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蛋白质结构一级结构、二级结构、三级结构和四级结构一级结构、二级结构、三级结构和四级结构多肽链氨基酸顺序分析多肽链氨基酸顺序分析第1页第1页蛋白质结构蛋白质结构 蛋白质是由一条或多条多肽链以特殊蛋白质是由一条或多条多肽链以特殊方式组合而成。当多肽分子量大到足够含方式组合而成。当多肽分子量大到足够含有一定空间结构时就称为蛋白质。有一定空间结构时就称为蛋白质。蛋白质与多肽主要蛋白质与多肽主要差别：差别：分子量，空间结构分子量，空间结构 第2页第2页蛋白质结构蛋白质结构一级结构一级结构三维结构三维结构第3页第3页蛋白质一级结构（蛋白质一级结构（primarystructure）1定义：定义：蛋白质一级结构包括构成蛋白质蛋白质一级结构包括构成蛋白质多肽链数目多肽链数目、多肽、多肽链链氨基酸顺序氨基酸顺序，以及多肽链内或链间，以及多肽链内或链间二硫键数目和位置二硫键数目和位置。其中最主要是其中最主要是多肽链氨基酸顺序，多肽链氨基酸顺序，它是蛋白质生物它是蛋白质生物功效基础。功效基础。蛋白质氨基酸顺序改变，不但影响蛋白质高级结构蛋白质氨基酸顺序改变，不但影响蛋白质高级结构，并且将直接影响其，并且将直接影响其生理功效生理功效。第4页第4页蛋白质一级结构蛋白质一级结构氨基酸顺序氨基酸顺序镰形细胞贫血遗传性疾镰形细胞贫血遗传性疾病，特性是病者血红蛋白发病，特性是病者血红蛋白发生变异。生变异。变异血红蛋白与正常血变异血红蛋白与正常血红蛋白差别是在一条多肽链红蛋白差别是在一条多肽链上第上第6位位Glu被被Val替换。由替换。由于于Glu与与Val在形成氢键上差在形成氢键上差别很大，变异蛋白质空间结别很大，变异蛋白质空间结构改变明显，水溶性减少，构改变明显，水溶性减少，血液粘度增大，造成贫血症血液粘度增大，造成贫血症状。状。蛋白质氨基酸顺序改变会引起异常功效或病变。蛋白质氨基酸顺序改变会引起异常功效或病变。第5页第5页2蛋白质一级结构测定蛋白质一级结构测定胰岛素一级结构胰岛素一级结构1952年英国生化学家年英国生化学家Sanger初次测定初次测定结构特点：结构特点：1.由由51个氨基酸残基构成个氨基酸残基构成2.分两条链：分两条链：A链：链：21个氨基酸残基个氨基酸残基,B链：链：30个氨基酸残基个氨基酸残基3.含三个二硫链：含三个二硫链：一个一个A链内二硫键链内二硫键,两个链间二硫键两个链间二硫键第6页第6页第7页第7页蛋白质一级结构测定环节蛋白质一级结构测定环节 1.1.肽链数目：通过测定末端氨基酸残基量与蛋白质相肽链数目：通过测定末端氨基酸残基量与蛋白质相对分子质量之间关系对分子质量之间关系,拟定多肽链数目拟定多肽链数目.2.2.多肽链拆分多肽链拆分:加入盐酸胍加入盐酸胍,解离非共价力解离非共价力,过氧酸氧化过氧酸氧化或巯基还原法拆分二硫键或巯基还原法拆分二硫键.4.4.测定多肽链氨基酸顺序测定多肽链氨基酸顺序3.3.测定多肽链氨基酸构成测定多肽链氨基酸构成:酸水解酸水解,测定计算各测定计算各种氨基酸分子比种氨基酸分子比.第8页第8页多肽链氨基酸顺序分析多肽链氨基酸顺序分析1.多肽链选择性降解多肽链选择性降解酶解法酶解法:胰蛋白酶胰蛋白酶化学法化学法:CNBr水解水解2.多肽链末端氨基酸测定多肽链末端氨基酸测定二硝基氟苯二硝基氟苯(DNFB)法法:N端端丹磺酰氯法丹磺酰氯法:N端端阱解法阱解法:C端端3.Edman氨基酸顺序法氨基酸顺序法:N端端第9页第9页酶解法酶解法带正电荷氨基酸带正电荷氨基酸R1-Lys-Ala-R2R1-Lys-COO-+NH3+-Ala-R2胰蛋白酶胰蛋白酶RmRnRn预测端基氨基酸类型预测端基氨基酸类型第10页第10页思考题思考题用胰蛋白酶处理下列小肽，会断裂成什么样用胰蛋白酶处理下列小肽，会断裂成什么样肽片断？