结核病诊断TSPOT实验.pptx

汇汇汇汇 报报报报 人：人：人：人：培训专业：呼吸内科培训专业：呼吸内科培训专业：呼吸内科培训专业：呼吸内科指导老师：指导老师：指导老师：指导老师：.12.14 .12.14 .12.14 .12.140102结核病试验室检验及意义结核病试验室检验及意义结核病诊断TSPOT实验第1页目录目录01.01.分枝杆菌概述分枝杆菌概述02.02.结核病试验室检验结核病试验室检验03.03.小结小结2结核病诊断TSPOT实验第2页分枝杆菌概述分枝杆菌概述013结核病诊断TSPOT实验第3页分枝杆菌属分类分枝杆菌属分类结核分枝杆菌(M.tuberculosis)非结核分枝杆菌（NTM）麻风分枝杆菌（M.leprae）4结核病诊断TSPOT实验第4页结核分枝杆菌发觉结核分枝杆菌发觉1882年年 德国柯赫医生发觉结核致病菌德国柯赫医生发觉结核致病菌-结核杆菌结核杆菌5结核病诊断TSPOT实验第5页结核杆菌变迁结核杆菌变迁1897年提出结核病飞沫传输年提出结核病飞沫传输1922年，卡介苗为预防结核病年，卡介苗为预防结核病首次对新生儿接种首次对新生儿接种1945年，链霉素问世使肺结核年，链霉素问世使肺结核不再是不治之症。不再是不治之症。6结核病诊断TSPOT实验第6页结核分枝杆菌结核分枝杆菌特点特点(M.tuberculosis)生物学主要特点：生物学主要特点：1.细胞壁中含有大量细胞壁中含有大量脂质脂质2.引发疾病都呈引发疾病都呈慢性慢性并并伴肉芽肿伴肉芽肿3.抗酸染色阳性抗酸染色阳性7结核病诊断TSPOT实验第7页结核病结核病由结核分枝杆菌引发慢性感染性疾病由结核分枝杆菌引发慢性感染性疾病8结核病诊断TSPOT实验第8页结核病结核病临床表现临床表现症症 状状 体体 征征 1.全身症状：消瘦、全身症状：消瘦、盗汗、低热、乏力盗汗、低热、乏力2.呼吸系统症状：咳呼吸系统症状：咳嗽、约嗽、约1/3咯血咯血3结核变态反应结核变态反应表现表现因肺结核好发于因肺结核好发于肺上叶尖后段及肺上叶尖后段及下叶背段，故锁下叶背段，故锁骨上下、肩胛间骨上下、肩胛间区叩诊音浊区叩诊音浊9结核病诊断TSPOT实验第9页结核病发病机制结核病发病机制起始起始期期细胞外增殖期和传输期细胞外增殖期和传输期共生期共生期T T细胞反应期细胞反应期10结核病诊断TSPOT实验第10页结核病发病机制结核病发病机制结核分枝杆菌经过飞沫进入呼吸道，被肺泡巨噬细胞吞噬杀灭结核分枝杆菌经过飞沫进入呼吸道，被肺泡巨噬细胞吞噬杀灭，不不留任何痕迹和感染证据。留任何痕迹和感染证据。特点：不存在结核杆菌复制，不存在免疫周围细胞免疫应答特点：不存在结核杆菌复制，不存在免疫周围细胞免疫应答起始期起始期结结核核分分枝枝杆杆菌菌在在体体内内复复制制，形形成成感感染染灶灶，由由T T细细胞胞介介导导细细胞胞免免疫疫和和迟发型变态反应，深入去除细菌。迟发型变态反应，深入去除细菌。特点：激活体内免疫反应特点：激活体内免疫反应（CMICMI和和DTHDTH），宿主取得抗结核抵抗力），宿主取得抗结核抵抗力反反应期期11结核病诊断TSPOT实验第11页结核病发病机制结核病发病机制 在在低低氧氧、低低pHpH、抑抑制制性性脂脂肪肪酸酸和和宿宿主主免免疫疫机机制制共共同同作作用用下下抑抑制制细细菌菌增增殖殖。结结核核分分枝枝杆杆菌菌未未被被完完全全去去除除，细细菌菌和和宿宿主主处处于于共共生生状状态态，结结核核杆杆菌菌主主要要存存在在于于坏坏死死组组织织中中央央。特特点点：可可激激发发和和维维持持T T细细胞胞免免疫疫记记忆忆，在在一一定定条条件件下下再再次发病次发病共生期共生期长久休眠结核细菌在一定条件下，再次增殖，突破宿主免疫屏障长久休眠结核细菌在一定条件下，再次增殖，突破宿主免疫屏障，引，引起结核起结核病病特点：结核播散特点：结核播散增殖增殖传输期期12结核病诊断TSPOT实验第12页接触活动性结核病患者接触活动性结核病患者暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫力去除暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫力去除-没有症状没有症状,结核杆菌依旧结核杆菌依旧存在而不能存在而不能被检测被检测 -X-X-光光/CT/CT 扫描显示正常扫描显示正常-没有抗体应答没有抗体应答-诊疗困难诊疗困难-传统结核感染检测只有传统结核感染检测只有 