胰酶消化贴壁细胞.pptx

贴壁细胞消化处理贴壁细胞消化处理贴壁细胞消化处理贴壁细胞消化处理及注意事项及注意事项及注意事项及注意事项胰酶消化贴壁细胞1/34贴壁细胞:在体外培养条件下，必须贴附于支 持物表面才能生长细胞。如CHO细胞。消化：使经过分散组织或贴壁培养物相互或与介质解离，形成单细胞或小细胞团操作。胰酶消化贴壁细胞2/34贴壁细胞消化贴壁细胞消化 贴壁细胞在培养瓶中长成致密单层后，继续生长空间不足，培养基中营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，扩增、传代。贴壁较紧细胞如Hela，HepG2，CHO等，则需要以细胞消化液消化后，才能脱落和分散，扩瓶。惯用消化液为胰蛋白酶，EDTA等 胰酶消化贴壁细胞3/34主要消化方式一、酶消化法(胰酶Trypsin)二、离子螯合剂(EDTA)胰酶消化贴壁细胞4/34一、酶消化法(胰酶Trypsin )1)胰酶消化原理:胰酶是一个蛋白酶。经过在特定位置上降解蛋白，使细胞膜上和培养皿壁结合处蛋白降解，使二者分离。这时细胞因为本身内部细胞骨架张力以及培养液表面张力作用下成为球形。细胞消化用胰蛋白酶惯用工作浓度为0.25，pH为7.2-7.4之间。胰酶消化贴壁细胞5/342)酶消化法操作过程：（以下操作均必须严格按无菌操作要求进行）将长成致密单层细胞细胞瓶中原来培养液弃去；加入0.25胰酶溶液，视细胞瓶大小加入体积为0.5ml或更多（依培养器皿大小而定以使充分浸润；胰酶消化贴壁细胞6/34普通消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶底由半透明（细胞单层连接成片）转为点状透明（出现细小空隙）时，弃去胰酶，并加入适量有血清培养液终止消化，吹打分散。胰酶消化贴壁细胞7/34图示：CHO贴壁细胞 胰酶消化贴壁细胞8/34经过48小时培养成为致密单层胰酶消化贴壁细胞9/34加入0.25%胰酶后细胞逐步皱缩变圆，细胞间隙增大不再致密 胰酶消化贴壁细胞10/34细胞显著皱缩变小，细胞间隙增大不再致密，部分细胞维持正常形态，部分细胞皱缩变圆。胰酶消化贴壁细胞11/34细胞基本皱缩变圆 此时细胞吹打可下 胰酶消化贴壁细胞12/34细胞完全皱缩变圆此时应弃去胰酶加入培养基后轻摇可将细胞从细胞瓶壁上洗下，将细胞悬液用吸管吹散后传代 胰酶消化贴壁细胞13/34有经验后，可肉眼对光观察贴壁半透明细胞层，判断消化程度。如消化过头，会见到许多细胞脱落随弃去胰酶溶液流失,甚至造成细胞破碎。也能够在倒数第二、三步时弃去胰酶，用瓶中残留胰酶继续作用至最终一步消化程度，这么略有点过也影响不大 胰酶消化贴壁细胞14/34注意事项1在溶解一周内使用贮存在4冰箱中液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4就可能开始降解，假如在室温下放置超出30分钟，就会变得不稳定。2.在使用胰酶细胞消化液过程中要尤其注意防止消化液被细菌污染。胰酶消化贴壁细胞15/34 3.胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，不然细胞铺板后生长情况会较差。消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，重复吹打一样也会损伤细胞活性。4.在37时,胰酶活性最强。胰酶消化贴壁细胞16/345.溶液中Ca2+、Mg2+和血清中非特异性胰蛋白酶抑制剂会降低胰酶活力消化过头，所以加入有血清培养基能够终止反应胰酶消化贴壁细胞17/34常见问题:用胰蛋白酶消化后，细胞还是成团，原因可能是什么？