肽片断？Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Arg-Ser-Gly第11页第11页答案答案Ala-Ser-Thr-LysGly-ArgSer-Gly第12页第12页思考题今有一个九肽，分别用（今有一个九肽，分别用（1）胰蛋白酶）胰蛋白酶（2）胰凝乳蛋白酶（）胰凝乳蛋白酶（3）羧肽酶（）羧肽酶（4）溴）溴化氰处理，试用箭头及号码表示出它们对化氰处理，试用箭头及号码表示出它们对肽键作用位置。肽键作用位置。Leu-Met-Arg-Pro-Ala-Lys-Tyr-Ser-Arg第13页第13页化学办法化学办法溴化氰（溴化氰（CNBr）水解法）水解法:选择性地切割由甲硫氨酸选择性地切割由甲硫氨酸(Met)形成肽键形成肽键高丝氨酸内酯高丝氨酸内酯第14页第14页思考题思考题一个肽用CNBr切成两个小肽段，又用切成两个小肽段，又用胰蛋白酶切成另外两个小肽段。胰蛋白酶切成另外两个小肽段。CNBr1,Gly-Thr-Lys-Ala-GluCNBr2,Ser-Met胰蛋白酶胰蛋白酶1,Ser-Met-Gly-Thr-Lys胰蛋白酶胰蛋白酶2,Ala-Glu推断该多肽氨基酸顺序推断该多肽氨基酸顺序.第15页第15页答案Ser-Met-Gly-Thr-Lys-Ala-Glu第16页第16页末端氨基酸分析：末端氨基酸分析：包括包括N端分析，端分析，C端分析端分析N端分析办法端分析办法二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB)法法DNP-氨基酸（黄色）氨基酸（黄色）酸性水解酸性水解第17页第17页丹磺酰氯法丹磺酰氯法N端分析办法端分析办法丹磺酰氯丹磺酰氯丹磺酰氨基酸有很强荧光性质，检测灵敏度高丹磺酰氨基酸有很强荧光性质，检测灵敏度高第18页第18页肼解法肼解法C端分析办法端分析办法阱化物能与苯甲醛缩合成不溶于水物质而与阱化物能与苯甲醛缩合成不溶于水物质而与C-端氨基酸分离端氨基酸分离.第19页第19页Edman氨基酸顺序分析法氨基酸顺序分析法N端分析办法端分析办法异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯特点：特点：不断重复循环，将肽不断重复循环，将肽链链N-端氨基酸残基逐一进行端氨基酸残基逐一进行标识和解离。标识和解离。PTH-苯乙内酰硫脲苯乙内酰硫脲第20页第20页蛋白质空间结构（三维结构）蛋白质空间结构（三维结构）天然活性蛋白质都有稳定三维结构。一旦这天然活性蛋白质都有稳定三维结构。一旦这种三维结构遭到破坏，即使一级结构不变，种三维结构遭到破坏，即使一级结构不变，蛋白质生物功效也会完全丧失。蛋白质生物功效也会完全丧失。含有独特三维结构是蛋白质区别于普通有机含有独特三维结构是蛋白质区别于普通有机分子最明显特性。分子最明显特性。第21页第21页1.1.蛋白质二级结构蛋白质二级结构 蛋白质二级结构是指肽链主链在蛋白质二级结构是指肽链主链在空间排列。只涉及肽链主链构象及链空间排列。只涉及肽链主链构象及链内或链间形成氢键。内或链间形成氢键。第22页第22页 多肽链主链由许多酰胺平面组成，平面之间以碳原子相隔。而C-C键和C-N键是单键，能够自由旋转，因此，在保持肽键平面结构不变条件下，能够形成不同空间排列。第23页第23页维持主链空间排列另一个主要原维持主链空间排列另一个主要原因是氢键。因是氢键。主链中主链中-C=O和和-N-H-能够互相能够互相形成链内或链间氢键。形成链内或链间氢键。第24页第24页蛋白质二级结构主要有：蛋白质二级结构主要有：（1 1）-螺旋螺旋（2 2）-折叠折叠（3 3）-转角转角第25页第25页(1)-螺旋螺旋1950年美国年美国Pauling等人发觉等人发觉-螺旋是蛋白质中螺旋是蛋白质中最常见二级结构。