核酸分离纯化专家讲座.pptx

核酸分离纯化技术核酸分离纯化技术核酸分离纯化核酸分离纯化第第1页页v核酸核酸（nucleicacid）是遗传信息携带者，是基因表是遗传信息携带者，是基因表示物质基础。示物质基础。v不论是进行核酸结构还是功效研究，首先需要对核不论是进行核酸结构还是功效研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。酸进行分离和纯化。v核酸样品质量将直接关系到试验成败。核酸样品质量将直接关系到试验成败。概 述核酸分离纯化核酸分离纯化第第2页页一、核酸分离、纯化标准一、核酸分离、纯化标准（一）保持核酸分子一级结构完整性（一）保持核酸分子一级结构完整性1.1.意意义义：遗遗传传信信息息全全部部储储存存在在一一级级结结构构之之中中核核酸酸级级结结构构还还决决定定其其高高级级结结构构形形式式以以及及和和其其它它生生物物大大分分子子结合方式。结合方式。核酸分离纯化核酸分离纯化第第3页页2.2.试验过程中，应注意以下条件及要求：试验过程中，应注意以下条件及要求：1 1）降低化学原因对核酸降解）降低化学原因对核酸降解:pH4-10:pH4-102 2）降低物理原因对核酸机械剪切力：）降低物理原因对核酸机械剪切力：0-40-4 C C 强烈振荡、搅拌，细胞突置于低渗液中，细胞裂解，重复冻强烈振荡、搅拌，细胞突置于低渗液中，细胞裂解，重复冻贮等造成机械剪切力等条件都能显著破坏大分子量线性贮等造成机械剪切力等条件都能显著破坏大分子量线性DNADNA分子，分子，对于分子量小环状质粒对于分子量小环状质粒DNADNA及及RNARNA分子，威胁相对小一些；另外分子，威胁相对小一些；另外如高温加热，除高温本身对核酸分子中化学键破坏作用外，还如高温加热，除高温本身对核酸分子中化学键破坏作用外，还可能因煮沸带来液体剪切力，所以核酸提取经常在可能因煮沸带来液体剪切力，所以核酸提取经常在0 044条件条件下进行。下进行。（一）保持核酸分子一级结构完整性（一）保持核酸分子一级结构完整性核酸分离纯化核酸分离纯化第第4页页3 3）抑制）抑制DNaseDNase或或RNaseRNase活性：活性：所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。制剂。4 4）简化步骤，缩短时间，降低破坏。）简化步骤，缩短时间，降低破坏。（一）保持核酸分子一级结构完整性（一）保持核酸分子一级结构完整性核酸分离纯化核酸分离纯化第第5页页3.DNA3.DNA酶抑制剂酶抑制剂(1(1）金属离子螯合剂：）金属离子螯合剂：DNADNA酶需要金属二价离子酶需要金属二价离子MgMg2+2+、CaCa2+2+激活，所以使用金属二价离子激活，所以使用金属二价离子螯合剂，可抑制螯合剂，可抑制DNADNA酶活性。如酶活性。如EDTAEDTA、柠檬酸盐络合、柠檬酸盐络合MgMg2+2+、CaCa2+2+等等离子离子。(2(2）阴离于型表面活性剂：）阴离于型表面活性剂：如如SDSSDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷复合物，该复合物在高盐溶液中沉并与变性蛋白结合成带负电荷复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。淀。（一）保持核酸分子一级结构完整性（一）保持核酸分子一级结构完整性核酸分离纯化核酸分离纯化第第6页页4.RNA4.RNA酶（酶（RNAase)RNAase)抑制剂抑制剂RNAaseRNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活，所以生物降解是酸、耐碱，不易失活，所以生物降解是RNARNA提取过程中提取过程中主要危害原因。主要危害原因。(1)(1)皂土（皂土（bentonite bentonite）作用机制：皂土带负电荷，能吸附作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNaseRNase，使其失活。