细胞的冻存与复苏.pptx

细胞培养细胞培养细胞的冻存与复苏细胞的冻存与复苏冻存与复苏的原理冻存与复苏的原理冷冻速率冷冻速率冷冻保存温度冷冻保存温度复温速率复温速率冷冻保护剂冷冻保护剂冷冻保存方法冷冻保存方法冻存细胞的复苏冻存细胞的复苏相关图片相关图片所谓冷冻保存冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-70的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。在低于-70的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此，采取适当的方法将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。所谓复苏复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。冻存与复苏的原理冻存与复苏的原理如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损溶质损伤或称溶液损伤伤或称溶液损伤。当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂冷冻保护剂，如二甲基亚砜(DMSO)、甘油等，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。而且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。返回返回冷冻速率冷冻速率是指降温的速度，直接关系到冷冻效果。细胞在冷冻过程中会发生如下变化：当细胞被冷至当细胞被冷至-5时时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰细胞内外溶液仍未结冰；当被冷至当被冷至-5-15之间时之间时，细胞外溶液细胞外溶液先出现结冰结冰而细胞内细胞内仍保持未结冰未结冰状态。细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能。其结果是，细胞内水分子细胞内水分子为了和细胞外水分子保持化学能的平衡，会向细胞外流动会向细胞外流动。冷冻速度不同冷冻速度不同，细胞内水分向外流动的情况水分向外流动的情况也不相同不相同：如果冷冻速度慢冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不会发生结冰细胞内不会发生结冰；如果冷冷冻速度快冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，结果随着温度的下降而发生细胞内结冰细胞内结冰；如果冷冻速度非常快（即超快速冷冻）冷冻速度非常快（即超快速冷冻），则细胞内形成的冰晶非常小或不结冰冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状态（玻璃化冷冻玻璃化冷冻）。液体的凝固可分为两种形式：一种是晶体化晶体化，溶液中的分子呈有序排列；另一种情况是非晶体即玻璃化非晶体即玻璃化，液体中的分子呈无序状态，保持未凝固前的状态。冷冻速率冷冻速率不同的冷冻速度不同的冷冻速度既然能使细胞内发生不同的生理变化，也可以对细胞产生不同的损对细胞产生不同的损伤。当冷冻速度过慢时当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。同时冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤产生溶质损伤。当冷冻速度过快时当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较大冰晶，造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤产生细胞内冰晶损伤。超快速玻璃化冷冻超快速玻璃化冷冻对细胞存活来说是最为理想的冷冻方法。细胞内外呈玻璃化凝固，无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不致造成损伤，细胞也不会在高浓度的溶质中长时间暴露而受损。不同细胞的最适冷冻速率不同不同细胞的最适冷冻速率不同。小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞的最适冷冻速率分别为1.6/min、7/min和200/min。细胞与细胞之间的最适冷冻速率可在1.6300/min，故对一种细胞进行冷冻保存之前，首先需要测定其最适冷冻速率，以保证获得最高的冷冻存活率。返回返回冷冻保存温度冷冻保存温度冷冻保存温度冷冻保存温度是指能长期保存细胞的超低温度，在此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和功能。不同的细胞和生物体不同的细胞和生物体以及使用不同使用不同的冻存方法冻存方法要取得同样的冻存效果取得同样的冻存效果，冷冻保存温度冷冻保存温度可以不同可以不同。但从实际和效益的观点出发，液氮温度（液氮温度（-196）是目前最佳最佳的冷冻保存温度。在-196时，细胞的生命活动几乎完全停止，但复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻过程得当，一般生物样品在-196下均可保存十年可保存十年以上。应用-70-80保存细胞，短期内对细胞的活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。在冰点到-40范围内保存细胞的效果不佳。返回返回复温速率复温速率冷冻保护体外培养物除了必须有最佳的冷冻速率、合适的冷冻保护剂和冻存温度外，在复苏时也必须有最佳的复温速率，这样才能保证最后获得最佳冷冻保存效果。复温速率复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。复温速率不当也会降低冻存细胞的存活率。一般来说，复温速度越快越好复温速度越快越好。常规的做法是，在37水浴中，于1-2分钟内完成复苏。复温速度过慢，细胞内往往重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。返回返回冷冻保护剂冷冻保护剂冷冻保护剂冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。冷冻保护剂常常配制成一定的溶液。一般来讲，只有红细胞、大多数微生物和极少数有核的哺乳动物细胞悬浮在不加冷冻保护剂的水或简单的盐溶液中，并以最适的冷冻速率冷冻，可以获得活的冻存物。但对于大多数有核哺乳动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的冷冻物。例如将小鼠骨髓细胞悬浮在不加冷冻保护剂的平衡盐溶液中，并以0.3600/min的冷冻速率降温冷冻，98%以上的细胞会死亡；而加入甘油冷冻保护剂进行冷冻保存时，98%以上的细胞都可存活。