TSTTST（PPDPPD）机体被感染机体被感染受机体免疫力抑制受机体免疫力抑制没有临床症状没有临床症状终生处于感染状态终生处于感染状态潜伏感染潜伏感染有临床症状有临床症状含有传染性含有传染性-结核杆菌能够经过涂片、结核杆菌能够经过涂片、培养检测出培养检测出-胸部胸部 X-X-光或光或 CT CT 扫描显示异常扫描显示异常 -肺外结核难以诊疗肺外结核难以诊疗 (尤其是儿童尤其是儿童)活动性结核活动性结核5%5%再次激活再次激活活动性结核与潜伏感染活动性结核与潜伏感染13结核病诊断TSPOT实验第13页结核病结核病诊疗诊疗试验室检验试验室检验影像检验影像检验病理检验病理检验+临床临床 指征指征14结核病诊断TSPOT实验第14页结核杆菌试验室检验结核杆菌试验室检验02结核病诊断TSPOT实验第15页结核诊疗结核诊疗-临床应用临床应用几几乎乎全全部部临临床床内内科科科科室室都都需要结核判别诊疗：需要结核判别诊疗：发烧待查，结核排筛发烧待查，结核排筛结脑判别诊疗结脑判别诊疗胸腹水患者待查胸腹水患者待查儿童结核儿童结核16结核病诊断TSPOT实验第16页结核杆菌结核杆菌结核病结核病试验室检试验室检查查细菌学检验细菌学检验免疫学检验免疫学检验分子生物学检验分子生物学检验分分枝杆菌分离培养枝杆菌分离培养分支杆菌药敏试验分支杆菌药敏试验分枝杆菌菌种鉴分枝杆菌菌种鉴定定体液免疫学诊疗体液免疫学诊疗细胞免疫学诊疗细胞免疫学诊疗DNA测序测序DNA探针技术探针技术聚聚合酶链反应（合酶链反应（PCR）17结核病诊断TSPOT实验第17页结核分枝杆菌结核分枝杆菌-试验室检验试验室检验涂片镜检涂片镜检细菌学检验细菌学检验适合用于各种标本；操作简便，价格低廉。适合用于各种标本；操作简便，价格低廉。2份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性；份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性；1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+肺部影像学检验符合活动性肺结核表现。肺部影像学检验符合活动性肺结核表现。肺结核治疗评定主要依据之一肺结核治疗评定主要依据之一 18结核病诊断TSPOT实验第18页结核分枝杆菌结核分枝杆菌-试验室检验试验室检验缺点：缺点：不能区分是否为非结核分枝杆菌不能区分是否为非结核分枝杆菌 不能区分死活菌。不能区分死活菌。结核杆菌暴露于异烟肼时，一些条件会失去抗酸性，出现假阴性。结核杆菌暴露于异烟肼时，一些条件会失去抗酸性，出现假阴性。检测灵敏度较低（检测灵敏度较低（104-105 个细菌个细菌/毫升）毫升）。19结核病诊断TSPOT实验第19页结核杆菌培养结核杆菌培养细菌学检验细菌学检验传统方法：传统方法：L-JL-J固体培养基固体培养基快速培养法快速培养法:检检测测细细菌菌生生长长过过程程中中代代谢谢产产生生CO2CO2或或消消耗耗O2O2，显显微微镜镜直直接接观观察察、变色液体培养基变色液体培养基等等BACTEC MGIT960BACTEC MGIT960系统系统 BACTEC460BACTEC460系统系统、Bact/ALERT 3DBact/ALERT 3D、ESPESP等。等。痰培养、其它标本培养痰培养、其它标本培养20结核病诊断TSPOT实验第20页结核杆菌培养结核杆菌培养阴性培养阴性培养阳性培养阳性培养无或微弱荧光无或微弱荧光FFFO2FO2FO2FO2FO2FFO2FO2CO2O2O2O2O2O2O2O2O2CO2CO2O2FFFFFO2FO2FFFFCO2O2O2O2O2O2强荧光强荧光传感器传感器对氧气高度敏感钌复合物对氧气高度敏感钌复合物肉汤肉汤改良改良Middlebrook 7H9肉汤肉汤上部空间上部空间已预先充填已预先充填10%CO2BACTECBACTEC MGIT MGIT 960/320 960/320 指示器系统指示器系统指示器系统指示器系统21结核病诊断TSPOT实验第21页结核杆菌培养结核杆菌培养1 1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+1 1份痰标本结核分枝杆菌培养份痰标本结核分枝杆菌培养 痰痰涂涂片片阴阴性性，肺肺部部影影像像学学检检验验符符合合活活动动性性肺肺结结核核影影像像学学表表现现+1+1份痰标本结核分枝杆菌培养阳性份痰标本结核分枝杆菌培养阳性用于耐多药结核疗效判定用于耐多药结核疗效判定结核菌培养临床结核菌培养临床价值价值确诊结核确诊结核22结核病诊断TSPOT实验第22页抗酸杆菌培养优缺点抗酸杆菌培养优缺点敏感性较直接涂片法高，理论上敏感性较直接涂片法高，理论上10-10010-100条菌条菌/毫升可检出阳性；毫升可检出阳性；特异性较直接涂片法高，能够从菌落生长速度、色素产生初步判断非特异性较直接涂片法高，能够从菌落生长速度、色素产生初步判断非结核分枝杆菌；结核分枝杆菌；分离出含有活力纯培养物，为深入药敏试验提供基础。