，使其失活。（一）保持核酸分子一级结构完整性（一）保持核酸分子一级结构完整性核酸分离纯化核酸分离纯化第第7页页(2)DEPC(2)DEPC(二乙基焦碳酸盐二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体，很强核酸酶抑制剂。粘性液体，很强核酸酶抑制剂。作用机制：作用机制：与蛋白质中与蛋白质中HisHis结合使蛋白变性。结合使蛋白变性。使用注意：使用注意：DEPCDEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性浓度大质变性浓度大10010010001000倍。倍。轻易降解，保留在轻易降解，保留在44或液氮中；或液氮中；提提RNARNA时，时，0.1%DEPC0.1%DEPC浸泡器皿浸泡器皿37 2 h37 2 h。剧毒。剧毒。（一）保持核酸分子一级结构完整性（一）保持核酸分子一级结构完整性4.RNA4.RNA酶（酶（RNAase)RNAase)抑制剂抑制剂核酸分离纯化核酸分离纯化第第8页页（3)3)肝素肝素（4 4）复合硅酸盐（）复合硅酸盐（Macaloid)Macaloid)（5 5）RNaseRNase阻抑蛋白（阻抑蛋白（RNasinRNasin）（6 6）氧钒核糖核苷复合物）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-Ribonucleoside(Vanadyl-Ribonucleoside Complex,VRC)Complex,VRC)4.RNA4.RNA酶（酶（RNAase)RNAase)抑制剂抑制剂（一）保持核酸分子一级结构完整性（一）保持核酸分子一级结构完整性核酸分离纯化核酸分离纯化第第9页页一、核酸分离、纯化标准一、核酸分离、纯化标准(二二)尽可能排除其它分子污染，确保核酸样品纯度尽可能排除其它分子污染，确保核酸样品纯度纯纯化化核核酸酸样样品品不不应应存存在在对对酶酶有有抑抑制制作作用用有有机机溶溶剂剂或或过过高高浓浓度度金金属属离离子子，蛋蛋白白质质、脂脂类类、多多糖糖分分子子污污染染应应降降低低到到最最低低程程度度；无无其其它它核核酸酸分分子子污污染染，如如提提DNADNA分分子子时时，应去除应去除RNARNA分子。分子。核酸分离纯化核酸分离纯化第第10页页破碎组织细胞破碎组织细胞提取提取纯化纯化I.I.材料与方法选择材料与方法选择II.II.破碎细胞或包膜破碎细胞或包膜核酸释放核酸释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.核酸浓缩、沉淀、洗涤核酸浓缩、沉淀、洗涤,并去除杂质并去除杂质V.V.核酸判定与保留核酸判定与保留二、分离提取核酸主要步骤二、分离提取核酸主要步骤核酸分离纯化核酸分离纯化第第11页页临床常见标本有临床常见标本有血液血液、尿液尿液、唾液唾液、组织组织及及体外培养细胞体外培养细胞等等都可作为提取核酸原料，详细试验材料选择应依据试验目标都可作为提取核酸原料，详细试验材料选择应依据试验目标来确定。来确定。v不一样研究目标对核酸完整性、纯度、产量及浓度有不一样要不一样研究目标对核酸完整性、纯度、产量及浓度有不一样要求。求。v需考虑制备核酸所需时间与成本：简便快速、安全、经济；需考虑制备核酸所需时间与成本：简便快速、安全、经济；v应选择安全试剂与制备方案：完整性、产量、纯度和浓度符合应选择安全试剂与制备方案：完整性、产量、纯度和浓度符合试验要求。试验要求。（一）材料与方法选择（一）材料与方法选择核酸分离纯化核酸分离纯化第第12页页临床常见标本有临床常见标本有血液血液、尿液尿液、唾液唾液、组织组织及及体外培养细胞体外培养细胞等等都可作为提取核酸原料，详细试验材料选择应依据试验目标都可作为提取核酸原料，详细试验材料选择应依据试验目标来确定。来确定。v不一样研究目标对核酸完整性、纯度、产量及浓度有不一样要不一样研究目标对核酸完整性、纯度、产量及浓度有不一样要求。