感受态的制备质粒的转化和筛选专家讲座.pptx

试验五试验五感受态制备、感受态制备、质粒转化和筛选质粒转化和筛选-10-30感受态的制备质粒的转化和筛选感受态的制备质粒的转化和筛选第第1页页试验安排试验安排感受态制备质粒转化第二天，观察结果质粒酶切-电泳检测 上次试验产物（质粒）感受态的制备质粒的转化和筛选感受态的制备质粒的转化和筛选第第2页页酶切电泳点样安排酶切电泳点样安排电泳上样：1、全部同学各自酶切产物（10-20 l）2、每排点样孔需有两种质粒：pUC119、pUC119-U63、同一人“酶切前”与“酶切后”相邻点样感受态的制备质粒的转化和筛选感受态的制备质粒的转化和筛选第第3页页试验步骤试验步骤加1.5ml培养物于EP管，4000rpm10min 加入冰凉CaCl2溶液300 l，重悬菌体 沉淀中加入冰凉CaCl2溶液120 l，重悬菌体感受态制备冰浴15-30min，4000rpm10min搜集沉淀，去上清搜集沉淀，去上清（去掉培养基）感受态的制备质粒的转化和筛选感受态的制备质粒的转化和筛选第第4页页试验步骤试验步骤每管感受态中加质粒5 l，混匀42 ，热激90秒，勿摇动每管加LB 500 l，37摇床，复苏30-40min 铺200 l 菌液到LB琼脂平板，涂匀转化冰上静置20-30min感受态的制备质粒的转化和筛选感受态的制备质粒的转化和筛选第第5页页怎样设计试验参考体系怎样设计试验参考体系（对照组）？（对照组）感受态的制备质粒的转化和筛选感受态的制备质粒的转化和筛选第第6页页筛选试验步骤LB培养基（X-gal,IPTG,Amp）LB培养基感受态+质粒（pUC119-U6 or pUC119）感受态（无质粒）pUC119-U6pUC119对照组B？对照组A？感受态的制备质粒的转化和筛选感受态的制备质粒的转化和筛选第第7页页基因克隆应用酶学方法，在体外将各种起源遗传物质（同源或异源、原核或真核、天然或人工DNA）与载体DNA接合成一含有自我复制能力DNA分子复制子(replicon)，继而经过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目标基因转化子细胞，再进行扩增提取取得大量同一DNA分子，也称DNA克隆或重组DNA(recombinant DNA)。感受态的制备质粒的转化和筛选感受态的制备质粒的转化和筛选第第8页页基因克隆示意图基因克隆示意图感受态的制备质粒的转化和筛选感受态的制备质粒的转化和筛选第第9页页基因克隆操作过程：分分离目标基因 切限制酶切目标基因与载体接拼接重组体 转转入受体菌 筛筛选重组体 感受态的制备质粒的转化和筛选感受态的制备质粒的转化和筛选第第10页页受体菌条件安全宿主菌 限制酶和重组酶缺点处于感受态(competent)导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)重组DNA导入受体菌感受态的制备质粒的转化和筛选感受态的制备质粒的转化和筛选第第11页页LB 0.18M0.1M CaCl20.1M CaCl2H2O细胞膨胀：低渗环境胞膜收缩：低温环境离子扩散：DNA-Ca2热休克：42 1L LB培养基:10g 胰蛋白胨5g 酵母提取物10g NaCl 感受态的制备质粒的转化和筛选感受态的制备质粒的转化和筛选第第12页页重组体筛选重组DNA导入受体菌后，经过培 养使其大量繁殖，再设法将含有目标基因菌落区分判定出来，这一过程即为筛选（screening）或选择（selection）。感受态的制备质粒的转化和筛选感受态的制备质粒的转化和筛选第第13页页重组体筛选 1.直接选择法(1)抗药性标识选择(2)标志补救(marker rescue)互补（蓝白斑筛选）(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹 2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等感受态的制备质粒的转化和筛选感受态的制备质粒的转化和筛选第第14页页 互补检测蓝白斑筛选感受态的制备质粒的转化和筛选感受态的制备质粒的转化和筛选第第15页页感受态细胞转化效率检验感受态细胞转化效率检验1g完整质粒转化到感受态细胞中，得到转化细菌数量完整质粒转化到感受态细胞中，得到转化细菌数量。比如，取比如，取1l（0.1 ng/l）完整质粒转化）完整质粒转化100l感受态细胞感受态细胞.向转化反应液中加入向转化反应液中加入900l培养液，让细菌恢复一小段时间，培养液，让细菌恢复一小段时间，取取100l铺板铺板.培养过夜，产生培养过夜，产生1000个菌落。转化个菌落。转化0.1 ng DNA，用，用SOC稀释到稀释到1000l后，取后，取1/10涂平板，则涂平板共用涂平板，则涂平板共用0.01 ng DNA 质粒。质粒。转化率转化率1000克隆克隆/0.01 ng DNA=105 cfu/ng=108 cfu/g转化效率转化效率1106 cfu/g DNA可满足普通亚克隆试验；可满足普通亚克隆试验；1107 cfu/g DNA用于作更复杂亚克隆，有限量用于作更复杂亚克隆，有限量DNA转化，转化，T-克隆试验；构建文库和突变要求用转化效率为克隆试验；构建文库和突变要求用转化效率为1108 cfu/g DNA 感受态的制备质粒的转化和筛选感受态的制备质粒的转化和筛选第第16页页