分离出含有活力纯培养物，为深入药敏试验提供基础。需时长需时长，依据接种量大小，普通，依据接种量大小，普通2-82-8周才能得到肉眼可见菌落。周才能得到肉眼可见菌落。结果受标本保留运输时间、培养基成份和质量、前处理方法等影响，结果受标本保留运输时间、培养基成份和质量、前处理方法等影响，操作操作较直接涂片法较直接涂片法复杂复杂，需经严格培训，需经严格培训 。需培养基凝固灭菌器、离心机、涡旋振荡器、恒温培养箱等需培养基凝固灭菌器、离心机、涡旋振荡器、恒温培养箱等设备设备。成本成本是直接涂片法是直接涂片法7-87-8倍。倍。23结核病诊断TSPOT实验第23页细胞免疫学检验细胞免疫学检验结核菌素皮肤试验（结核菌素皮肤试验（PPD试验）试验）干扰素释放试验（干扰素释放试验（T-SPOT试验）试验）24结核病诊断TSPOT实验第24页免疫学检验免疫学检验细胞免疫学细胞免疫学检验检验PPD-PPD-结核菌素试验结核菌素试验迟发型细胞超敏反应迟发型细胞超敏反应1 1）方法：）方法：1:1:OTOT或或PPDPPD液液0.10.1毫升毫升(5(5单位单位)，左前臂屈侧中部左前臂屈侧中部皮内注皮内注射，射，48-72h48-72h测量皮肤测量皮肤硬结硬结直径直径。25结核病诊断TSPOT实验第25页PPD-PPD-结核菌素试验结核菌素试验2 2）判断标准判断标准：阴性阴性4mm4mm弱阳性弱阳性5-9mm5-9mm阳性阳性10-19mm10-19mm，强阳性强阳性20mm20mm或局部出现水泡与坏死或局部出现水泡与坏死26结核病诊断TSPOT实验第26页PPD-PPD-结核菌素试验结核菌素试验3)3)结核菌素试验意义结核菌素试验意义阴性阴性：无结核菌感染；不能排除结核感染。：无结核菌感染；不能排除结核感染。阳性阳性：曾有结核感染，并不一定现在患病。：曾有结核感染，并不一定现在患病。强阳性强阳性：活动性结核病可能：活动性结核病可能 A、变态反应还未建立；、变态反应还未建立；B、免疫抑制如应用皮质、免疫抑制如应用皮质激素或营养不良等激素或营养不良等27结核病诊断TSPOT实验第27页PPD-PPD-结核菌素试验结核菌素试验 PPDPPD所含抗原为致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌及卡介苗菌株所含抗原为致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌及卡介苗菌株所共有，其结果受到卡介苗接种及其它分枝杆菌感染影响，所共有，其结果受到卡介苗接种及其它分枝杆菌感染影响，特异性较差特异性较差。当出现免疫功效低下时可出现假阴性结果当出现免疫功效低下时可出现假阴性结果，敏感性低敏感性低。免疫力正常阴性有一定意义。强阳性有一定意义。有结核变免疫力正常阴性有一定意义。强阳性有一定意义。有结核变态反应、淋巴结核强阳性多。态反应、淋巴结核强阳性多。经济、简便，能够用于流行病学大规模筛查和普查，但存在经济、简便，能够用于流行病学大规模筛查和普查，但存在着显著缺点。着显著缺点。PPDPPD试验临床价值试验临床价值28结核病诊断TSPOT实验第28页T-SPOTT-SPOT试验试验细胞免细胞免疫学检验疫学检验T-SPOTT-SPOT试验原理试验原理结核感染者体内存在特异效应结核感染者体内存在特异效应T T淋巴细胞，效应淋巴细胞，效应T T淋巴细胞再次受到淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌各种细胞因子（结核抗原刺激时会分泌各种细胞因子（IFN-IFN-）。）。所以，所以，检测效应检测效应T T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者诊疗。淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者诊疗。