求。v需考虑制备核酸所需时间与成本：简便快速、安全、经济；需考虑制备核酸所需时间与成本：简便快速、安全、经济；v应选择安全试剂与制备方案：完整性、产量、纯度和浓度符合应选择安全试剂与制备方案：完整性、产量、纯度和浓度符合试验要求。试验要求。（一）材料与方法选择（一）材料与方法选择核酸分离纯化核酸分离纯化第第13页页vDNADNA和和RNARNA均均位位于于细细胞胞内内（病病毒毒除除外外），所所以以核核酸酸分分离离与与纯纯化化第一步即是裂解细胞、释放核酸。第一步即是裂解细胞、释放核酸。（二）细胞破碎（二）细胞破碎核酸释放核酸释放核酸分离纯化核酸分离纯化第第14页页v破碎细胞方法有三种：破碎细胞方法有三种：v机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；v化学试剂法：化学试剂法：用用SDSSDS处理细胞，处理细胞，SDSSDS可溶解细胞膜、可溶解细胞膜、核膜，去除脂质和蛋白质，并使组织蛋白与核膜，去除脂质和蛋白质，并使组织蛋白与DNADNA分离；分离；v酶解法：酶解法：加入溶菌酶或蛋白酶，都可使细胞膜破加入溶菌酶或蛋白酶，都可使细胞膜破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合蛋白质，裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合蛋白质，促进核酸分离。促进核酸分离。（二）细胞破碎（二）细胞破碎核酸释放核酸释放核酸分离纯化核酸分离纯化第第15页页注意：注意：1.1.细胞破碎方法中机械剪切法不能用于基因组细胞破碎方法中机械剪切法不能用于基因组DNADNA提提取；取；2.2.非机械法惯用化学试剂或酶细胞溶解法。非机械法惯用化学试剂或酶细胞溶解法。（二）细胞破碎（二）细胞破碎核酸释放核酸释放核酸分离纯化核酸分离纯化第第16页页细胞裂解物是含核酸分子复杂混合物，核酸分子本细胞裂解物是含核酸分子复杂混合物，核酸分子本身可能仍与蛋白质结合在一起。身可能仍与蛋白质结合在一起。核酸与蛋白质结协力主要是正负静电吸力核酸与蛋白质结协力主要是正负静电吸力(核酸与核酸与碱性蛋白结合碱性蛋白结合)、氢键和非极性范德华力。、氢键和非极性范德华力。分离核酸分离核酸最困难最困难是将与核酸紧密结合蛋白质分开，是将与核酸紧密结合蛋白质分开，同时防止核酸降解。同时防止核酸降解。（三）核酸分离纯化（三）核酸分离纯化核酸分离纯化核酸分离纯化第第17页页 应该去除杂质主要包含应该去除杂质主要包含:1.1.非核酸大分子污染物非核酸大分子污染物 蛋白质、多糖及脂类物质等大分子物质蛋白质、多糖及脂类物质等大分子物质 2.2.非目标核酸分子非目标核酸分子 分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质 3.3.加入有机溶剂和一些金属离子加入有机溶剂和一些金属离子（三）核酸分离纯化（三）核酸分离纯化核酸分离纯化核酸分离纯化第第18页页1.1.加入浓盐溶液（如加入浓盐溶液（如NaClNaCl）vRNARNA核蛋白和核蛋白和DNADNA核蛋白在不一样浓度氯化钠溶液中溶解度有核蛋白在不一样浓度氯化钠溶液中溶解度有显著区分。显著区分。vDNADNA核蛋白在核蛋白在0.14mol/L 0.14mol/L 氯化钠中溶解度低，但在氯化钠中溶解度低，但在12mol/L12mol/L氯化钠中溶解度高；氯化钠中溶解度高；RNARNA核蛋白在核蛋白在0.14 mol/L0.14 mol/L氯化钠中溶解度氯化钠中溶解度仍有相当大溶解度。调整氯化钠浓度，可使仍有相当大溶解度。调整氯化钠浓度，可使RNARNA核蛋白和核蛋白和DNADNA核蛋白分步提取开来。核蛋白分步提取开来。v核酸核酸-蛋白质加入蛋白质加入NaClNaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；白解聚；核酸分离纯化基本方法核酸分离纯化基本方法核酸分离纯化核酸分离纯化第第19页页2.2.