神经毒理学方法专家讲座.pptx

神经毒理学方法神经毒理学方法第1页神经毒理学神经毒理学n n是研究外源化学物对神经系统各部分所引发结构和功效损坏作用一门学科。它主要应用神经解剖、神经病理、神经生化、神经药理和分子生物学学科理论和技术，研究神经毒物在机体内代谢、毒性效应发生类型、特征、主要临床表现及其生化和分子机制，为中毒预防提供科学依据。神经毒理学可看作既属于毒理学分支,又深深扎根与神经科学一门交叉学科 神经毒理学方法第2页n n任何一个方法和技术决定于它所要处理问题，反过来，方法和技术发展必定带来某一学科发展。鉴于神经毒理学特点，其研究方法必显示此学科特点，即神经毒理学研究方法。方法和技术方法和技术学科学科神经毒理学方法第3页传统毒理学研究方法传统毒理学研究方法n n1.1.体内试验体内试验体内试验体内试验：也称为整体动物试验。试验多采取：也称为整体动物试验。试验多采取哺乳动物，惯用哺乳动物，惯用8 8种：大鼠、小鼠、家兔、豚鼠、种：大鼠、小鼠、家兔、豚鼠、仓鼠、狗、雪貂（白鼬）和猴等。其结果标准上仓鼠、狗、雪貂（白鼬）和猴等。其结果标准上可外推到人。可外推到人。n n2.2.体外试验体外试验体外试验体外试验：利用游离器官、培养细胞进行，多：利用游离器官、培养细胞进行，多用于外源化学物对机体急性毒作用初步筛检、作用于外源化学物对机体急性毒作用初步筛检、作用机制和代谢转化过程深入研究。体外试验系统用机制和代谢转化过程深入研究。体外试验系统缺乏整体毒物动力学过程，而且难以研究慢性毒缺乏整体毒物动力学过程，而且难以研究慢性毒作用。作用。神经毒理学方法第4页n n3.人体观察人体观察（急性中毒事故、受控临床试验），能够直接取得关于人体毒理学资料，临床毒理学主要研究仅限于低浓度、短时间接触，而且毒作用应有可逆性。n n4.流行病学研究流行病学研究：对人群直接观察中取得动物试验所不能取得资料，优点是接触条件真实。但流行病学研究干扰原因多。神经毒理学方法第5页神经毒理学研究方法神经毒理学研究方法n n一、神经行为功效评价方法 n n二、神经毒性评价方法 n n三、行为发育毒性测试方法 神经毒理学方法第6页神经行为功效评价方法神经行为功效评价方法n n行为是机体神经系统功效最终输出结果，是神经系统功效综合表达，就当前情况而言，是较理想体检测试评价指标，可为评价各种神经毒物毒效应提供有意义定性和定量依据。n n其特点：行为改变往往出现在器质性损害 之前神经毒理学方法第7页详细方法以下：详细方法以下：n n一、动物神经系统疾病模型一、动物神经系统疾病模型 1 1、帕金森病、帕金森病 经灵长目动物试验，经灵长目动物试验，MPTP(1-MPTP(1-甲基甲基4-4-苯基苯基-1-1，2 2，3 3，6-6-四氢四氢吡啶吡啶)作为能提供人类非常有意义作为能提供人类非常有意义PDPD动物模型而被接动物模型而被接收收 2 2、迟发型神经病、迟发型神经病 鸡作为一些有机磷中毒后引发鸡作为一些有机磷中毒后引发迟发型神经病（迟发型神经病（OPIDNOPIDN）模型已被国际学术界公）模型已被国际学术界公认。认。神经毒理学方法第8页n n二、神经行为功效测试组合二、神经行为功效测试组合 1 1、FIOHFIOH测试组合测试组合 （Finlands Institute of Finlands Institute of Occupational Health,Occupational Health,芬兰职业卫生研究所芬兰职业卫生研究所 ）测试）测试组合组合 2 2、WHO-NCTBWHO-NCTB测试组合测试组合 WHO WHO选定神经行为关键选定神经行为关键测试组合（测试组合（neurobehavioral core test neurobehavioral core test battery,NCTBbattery,NCTB）3 3、NESNES方法方法 神经行为评价系统神经行为评价系统(neurobehavioral evaluation system)(neurobehavioral evaluation system)是是19861986年年LetsLets和和BakerBaker提出一组利用计算机进行测试测试组合。