既用抗体捕捉培养中细胞所分泌细胞因子，并以酶联斑点显色方式既用抗体捕捉培养中细胞所分泌细胞因子，并以酶联斑点显色方式将其表现出来。将其表现出来。刺激抗原刺激抗原：ESAT-6ESAT-6蛋白蛋白(早期分泌抗原靶早期分泌抗原靶6）、CFP-10CFP-10蛋白（蛋白（培养滤液蛋白）培养滤液蛋白）由结核分枝杆菌特有由结核分枝杆菌特有RD1RD1基因编码基因编码，可刺激活化效应，可刺激活化效应T T淋巴细胞产生淋巴细胞产生干扰素。干扰素。RD1RD1基因在基因在BCGBCG以及大部分环境分枝杆菌中缺失。以及大部分环境分枝杆菌中缺失。29结核病诊断TSPOT实验第29页T-SPOTT-SPOT试验试验干扰素干扰素检测阴性检测阴性干扰素干扰素检测阳性检测阳性TB抗原多肽T细胞活化T细胞 干扰素30结核病诊断TSPOT实验第30页T-SPOT步步骤骤31结核病诊断TSPOT实验第31页T-SPOTT-SPOT灵敏度灵敏度ReferenceSensitivity Jafari et al AJRCCM 174;9:1048-53100.0%(12/12)Ferrara et al Lancet 376;1328-34*83.3%(20/24)Lee et al Eur Respir J 28;24-30*96.6%(84/87)Goletti et al Clin Microbiol Infect 12;6:544-50*91.3%(21/23)Meier et al EJCMID 24;529-53695.9%(70/73)Kang et al Chest.Sep;132(3):959-65*92.2%(59/64)Janssens et al ERJ 30(4):722-898.3%(57/58)Clarke et al Clin Exp Immunol 150(2):238-44.90.0%(27/30)Detjen et al CID 1;45(3):322-8*92.9%(26/28)Ozekinci et al J Int Med Res;35:696-70392.9%(26/28)Soysal et al IJTLD 12(1):50-56*80.8%(80/99)Dominguez et al Clin Vacc Immunol 15(1);168-71*85.7%(36/42)Chee et al J Clin Microbiol.Apr 9*94.1%(254/270)Vincenti et al Clin Exp Immunol.Oct;150(1):91-8*84.6%(11/13)Wang et al Emerging Infect Dis 13;4:553-887.2%(34/39)Losi et al Eur Respir J.Dec;30(6):1173-9100.0%(10/10)Kim et al Arch Intern Med 167;20:2255-2259100.0%(22/22)Connell et al PLoS ONE.3;7:e2624*100.0%(9/9)Kobashi et al.Scand J Infect Dis.40;8:629-34*87.5%(42/48)Kobashi et al.J Infect.Epub ahead of print.*90.0%(36/40)Domnguez et al.Diagn Microbiol Infect Dis.*Epub ahead of print84.2%(32/38)Goletti et al.PLoS ONE.3;10:e3417.*89.9%(62/69)Bosshard et al.Respir Med.Epub ahead of print98.4%(62/63)Higuchi Med Microbiol Immunol.Epub ahead of print*95.9%(47/49)TOTAL92.0%(1139/1238)灵敏度灵敏度基本基本不受免疫力低下不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很受抑制影响，在肺外结核患者中有很高检出率高检出率 美国美国FDA数据：灵敏度数据：灵敏度95.6%(175/183)国内临床数据：灵敏度国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)32结核病诊断TSPOT实验第32页结核杆菌结核杆菌 