂糖凝胶电泳技术微生物遗传学29/32微生物遗传学30/321.PCR技术当代基因操作技术微生物遗传学31/32当代基因操作技术2.DNA Shuffling技术基本原理：先未起源不一样但功效相同一组同源基因，用DNA核酸酶I进行消化产生随机小片段，由这些小片段组成一个文库，使之互为引物和模板，进行PCR扩增，当一个基因拷贝片段作为另一基因拷贝引物时，引发模板转换，重组因而发生，导入体内后，选择正突变体作为新一轮体外重组。普通经过23个循环，得到产物大幅度提升重组突变体。全基因组改组：将DNA shuffling多亲本体外重组优点和传统育种(细胞融合)相结合全基因组体内改组技术。微生物遗传学32/32