提出一组利用计算机进行测试测试组合。神经毒理学方法第9页n n三、学习和记忆功效测试三、学习和记忆功效测试 （一）、人体试验（一）、人体试验 韦克斯勒记忆量表、韦克斯勒成人智力量表和韦克斯勒记忆量表、韦克斯勒成人智力量表和临床记忆量表主要用来测试人认知和记忆能力。临床记忆量表主要用来测试人认知和记忆能力。（二）、动物试验（二）、动物试验 1 1、小鼠、小鼠Y Y型迷宫试验型迷宫试验 2 2、小鼠跳台试验、小鼠跳台试验 3 3、小鼠避暗试验、小鼠避暗试验 4 4、大鼠穿梭试验（双向回避试验）、大鼠穿梭试验（双向回避试验）5 5、小鼠水迷宫试验、小鼠水迷宫试验神经毒理学方法第10页n n四、运动功效测试（一）、人体试验 手提转速度试验 目标瞄准追击试验 简单反应时间试验（二）、动物试验 活动度测定 运动协调功效测试 痛觉测定神经毒理学方法第11页神经毒性评价方法神经毒性评价方法n n一、神经病理学方法一、神经病理学方法 神经病理形态或组织化学改变是确认神经损神经病理形态或组织化学改变是确认神经损害及其病变可逆性程度主要伎俩，也是确认神经害及其病变可逆性程度主要伎俩，也是确认神经毒性最经典方法。普通研究思绪，先进行肉眼观毒性最经典方法。普通研究思绪，先进行肉眼观察，并辅以脑绝对和相对重量；其次，在光学显察，并辅以脑绝对和相对重量；其次，在光学显微镜下观察基本病变，确定病变脑区后，可深入微镜下观察基本病变，确定病变脑区后，可深入取材作电镜检验。为了确认神经毒性细胞特异性取材作电镜检验。为了确认神经毒性细胞特异性及一些特殊生化过程影响，需用神经系统组织化及一些特殊生化过程影响，需用神经系统组织化学等方法检验。学等方法检验。神经毒理学方法第12页 可使用光镜、电镜、激光扫描共聚焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交法，受体定位法、荧光素示踪技术和放射性核素示踪技术对神经系统进行形态学观察和功效活动形态定位。如：1998年阮素云报道了低浓度铅对大鼠血脑屏障超微结构损害；年赫秋月报道了丙烯酰胺对小鼠小脑浦肯野细胞病理改变；年杨芳报道不一样浓度锂对大鼠原代培养大脑皮层神经元影响。神经毒理学方法第13页n n二、生理与生物化学方法二、生理与生物化学方法 当前应用脑内微透技术，微穿技术，磁共振光当前应用脑内微透技术，微穿技术，磁共振光谱技术，高效液相色谱法，免疫印迹法，放射免谱技术，高效液相色谱法，免疫印迹法，放射免疫分析法等测定神经中枢神经递质释放量及其改疫分析法等测定神经中枢神经递质释放量及其改变。变。如：年李红玉报道了电磁辐射对大鼠海马氨基如：年李红玉报道了电磁辐射对大鼠海马氨基酸类神经递质水平影响；胡卫萱报道了甲基汞对酸类神经递质水平影响；胡卫萱报道了甲基汞对脑组织有极大亲和性，年脑组织有极大亲和性，年YumiYumi等发觉组氨酸可降等发觉组氨酸可降低脑水肿面积增加低脑水肿面积增加 神经毒理学方法第14页n n三、神经电生理学方法三、神经电生理学方法 神经电生理学指标在试验和人群临床研究中都神经电生理学指标在试验和人群临床研究中都得到了较为广发应用，可使用脑电图，感觉诱发得到了较为广发应用，可使用脑电图，感觉诱发电位，肌电图等测试神经系统电活动，离体单个电位，肌电图等测试神经系统电活动，离体单个神经细胞可用斑片钳和膜片钳技术评价单个细胞神经细胞可用斑片钳和膜片钳技术评价单个细胞单个离子通道及其受体电活动。