最常见二级结构。主链按右手方向盘主链按右手方向盘绕成螺旋形，相邻螺圈绕成螺旋形，相邻螺圈之间形成链内氢键。之间形成链内氢键。第26页第26页(2)-(2)-折叠折叠-折叠主链骨架以一定折叠主链骨架以一定折叠形式形成一个折叠片层。折叠形式形成一个折叠片层。在两条相邻肽链之间形在两条相邻肽链之间形成氢链。几乎所有肽键都参成氢链。几乎所有肽键都参与了链间氢键交联。因此，与了链间氢键交联。因此，结构牢固。结构牢固。第27页第27页(3)-转角转角由第一个氨基酸残基由第一个氨基酸残基C=OC=O与第四个氨与第四个氨基酸残基基酸残基NHNH之间形成氢键。之间形成氢键。不稳定环状结不稳定环状结构，主要存在构，主要存在于球状蛋白分于球状蛋白分子中。子中。第28页第28页2.2.蛋白质三级结构蛋白质三级结构 蛋白质三级结构是指在二级结构基础上，多蛋白质三级结构是指在二级结构基础上，多肽链再进一步折叠盘绕成更复杂空间结构。肽链再进一步折叠盘绕成更复杂空间结构。三级结构主要靠非共价键来维持。包括氢键、三级结构主要靠非共价键来维持。包括氢键、疏水键疏水键、离子键、范德华力等。、离子键、范德华力等。第29页第29页1963年年Kendrew等通过肌红蛋白等通过肌红蛋白x-射线射线衍射分析，测得了为它三级结构。衍射分析，测得了为它三级结构。第30页第30页蛋白质四级结构蛋白质四级结构含有三级结构多肽按一定空间排列方式，通含有三级结构多肽按一定空间排列方式，通过非共价键缔合在一起形成蛋白质大分子。过非共价键缔合在一起形成蛋白质大分子。第31页第31页蛋白质一级结构和高级结构蛋白质一级结构和高级结构之间关系之间关系蛋白质高级结构是在一级结构基础上形成，因此，蛋白质高级结构是在一级结构基础上形成，因此，一级结构改变必定影响到它高级结构。一级结构改变必定影响到它高级结构。-螺旋形成及其稳定性取决于它氨基酸构成和排螺旋形成及其稳定性取决于它氨基酸构成和排列顺序。氨基酸残基列顺序。氨基酸残基R基团比较小，不带电荷，基团比较小，不带电荷，有助于有助于-螺旋形成和稳定。由于脯氨酸特殊结构，螺旋形成和稳定。由于脯氨酸特殊结构，肽链主链在脯氨酸所在位置会发生骨架方向改变，肽链主链在脯氨酸所在位置会发生骨架方向改变，不能形成内氢键。因此，多薹链只要存在脯氨酸，不能形成内氢键。因此，多薹链只要存在脯氨酸，-螺旋即发生中断。螺旋即发生中断。第32页第32页几种主要蛋白质类型几种主要蛋白质类型纤维状蛋白质纤维状蛋白质球状蛋白球状蛋白角蛋白角蛋白丝蛋白丝蛋白血红蛋白血红蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白抗体抗体第33页第33页球状蛋白球状蛋白结构最复杂，功效最多一类蛋白质。结构最复杂，功效最多一类蛋白质。结构紧密，分子外层为亲水性残基；内结构紧密，分子外层为亲水性残基；内部主要为疏水性氨基酸残基。部主要为疏水性氨基酸残基。第34页第34页血红蛋白血红蛋白结合蛋白质，血红结合蛋白质，血红素中素中Fe原子以配价原子以配价键与肽链分子中组键与肽链分子中组氨酸咪唑基氮原子氨酸咪唑基氮原子相连。相连。主要功效是运送氧主要功效是运送氧和二氧化碳。和二氧化碳。第35页第35页免疫球蛋白免疫球蛋白抗体抗体结合蛋白质，血浆糖蛋白。主要在脾、肝、结合蛋白质，血浆糖蛋白。主要在脾、肝、淋巴等组织细胞内合成。淋巴等组织细胞内合成。抗体是高等动物免疫反应产物，是机体预防抗体是高等动物免疫反应产物，是机体预防外界物质侵入防御物质。当外来大分子物质，外界物质侵入防御物质。当外来大分子物质，如蛋白质、多糖、核酸以及细菌等侵入机体如蛋白质、多糖、核酸以及细菌等侵入机体时，引起抗体产生，这就是机体免疫反应。时，引起抗体产生，这就是机体免疫反应。抗体抗体就是免疫球蛋白，外来大分子物质就称就是免疫球蛋白，外来大分子物质就称为为抗原抗原。