冷冻保护剂可分为渗透性渗透性和非渗透性非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂渗透性冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤。同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。甘油和DMSO并不防止细胞内结冰，在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷预冷，让甘油或DMSO等成分渗透到细胞内，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前DMSO的应用比甘油更为广泛，但要注意的是，DMSO在常温下对细胞的在常温下对细胞的毒性作用较大毒性作用较大，而在在4时，其毒性作用大大减弱时，其毒性作用大大减弱，且仍能以较快的速度渗透到细胞内。所以，冻存时冻存时DMSO平衡多在平衡多在4下进行，一般需要下进行，一般需要4060分钟分钟。非渗透性冷冻保护剂非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。其保护机制的假说很多，其中有一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中水分子结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。目前一般多采用联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。由于许多冷冻保护剂（如DMSO）在低温下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温后应及时洗涤冷冻保护剂细胞复温后应及时洗涤冷冻保护剂。返回返回冷冻保存方法冷冻保存方法按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化非玻璃化和玻璃化玻璃化冻存两种。非玻璃化冻存非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70-80，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至-100以下，再直接投入液氮保存的方法。以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化冻存玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。以该中方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。但目前细胞冻存最常用的仍是前一种方法。返回返回玻璃化冻存方法玻璃化冻存方法以下以人单核细胞为例说明这种细胞冻存方法。主要材料主要材料 (1)冷冻保护液：为Hanks平衡盐溶液加入20.5%DMSO（w/v）、15.5%乙酰胺（w/v）、10%丙二醇（w/v）和10%聚乙二醇（Mr 8000）而成。用2 mol/L NaOH调节pH至7.4，现配现用。(2)冻存管：SILASTIC玻璃小管，内径3mm，外径4.5mm；(3)设备：液氮储存罐；(4)待冻存细胞：人类外周血单核细胞。冻存过程冻存过程（1）用常规方法分离全血中单核细胞；（2）在冰浴中预冷冷冻保护液；（3）将装有单核细胞的离心管放置入盛有冰水的烧杯内（冰浴）；（4）沿离心管壁缓慢滴加预冷的冷冻保护液。滴加过程为：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的冻存液以0.75ml/min速度滴加。2107个细胞要滴加15ml冻存液。滴加的时间在15min左右。最终细胞密度要在11061.5106个细胞/ml，边滴加边轻轻晃动离心管；（5）轻轻吹吸混匀细胞冷冻悬液；（6）将细胞冷冻悬液分装于冻存管中。12cm长的冻存管装0.8ml细胞冷冻悬液；（7）将冻存管封口；（8）最后将冻存管直接投入液氮中保存。降温速度约为600/min。冻存结果冻存结果 如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。返回返回冻存细胞的复苏冻存细胞的复苏非玻璃化冻存的复苏方法非玻璃化冻存的复苏方法主要材料主要材料(1)仪器设备：恒温水浴箱、高速离心机；(2)培养用液：完全培养液。复苏过程复苏过程 (1)调配3740的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至3740；(2)从液氮中取出冻存管，立即投入3740 温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解；(3)将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培养液，轻轻吹打混匀；(4)将细胞悬液经8001000r/min离心5min，弃上清夜；(5)向细胞沉淀内加入完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。结果结果复苏后的细胞应该保持其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。讨论讨论细胞冻存悬液一旦融解后，要尽快离心除去冷冻保护液尽快离心除去冷冻保护液，防止冷冻保护剂对细胞产生毒性。实验人员在复苏细胞过程中，同样应具有自我保护意识，避免被液氮冻伤避免被液氮冻伤。玻璃化冻存的复苏方法玻璃化冻存的复苏方法以下以人单核细胞为例说明其过程。主要材料主要材料(1)设备：高速离心机；(2)培养用液：添加20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液、培养液。复苏过程复苏过程(1)将冻存管从液氮中取出，立即投入冰浴中5min。复温速率约560/min。一次可以进行多个冻存管的复苏；(2)将冻存管剪断，可以将5ml细胞冻存悬液转移到50ml离心管中；(3)沿离心管壁缓慢加入已在冰浴中预冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液。前10min以0.2ml/min的速度加入，后10min以0.5ml/min的速度加入，接着的15min以0.75ml/min的速度加入，最后30min以1ml/min的速度加入。全过程约为65min，都在冰浴中进行；(4)将稀释后的细胞悬液以400r/min离心5min，去除上清。向细胞沉淀中加入培养液重新悬浮细胞，用于培养。结果结果复苏后的细胞应该保存其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。讨论讨论复苏时，冷冻保护液的稀释及去除过程与冻存前冷冻保护液的滴加过程一样，不能在室温下而必须在4冰浴中进行，避免在室温下冷冻保护剂对细胞产生毒性。稀释过程也要缓慢进行，保证有足够的时间让冷冻保护剂从细胞内渗出，以达到细胞内外的平衡，避免高渗透压的损伤。返回返回完完