单个离子通道及其受体电活动。如：年阮迪云应用膜片钳技术和原位杂交技如：年阮迪云应用膜片钳技术和原位杂交技术研究了铅对钾通道亚单位和术研究了铅对钾通道亚单位和NMDANMDA受体亚单位受体亚单位影响；年桑楠等报道了二氧化硫衍生物对大鼠海影响；年桑楠等报道了二氧化硫衍生物对大鼠海马神经元外向钾电流特征影响。马神经元外向钾电流特征影响。神经毒理学方法第15页n n四、分子生物学方法 神经生物学研究中惯用分子生物学方法有基因分子克隆，克隆后基因在人工体外系统或细胞中表示，PCR扩增核酸分子技术，原位杂交技术，基因芯片等。如：年张增利报道了农药对小鼠脑细胞组织c-fos、c-jun、mRNA 表示影响；年逯晓波报道了铅对幼鼠海马区Bcl-2、Fas 蛋白表示影响；年丁晓蓉综述了基因芯片与脑衰老研究进展。神经毒理学方法第16页n n五、脑成像技术 脑成像技术很多，有颅骨X射线成像技术、同位素脑扫描、计算机断层扫描、核磁共振成像、正电子发射断层扫描术及单光子发射计算机断层摄影等。如1997年姜锋杰报道了慢性锰中毒颅脑CT改变，为锰中毒诊疗提供了新参考依据。神经毒理学方法第17页行为发育毒性测试方法行为发育毒性测试方法n n一、行为发育毒性测试组合n n二、行为发育毒性研究组合 如：年胡前胜报道了宫内铅暴露对大鼠神经行为发育影响，年李洪钧报道了孕中期铅暴露对婴儿神经行为发育影响研究。神经毒理学方法第18页 能够说，神经毒理学研究方法很多，任何研究神经科学方法如神经生物学、神经生理学、神经生化学、神经病理学、神经药理学、分子神经生物学等方法都适合用于神经毒理学。神经毒理学方法第19页 虽说神经毒理学研究方法很多，不过这些方法是互为补充，有些指标也只有在结合其它相关指标时才能很好地给予解释，实际上，因为神经系统复杂性，单一指标是不可能全方面评价神经毒性，所以将不一样指标组合起来进行成套试验是神经毒性评价主要研究方向。神经毒理学方法第20页n n另外，我个人认为神经毒理学研究方法还可依据试验样本起源分为：n n一、人体研究n n二、动物试验n n三、离体组织或细胞试验神经毒理学方法第21页n n就人体研究而言，其研究方法与动物试验，离体试验有显著不一样，除了对一些特殊志愿者研究外，全部神经毒效应不能采取人体进行研究。只能在接触一些神经毒物或中毒后进行一些神经系统功效临床观察和检测；测定外周血、尿等替换指标，作为评价接触神经毒物生物标志物；死后组织病理学检验。神经毒理学方法第22页n n 动物试验和离体试验研究和应用应恪守优化、降低及替换（refinement、reduction、replacement）3R标准。n n动物试验：需要建立神经系统毒性损伤 动物模型。然后能够应用生理、生化和分子生物学方法检测。另外，转基因或基因剔除动物试验为从基因水平研究毒作用种属差异提供了可能。神经毒理学方法第23页n n离体试验 最常见方法是从动物体分离得到神经细胞，在尽可能模拟体内环境体外条件下，使神经细胞仍保持存活、增殖、发育和分化能力，为下一步进行神经毒理学研究提供所需要材料，然后依据试验设计，可应用生理学、生物化学方和分子生物学方法检测。神经毒理学方法第24页主要参考书目主要参考书目n n毒理学基础 主编：王心如n n当代毒理学概论 主编：顾祖维n n当代毒理学基础 主编：祝寿芬n n医学神经生物学 主编：关新民n n毒理学试验方法与技术 主编：王心如神经毒理学方法第25页