第36页第36页抗体特点抗体特点1.高度特异性：一个抗体普通只与对应抗原发生作用，形成抗体-抗原复合物。抗体-抗原复合物普通不溶于水，常从溶液中沉淀出来，称为抗体-抗原沉淀反应。2.多样性：不同抗原能够诱导产生不同抗体。抗原种类多样性决定了抗体多样性。第37页第37页抗体蛋白抗体蛋白Ig(immuneglobulin)人抗体蛋白分为人抗体蛋白分为5类：类：IgA,IgD,IgE,IgG（含量最高）（含量最高）,IgM.抗体蛋白相对分子质量范围：抗体蛋白相对分子质量范围：150000950000第38页第38页习题课蛋白质蛋白质第39页第39页1.甘氨酸解离常数是甘氨酸解离常数是pK1=2.34,pK2=9.60，它等电点（它等电点（pI）是）是()A、7.26B、5.97C、7.14D、10.772.维持蛋白质二级结构稳定主要原因是：维持蛋白质二级结构稳定主要原因是：A、静电作用力、静电作用力B、氢键、氢键C、疏水键、疏水键D、范德华作用力、范德华作用力3.蛋白质变性是由于（蛋白质变性是由于（）A、一级结构改变、一级结构改变B、空间构象破坏、空间构象破坏C、辅基脱落、辅基脱落D、蛋白质水解、蛋白质水解选择题选择题第40页第40页4.在下列所有氨基酸溶液中，不引起偏振光旋在下列所有氨基酸溶液中，不引起偏振光旋转氨基酸是（转氨基酸是（）A、丙氨酸、丙氨酸B、亮氨酸、亮氨酸C、甘氨酸、甘氨酸D、丝氨酸、丝氨酸5.谷氨酸谷氨酸pK1(-COOH)为为2.19，pK2(-NH3)为为9.67，pK3(-COOH)为为4.25，其，其pI是（是（）A、4.25B、3.22C、6.96D、5.936.在生理在生理pH情况下，下列氨基酸中哪个带净负情况下，下列氨基酸中哪个带净负电荷？（电荷？（）A、ProB、LysC、HisD、Glu第41页第41页7.蛋白质分子中蛋白质分子中-S-S-断裂办法是（断裂办法是（）A、加尿素、加尿素B、透析法、透析法C、加过甲酸、加过甲酸D、加重金属盐加重金属盐8.含有两个羧基氨基酸是：（含有两个羧基氨基酸是：（）。）。A.甘氨酸甘氨酸B.谷氨酸谷氨酸C.缬氨酸缬氨酸D.甲硫氨酸甲硫氨酸9.所有所有-氨基酸共有显色反应是：（氨基酸共有显色反应是：（）A.茚三酮反应茚三酮反应B.双缩脲反应双缩脲反应C.坂口反应坂口反应D.福林酚福林酚试剂反应试剂反应10.下列关于氨基酸叙述错误一项是：（下列关于氨基酸叙述错误一项是：（）A.酪氨酸和苯丙氨酸含苯环酪氨酸和苯丙氨酸含苯环B.谷氨酸和天冬氨酸谷氨酸和天冬氨酸含两个氨基含两个氨基C.亮氨酸和缬氨酸是支链氨基酸亮氨酸和缬氨酸是支链氨基酸D.酪氨酸和丝氨酪氨酸和丝氨酸含羟基酸含羟基第42页第42页11.维持蛋白质一级结构化学键是：（维持蛋白质一级结构化学键是：（）A盐键盐键B疏水键疏水键C肽键肽键D.氢键氢键12.多肽多肽GiyArsLyspheAsp（C）经）经Edman降解除去一个氨基酸后，其产物是：降解除去一个氨基酸后，其产物是：（）A.GlyArg（C）LyspheAsp（C）B.GlyArgLysphe（C）AspC.ArgLySpheAsp（C）GlyD.ArgLysphe（C）GlyAsp第43页第43页13.下列肽链不能形成下列肽链不能形成-螺旋一个是：（螺旋一个是：（）AIle-Asn-Met-Val-GlnBTrp-Val-Gly-Ala-AsnCAla-Pro-Tyr-phe-GlnDSer-Phe-Ala-Gln-Lys14.有一混合蛋自质溶液，各种蛋自质有一混合蛋自质溶液，各种蛋自质pI为为4.6、5,0、5.3、6.7,7.3,电泳时欲使其中四种泳电泳时欲使其中四种泳向正极，缓冲液向正极，缓冲液pH值应当是：（值应当是：（）A5.0B.6.0C7.0D8.0第44页第44页15.