加入加入SDSSDS SDS除有破胞和抑制核酸酶作用外，还含有使核酸从蛋白质上游离出来功效；核酸分离纯化基本方法核酸分离纯化基本方法核酸分离纯化核酸分离纯化第第20页页3.3.酚酚/氯仿抽提氯仿抽提v细胞裂解后离心分离含核酸水相，加入等体积酚氯仿异戊醇混合液，混匀后离心分离。疏水性蛋白质被分配至有机相，核酸则被留于上层水相。v在含核酸水相中加入醋酸钾或醋酸钠，形成核酸盐，核酸盐可被一些有机溶剂沉淀，离心得到核酸能够用70%乙醇洗涤以除去多出盐分，即可取得一定纯度核酸。核酸分离纯化基本方法核酸分离纯化基本方法核酸分离纯化核酸分离纯化第第21页页v酚氯仿混合使用能增加去除蛋白效果，并对核酸酶有抑制作用。v氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，降低残留在水相中酚，同时氯仿含有去除植物色素和蔗糖作用。v在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为预防起泡和促使水相与有机相分离，再加上一定量异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。核酸分离纯化基本方法核酸分离纯化基本方法核酸分离纯化核酸分离纯化第第22页页 (1 (1）使用注意）使用注意 酚通常是透明无色结晶，假如酚结晶展现粉红色或黄色，表明其中含有酚氧化产物，比如醌、二酸等。变色酚不能用于核酸抽提试验，因为氧化物可破坏核酸磷酸二酯键。(2(2）安全操作）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引发严重灼伤，操作时应戴手套。使用酚时应注意使用酚时应注意核酸分离纯化基本方法核酸分离纯化基本方法核酸分离纯化核酸分离纯化第第23页页 沉淀是浓缩核酸最惯用方法。优点：改变核酸溶解缓冲液；重新调整核酸浓度，提升样品浓度；去除溶液中一些盐离子与杂质。（四）核酸浓缩、沉淀与洗涤（四）核酸浓缩、沉淀与洗涤核酸分离纯化核酸分离纯化第第24页页v沉淀方法：沉淀方法：v惯用惯用盐类盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁。化镁。v惯用惯用有机溶剂有机溶剂:乙醇、异丙醇和聚乙二醇乙醇、异丙醇和聚乙二醇v洗涤：洗涤：核酸沉淀经常含有少许共沉淀盐，需用核酸沉淀经常含有少许共沉淀盐，需用70%70%75%75%乙乙醇醇洗涤洗涤去除。去除。（四）核酸浓缩、沉淀与洗涤（四）核酸浓缩、沉淀与洗涤当核酸溶液当核酸溶液pHpH值大于值大于4 4时，核酸分时，核酸分子呈多聚阴离子状态，它与一价或子呈多聚阴离子状态，它与一价或二价阳离子形成盐在许多有机溶剂二价阳离子形成盐在许多有机溶剂中不溶解，也不会被有机溶剂变性。中不溶解，也不会被有机溶剂变性。DNADNA不溶于乙醇等有机溶剂，不溶于乙醇等有机溶剂，所以能够经过乙醇沉淀来纯所以能够经过乙醇沉淀来纯化和浓缩化和浓缩DNADNA。核酸分离纯化核酸分离纯化第第25页页核酸沉淀温度和时间核酸沉淀温度和时间 普普通通强强调调，核核酸酸沉沉淀淀在在低低温温长长时时间间下下进进行行。低低温温长长时时间间沉沉淀淀，易易造造成成盐盐与与DNADNA共共沉沉淀淀，影影响响以以后后试试验验。普普通通使使用用00冰冰水水，10-10-15min15min，DNA DNA样品足可到达试验要求。样品足可到达试验要求。（四）核酸浓缩、沉淀与洗涤（四）核酸浓缩、沉淀与洗涤核酸分离纯化核酸分离纯化第第26页页1.核酸判定核酸判定浓度判定浓度判定纯度判定纯度判定完整性判定完整性判定（五）核酸判定与保留（五）核酸判定与保留核酸分离纯化核酸分离纯化第第27页页v紫紫外外分分光光光光度度法法：核核酸酸分分子子中中碱碱基基含含有有共共轭轭双双键键结结构，能够吸收紫外线，其最大吸收波长为构，能够吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm260nm。