蛋白质的两性电离及等电点测定实验.pptx

实实验验一一蛋蛋白白质质两两性性电电离离与与等等电电点点蛋白质的两性电离及等电点测定实验第1页【教学目标教学目标】1 1、独立操作，一丝不苟地作试验。、独立操作，一丝不苟地作试验。2 2、仔细观察不一样阶段试剂颜色改变及沉淀出现、仔细观察不一样阶段试剂颜色改变及沉淀出现和消失，经过现象观察能分析蛋白质两性电离性和消失，经过现象观察能分析蛋白质两性电离性质，正确填写试验汇报。质，正确填写试验汇报。3 3、经过往五支不一样、经过往五支不一样pHpH值溶液试管内加入酪蛋白，值溶液试管内加入酪蛋白，观察沉淀出现情况，确定其等电点。观察沉淀出现情况，确定其等电点。4 4、共同讨论测定等电点原理。、共同讨论测定等电点原理。蛋白质的两性电离及等电点测定实验第2页一、蛋白质两性电离一、蛋白质两性电离 多多肽肽链链中中氨氨基基酸酸残残基基中中有有可可解解离离基基团团，如如：末末端端-COO-COO-、-NH-NH3 3+，酸酸性性氨氨基基酸酸侧侧链链-COOCOO-，LysLys-NH-NH3 3+，ArgArg胍基，胍基，HisHis咪唑基。咪唑基。*蛋白质等电点蛋白质等电点(pI)(pI)当当蛋蛋白白质质溶溶液液处处于于兼兼性性离离子子，净净电电荷荷为为零零，此时溶液，此时溶液pH称为称为蛋白质等电点。蛋白质等电点。蛋白质的两性电离及等电点测定实验第3页 NH3+NH3+NH2P P P COOH COO-COO-正离子 兼性离子 负离子 pHpI pH=pI pHpI+OH-+OH-+H+H+n各种蛋白质氨基酸组成不一样，解离情况不一样，各种蛋白质氨基酸组成不一样，解离情况不一样，等电点不一样。多数靠近等电点不一样。多数靠近5.05.0。蛋白质性质之一：两性电离与等电点蛋白质性质之一：两性电离与等电点蛋白质的两性电离及等电点测定实验第4页【试验原理试验原理】蛋白质分子是两性电解质。蛋白质在溶液蛋白质分子是两性电解质。蛋白质在溶液pHpH值为等电点时游离为两性离子，溶解度值为等电点时游离为两性离子，溶解度最低，轻易沉淀析出。若在大于或小于等最低，轻易沉淀析出。若在大于或小于等电点溶液中，因蛋白质分子带有同种电荷电点溶液中，因蛋白质分子带有同种电荷而相互排斥，不易产生沉淀。而相互排斥，不易产生沉淀。蛋白质的两性电离及等电点测定实验第5页【试剂试剂】1 1、0.50.5酪蛋白醋酸钠酪蛋白醋酸钠2 2、0.010.01溴甲酚绿指示剂溴甲酚绿指示剂 变色范围是变色范围是pH3.8pH3.85.45.4。指示剂酸色型为黄色，碱色型为蓝色。指示剂酸色型为黄色，碱色型为蓝色。3 3、0.02mol0.02molL L盐酸溶液盐酸溶液 4 4、0.02mol0.02molL L氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液5 5、1.00mol1.00molL L乙酸溶液乙酸溶液 6 6、0.10mol0.10molL L乙酸溶液乙酸溶液7 7、0.01mol0.01molL L乙酸溶液乙酸溶液蛋白质的两性电离及等电点测定实验第6页【操作操作】1 1、蛋白质两性电离、蛋白质两性电离 （1 1）取一支试管，加入）取一支试管，加入0.50.5酪蛋白醋酸钠溶液酪蛋白醋酸钠溶液2020滴和滴和0.010.01溴甲酚绿指示剂溴甲酚绿指示剂2 2滴，摇匀。观察溶液颜色，统计，并滴，摇匀。观察溶液颜色，统计，并分析原因。分析原因。（2 2）用细滴管迟缓加入）用细滴管迟缓加入0.02mol/L0.02mol/L盐酸溶液，、边滴边摇，盐酸溶液，、边滴边摇，直至有显著大量沉淀发生，此时溶液直至有显著大量沉淀发生，此时溶液pHpH值靠近酪蛋白等电值靠近酪蛋白等电点。观察溶液颜色改变，统计，分析原因。点。观察溶液颜色改变，统计，分析原因。（3 3）继续滴入）继续滴入0.02mol0.02molL L盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色改变，统计，分析原因。改变，统计，分析原因。（4 4）再滴入）再滴入0.02mol0.02molL L氢氧化钠溶液进行中和，观察是否氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现沉淀，统计，解释原因。当继续滴入出现沉淀，统计，解释原因。当继续滴入0.02mol0.02molL L氢氧氢氧化钠溶液时，观察沉淀和溶液颜色改变。解释其原因。作化钠溶液时，观察沉淀和溶液颜色改变。解释其原因。作好统计。好统计。蛋白质的两性电离及等电点测定实验第7页 结果及分析结果及分析 操作操作 试验结果 简明分析在酪蛋白溶液中加入在酪蛋白溶液中加入指示剂指示剂滴入滴入HCL至出现大量至出现大量 沉淀沉淀继续滴入继续滴入HCL滴入滴入NaOH溶液溶液继续滴入继续滴入NaOH溶液溶液至沉淀溶解至沉淀溶解蛋白质的两性电离及等电点测定实验第8页2 2、酪蛋白等电点测定、酪蛋白等电点测定（1 1）取）取5 5支试管，编号后按下表次序准确地加入各支试管，编号后按下表次序准确地加入各种试剂，然后混合均匀种试剂，然后混合均匀(每管加入酪蛋白醋酸钠每管加入酪蛋白醋酸钠溶液后，须马上摇匀该管溶液后，须马上摇匀该管)。蛋白质的两性电离及等电点测定实验第9页 试剂试剂(ml)及管号及管号12345蒸蒸馏馏水（水（ml)1.6_3.01.53.40.01mol/L醋酸溶液醋酸溶液_2.50.60.10mol/L醋酸溶液醋酸溶液_4.01.0_1.0mol/L醋酸溶液醋酸溶液2.4_酪蛋白醋酸酪蛋白醋酸钠钠溶液溶液1.01.01.01.01.0溶液最终pH3.24.14.75.35.9沉淀出现多少(2)(2)静置约静置约20 min20 min，观察每支试管中溶液混浊度，以，观察每支试管中溶液混浊度，以-，+，+，+，+符号表示沉淀多少，将结果统计于上表中。符号表示沉淀多少，将结果统计于上表中。蛋白质的两性电离及等电点测定实验第10页（3 3）该试验要求各种试剂浓度和加入量必须相当）该试验要求各种试剂浓度和加入量必须相当准确。除了需要精心配制试剂以外，试验中应严准确。除了需要精心配制试剂以外，试验中应严格按照定量分析操作进行。格按照定量分析操作进行。思索题思索题依据试验观察结果，指出哪一支试管依据试验观察结果，指出哪一支试管pHpH是酪蛋白是酪蛋白等电点？在等电点时蛋白质溶解度为何最低？请等电点？在等电点时蛋白质溶解度为何最低？请结合你试验结果和蛋白质胶体性质加以说明。结合你试验结果和蛋白质胶体性质加以说明。蛋白质的两性电离及等电点测定实验第11页