从组织提取液沉淀活性蛋白而又不使之变从组织提取液沉淀活性蛋白而又不使之变性办法是加入性办法是加入A硫酸铵硫酸铵B三氯乙酸三氯乙酸C氯化汞氯化汞D1molLHCl16.可用于测定蛋白质分子量办法是：（可用于测定蛋白质分子量办法是：（）ASDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳B离子互换层析离子互换层析C凯氏定氮法凯氏定氮法D亲和层析亲和层析第45页第45页17.以下方法中可用于蛋白质多肽链N 未端氨基酸分析法是：（）A茚三酮法 B二硝基氟苯法 CEdman 降解 D丹磺酞氯法18.以下方法中可用于蛋自质多肽链c 未端氨基酸分析方法是：（）AEdman 降解 B肼解法 C硼氢化银还原法 D羧肽酶法19.分离纯化蛋白质可用离子互换层析法，其原理是：（）A蛋白质溶解度不同B组成蛋白质氨基酸种类和数目不同C蛋白质分子能与其对应配基进行特异性结合D蛋白质所带电荷不同第46页第46页填空题填空题1.构成蛋白质氨基酸构型除甘氨酸外均为构成蛋白质氨基酸构型除甘氨酸外均为型型2.含巯基氨基酸是。两个通过氧含巯基氨基酸是。两个通过氧化巯基形成键而在稳定蛋白质结构中化巯基形成键而在稳定蛋白质结构中起主要作用。起主要作用。3.蛋自质分子中，肽链是由一个氨基酸蛋自质分子中，肽链是由一个氨基酸基与后一个氨基酸基缩合而成。其中基与后一个氨基酸基缩合而成。其中每一个氨基酸单位称为氨基酸每一个氨基酸单位称为氨基酸第47页第47页4.维持蛋自质一级结构共价键有键和维持蛋自质一级结构共价键有键和键。键。5.在在-折叠片层中，多肽链间依托相邻肽链折叠片层中，多肽链间依托相邻肽链间形成键来维持结构稳定性。间形成键来维持结构稳定性。6.-转角结构是由第一个氨基酸残基转角结构是由第一个氨基酸残基C=O与与第个氨基酸残基第个氨基酸残基N-H之间形成之间形成键而键而构成。构成。7.某一个蛋白质，其氨基酸组分中富含谷氨某一个蛋白质，其氨基酸组分中富含谷氨酸和天冬氨酸，它酸和天冬氨酸，它pI值也许会偏。值也许会偏。8.第48页第48页判断题判断题1.在溶液在溶液pH为为7时赖氨酸在电场中向正极方时赖氨酸在电场中向正极方向移动。向移动。2.Edman降解反应中降解反应中PTC是与氨基酸是与氨基酸-羧基羧基形成形成PTC-氨基酸。氨基酸。3.在在2,4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB）反应中，氨基）反应中，氨基酸酸-氨基与氨基与DNFB反应形成黄色反应形成黄色DNP-氨基氨基酸。该反应可用于肽链酸。该反应可用于肽链C-未端氨基酸鉴定。未端氨基酸鉴定。4.一个六肽结构是一个六肽结构是Glu，His，Arg，ValLys。Asp，该肽在，该肽在pH11时向正极迁移。时向正极迁移。第49页第49页5.对同一个蛋自质而言，在氨基酸组分固定后，对同一个蛋自质而言，在氨基酸组分固定后，它氨基酸顺序能够随机排列。它氨基酸顺序能够随机排列。6.在可溶性球蛋白中，苯丙氨酸、色氨酸、亮在可溶性球蛋白中，苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸等含疏水性基团氨基酸大多分布在球蛋氨酸等含疏水性基团氨基酸大多分布在球蛋白分子内部形成疏水内核。白分子内部形成疏水内核。7.透析和盐析原理是相同。透析和盐析原理是相同。8.用凝胶过滤层析（分子筛层析）分离蛋白质用凝胶过滤层析（分子筛层析）分离蛋白质时，总是分子量小先下来，分子量大后下来。时，总是分子量小先下来，分子量大后下来。9.在在SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳中，总是分子聚丙烯酞胺凝胶电泳中，总是分子量小蛋白质迁移较快，分子量大迁移较慢。量小蛋白质迁移较快，分子量大迁移较慢。第50页第50页