消化时间不够；吹打力度不够；胰酶消化液浓度不够；胰酶本身问题；细胞密度过高;胰酶消化贴壁细胞18/34二、离子螯合剂：（EDTA）1)EDTA消化 原理:EDTA是一个螯合剂，因为细胞表面很多和培养皿结合蛋白都带有Ca2+,或者Mg2+，而EDTA就是螯合Ca2+,或者Mg2+，从而加速细胞和培养皿脱离。胰酶消化贴壁细胞19/342)EDTA消化液使用注意事项 1.惯用浓度在0.02%左右。2.在弱碱性条件下才易溶,配制时应调整好酸碱度。3.EDTA能显著影响PH值,且不会被终和,所以消化下来细胞要拿PBS洗一遍胰酶消化贴壁细胞20/343)适用范围因为EDTA不破坏细胞表面分子，仅与Ca2+,Mg2+螯合。所以适合用于需检测细胞表面分子细胞消化。胰酶消化贴壁细胞21/34细胞保留细胞保留胰酶消化贴壁细胞22/34细胞冻存:细胞保留主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196液氮中 低温保留，使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特征保留起来，这么在需要时候再复苏细胞用于试验。细胞复苏：将冻存细胞解冻，再进行传代培养。胰酶消化贴壁细胞23/34要取得好冻存与复苏效果，必须了解以下几个问题：冷冻速率复温速率冷冻保护剂冷冻保留温度胰酶消化贴壁细胞24/341 1、冷冻速率冷冻速率 冷冻速率是指降温速度，是活细胞能否被冷冻到一个能永久保留温度一个主要原因。冷冻速率太快或太慢都会造成细胞损伤，只有以最适冷冻速率冷冻细胞，才能取得最正确冷冻保留效果。胰酶消化贴壁细胞25/342 2、复温速率、复温速率 复温速率是指细胞复苏时温度升高速度。冷冻保留细胞复苏时，复温速率不妥也会降低冷冻存活率。普通来说复温速度越快越好，37水浴中，12分钟内要完成复温。胰酶消化贴壁细胞26/343 3、冷冻保护剂、冷冻保护剂冷冻保护剂是指能够保护细胞免受冷冻损伤物质，常被加到一定溶液中进行配制，作为冷冻保护液。惯用冷冻保护剂：胰酶消化贴壁细胞27/344 4、冷冻保留温度、冷冻保留温度 冷冻保留温度是指能长久保留细胞一个深低温度。在这么温度下，细胞生化反应极其迟缓或停顿，但经长久保留和复苏后仍能保持正常结构和功效。从实际和效益观点出发，液氮温度（196）是当前最正确冷冻保留温度胰酶消化贴壁细胞28/34：是一个渗透性保护剂，可快速透入细胞，提升胞膜对水通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，降低胞内冰晶，从而降低冰晶对细胞损伤。浓度必须=10%,大于这个浓度即使在低温对细胞也有毒性作用。有些细胞不能用DMSO，可用甘油。胰酶消化贴壁细胞29/34细胞冻存程序1细胞冻存前24-48小时传代培养，使细胞处于 指数生长久 2经胰酶消化后，加入适量培养基，吹打成细胞 悬液 3加入新生牛血清4加入经过除菌过滤5混匀胰酶消化贴壁细胞30/346将悬液加入灭菌冻管中，1-2 ml/支，严密封口后，注明细胞名称 7置4度冰箱中，30分钟后转入-20度冰箱中，30分钟后转入液氮口，小时后转入液氮中保留8.复苏一支细胞，检测细胞活力及有没有污染 胰酶消化贴壁细胞31/34细胞复苏程序取出贮存细胞，37水浴中快速融化 直接用完全生长培养基铺板细胞。1ml冻存细胞使用1020ml完全生长培养基.24小时细胞贴壁后换液.胰酶消化贴壁细胞32/34注意:1)冻存可用10%-90%血清，普通高浓度血清有利于维护细胞活力.2)细胞在-15度左右胞内形成结晶对细胞损伤最大，迟缓降温有利于降低损伤，故放入-20度冰箱中冻存可实现迟缓降温较为方便，保留时间过久会影响细胞活力 胰酶消化贴壁细胞33/34谢谢胰酶消化贴壁细胞34/34