特异性高特异性高只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应无交叉反应 美国美国FDA数据：特异性数据：特异性97.1%(297/306)国内临床数据：特异性国内临床数据：特异性94.1%(478/508)33结核病诊断TSPOT实验第33页PPDPPD皮试与皮试与T-SPOTT-SPOT试验试验PPD皮试皮试T-SPOTT-SPOT试验试验预计敏感性(活动性结核患者）7590%（对免疫抑制患者敏感性进降低显著）7595%（对免疫抑制患者敏感性降低不显著）预计特异性（无结核病史或暴露史健康人）7095%（接种BCG者特异性深入降低）90100%（接种BCG者特异性不变）与BCG交叉反应存在存在存在可能性较小与NTM交叉反应存在存在存在可能性较小与M.TB暴露相关性存在存在相关性较相关性较PPD皮试大皮试大阳性结果与随访期间罹患结核相互关系中到显著正相关无充分证据可重复性可重复性中等，但可变中等，但可变较高，但证据较少较高，但证据较少 PPD皮试皮试和和T-SPOTT-SPOT试验试验比较比较34结核病诊断TSPOT实验第34页T-SPOTT-SPOT试验试验结果解释结果解释 阴性结果阴性结果提醒患者体内不存在针对结核杆菌特异效应提醒患者体内不存在针对结核杆菌特异效应T细胞。假阴性结果：细胞。假阴性结果：感染阶段不一样；感染阶段不一样；少数免疫系统功效不全少数免疫系统功效不全/疾病；疾病；试验非正常操作。试验非正常操作。阳性结果阳性结果提醒患者体内存在针对结核杆菌特异效应提醒患者体内存在针对结核杆菌特异效应T细胞，患者存在结核感染。不过细胞，患者存在结核感染。不过否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果：4种环境分枝杆菌感染时：种环境分枝杆菌感染时：M.kansasii（堪萨斯）、（堪萨斯）、M.szulgai（苏氏）、（苏氏）、M.marinum（海）、（海）、M.gordonae（戈登）（戈登）降低了医生主观原因对检测结果影响降低了医生主观原因对检测结果影响;故即使检测仪器昂贵，操作相对较为复杂，但仍可视为进行结核病早期故即使检测仪器昂贵，操作相对较为复杂，但仍可视为进行结核病早期诊疗较为理想伎俩。诊疗较为理想伎俩。35结核病诊断TSPOT实验第35页非血液样本检测非血液样本检测T-SPOT可经过一些体液成功地诊疗出活动性结核：支气管肺泡灌洗液（“BAL”）（肺部）脑脊髓液（“CSF”）（中枢神经系统）胸腔积液（肺部周围）腹膜液（腹腔）非血样本T-SPOT结果很强话（即存在大量结核效应T细胞）,揭示在这个器官或部位存在活动性结核非血样本中不存在结核效应T细胞，说明这个器官或部位没有活动性结核36结核病诊断TSPOT实验第36页各国对潜伏感染风险人群筛查指南各国对潜伏感染风险人群筛查指南风险人群风险人群美国指南美国指南加拿大指南加拿大指南英国指南英国指南免疫力抑制人群（比如，HIV感染者，使用强松或TNF-抑制剂治疗）TST或IGRA；假如是阴性或高度怀疑，TST和IGRA都要检验TST，假如TST阴性要用IGRA确认TST或或IGRABCG接种者（假如也属于其它风险人群）推荐用推荐用IGRA没有特定推荐TST或或IGRA与传染性肺结核患者亲密接触TST或或IGRATST，用IGRA深入确认TST阳性TST，用IGRA深入确认TST阳性医务工作者医务工作者TST或或IGRA推荐用推荐用TSTTST或或IGRA，视情况而定，视情况而定无法再来确认TST结果人群（比如，流浪汉，注射吸毒者或交通不方便）推荐用推荐用IGRA没有特定推荐推荐用推荐用IGRA37结核病诊断TSPOT实验第37页小结小结03结核病诊断TSPOT实验第38页小结小结结核病核病诊疗金金标准：准：抗酸杆菌培养抗酸杆菌培养-阳性阳性病理病理结果果-阳性阳性辅助伎助伎俩：影像学、分子生物学影像学、分子生物学结核病在核病在临床上仍不容忽略床上仍不容忽略，但，但诊疗仍存在仍存在难题T-SPOT是是结核病早期核病早期诊疗较为理想伎理想伎俩39结核病诊断TSPOT实验第39页参考文件参考文件1.韦海旭，席薇莲，陆利欢，陈健韦海旭，席薇莲，陆利欢，陈健.-干扰素释放分析干扰素释放分析T-SPOTTB在结核性疾病中诊疗价值在结核性疾病中诊疗价值.临床肺科杂志临床肺科杂志.,17(8):1439-1440 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