v前前提提：核核酸酸样样品品要要较较纯纯，无无显显著著蛋蛋白白质质、酚酚、琼琼脂脂糖糖及及其其它它核酸污染。测定浓度应大于核酸污染。测定浓度应大于0.25g/ml 0.25g/ml。v结结论论：在在波波长长260nm260nm紫紫外外光光下下，1OD1OD值值吸吸光光度度相相当当于于双双链链DNADNA浓度为浓度为50g/ml50g/ml；单链；单链DNADNA为为37 g/ml37 g/ml；RNARNA为为40 ug/ml40 ug/ml。浓度判定浓度判定（五）核酸判定与保留（五核酸判定与保留核酸分离纯化核酸分离纯化第第28页页核酸分离纯化核酸分离纯化第第29页页v荧光光度法：荧光光度法：核酸荧光染料核酸荧光染料溴化乙锭溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身嵌入碱基平面后，本身无荧光核酸在无荧光核酸在UV UV 激发下发出红色荧光。荧光强度强度与溶激发下发出红色荧光。荧光强度强度与溶液中核酸含量呈正比。液中核酸含量呈正比。使用一系列已知不一样浓度使用一系列已知不一样浓度DNADNA溶液溶液作标准对照，可比较出被测作标准对照，可比较出被测DNADNA溶液浓度。溶液浓度。v注意：注意：此法比较主要基于目测，是预计水平。此法比较主要基于目测，是预计水平。（五）核酸判定与保留（五）核酸判定与保留EBEB与与DNADNA结合结合浓度判定浓度判定核酸分离纯化核酸分离纯化第第30页页 紫外分光光度法：紫外分光光度法：主主要要经经过过A A260260与与A A280280比比值值来来判判定定有有没没有有蛋蛋白白质质污污染。比值升高或降低均提醒制备核酸纯度不佳。染。比值升高或降低均提醒制备核酸纯度不佳。纯度判定纯度判定（五）核酸判定与保留（五）核酸判定与保留核酸分离纯化核酸分离纯化第第31页页纯度判定纯度判定（五）核酸判定与保留（五）核酸判定与保留判断核酸样品纯度：判断核酸样品纯度：DNA DNA纯品纯品:ODOD260260/OD/OD280 280=1.8=1.8 RNA RNA纯品纯品:OD OD260260/OD/OD280 280=2.0=2.0比值降低：蛋白质污染（比值降低：蛋白质污染（280280）、酚污染（）、酚污染（270270）比值升高：比值升高：DNADNA变性、变性、RNARNA污染污染混合污染：比值正常混合污染：比值正常核酸分离纯化核酸分离纯化第第32页页荧光光度法：荧光光度法：EBEB等荧光染料示踪核酸电泳可判定核酸制品纯度。等荧光染料示踪核酸电泳可判定核酸制品纯度。（五）核酸判定与保留（五）核酸判定与保留纯度判定纯度判定核酸分离纯化核酸分离纯化第第33页页琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：v以以EBEB为示踪剂核酸凝胶电泳可判定核酸制品完整性；为示踪剂核酸凝胶电泳可判定核酸制品完整性；v依据电泳条带数目、位置和形状判定，依据电泳条带数目、位置和形状判定，RNARNA分子能够经分子能够经过荧光强度强弱来判定有没有降解。过荧光强度强弱来判定有没有降解。v基因组基因组DNADNA假如发生降解，电泳图呈拖尾状。假如发生降解，电泳图呈拖尾状。完整性判定完整性判定（五）核酸判定与保留（五）核酸判定与保留核酸分离纯化核酸分离纯化第第34页页DNADNA降解降解（五）核酸判定与保留（五）核酸判定与保留核酸分离纯化核酸分离纯化第第35页页 完完整整或或降降解解极极少少总总RNARNA电电泳泳图图谱谱中中，原原核核生生物物5S5S、16S16S、23S23S三三条条带带；真真核核生生物物：5S5S和和5.8S5.8S、18S18S、28S28S三条带；而且三条带；而且三条带荧光强度应呈特定比值。三条带荧光强度应呈特定比值。v沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高v沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低 （五）核酸判定与保留（五）核酸判定与保留 完整性判定完整性判定核酸分离纯化核酸分离纯化第第36页页v28S28S（或或23S23S）RNARNA荧荧光光强强度度普普通通约约为为18S18S（或或16S16S）RNA2RNA2倍倍，不不然然提提醒有醒有RNARNA降解；降解v若若在在点点样样孔孔附附近近有有着着色色条条带带，提提醒醒可可能能存存在在DNADNA污染。污染。（五）核酸判定与保留（五）核酸判定与保留核酸分离纯化核酸分离纯化第第37页页核酸保留主要条件是温度和介质核酸保留主要条件是温度和介质温度：温度：4样品经常使用样品经常使用-70是长久保留良好温度，为一次性保留是长久保留良好温度，为一次性保留-20保留保留,防止重复冻融防止重复冻融保留介质：保留介质：灭菌水灭菌水TE缓冲溶液缓冲溶液(最惯用最惯用)：10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0（五）核酸判定与保留（五）核酸判定与保留2.核酸保留核酸保留DNA保留保留核酸分离纯化核酸分离纯化第第38页页vDNADNA样样品品溶溶于于pH8.0TEpH8.0TE缓缓冲冲液液中中，44或或-20-20保保留留，-7070冰箱可保留多年。冰箱可保留多年。vTEpHTEpH为为8.08.0时时，DNADNA脱脱氨氨反反应应降降低低，pHpH低低7.07.0时时DNADNA易易变性变性v长久保留样品中可加入长久保留样品中可加入1 1滴氯仿。滴氯仿。（五）核酸判定与保留（五）核酸判定与保留2.核酸保留核酸保留DNA保留保留核酸分离纯化核酸分离纯化第第39页页RNARNA样品溶于样品溶于0.3 mol/L NaAc(pH5.2)0.3 mol/L NaAc(pH5.2)或双蒸灭菌或双蒸灭菌水中，水中，-70-70保留保留长久保留能够沉淀形式贮于乙醇中长久保留能够沉淀形式贮于乙醇中;在在RNARNA溶液中，加溶液中，加1 1滴滴0.2 mol/L VRC(0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷氧钒核糖核苷复合物复合物)冻贮于冻贮于-70,-70,可保留多年。可保留多年。（五）核酸判定与保留（五）核酸判定与保留2.核酸保留核酸保留RNA保留保留核酸分离纯化核酸分离纯化第第40页页A：测：测DNA：纯纯DNA样品样品OD260/OD280应为应为1.8，OD260mOD230应大于应大于2.0。1)OD260/OD280大于大于1.9时，表明有时，表明有RNA污染污染。2)小于小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；3)OD260/OD230小于小于2.0时，表明溶液中有残余盐和小时，表明溶液中有残余盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：注：可能可能出现既含蛋白质又含出现既含蛋白质又含RNADNA溶液比值为溶液比值为1.8情情况。况。测定结果分析测定结果分析核酸分离纯化核酸分离纯化第第41页页B：测：测RNA 纯纯RNARNA样品其样品其OD260OD260OD280OD280应介于应介于1.7-2.01.7-2.0之间，之间，OD260/OD230OD260/OD230比比值应大于值应大于2.02.0。1 1）若）若RNARNA样品样品OD260/OD280OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚污染；比值太小，说明有蛋白质或酚污染；2 2）比值大于）比值大于2.02.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；时，可能被异硫氰酸胍等污染；3 3）OD260/OD230OD260/OD230比值小于比值小于2.02.0时表明有小分子及盐存在。时表明有小分子及盐存在。核酸分离纯化核酸分离纯化第第42页页