液质联用培训讲义 Waters.pdf

Quattro LC/Micro液质联用培训讲义2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训内容仪器质量校正仪器质量校正定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器定量实验定量实验维护及故障排除维护及故障排除常用备件号常用备件号2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训仪器质量校正仪器质量校正1.注射泵注入校正溶液，以碘化钠铯（异丙醇/水=1：1,NaI 2ug/L,CsI 50ng/L）溶液为例，流速5ul/min在质谱调机页面（MS Tune）监看四个扫描质量：172.9,622.6,1072.2,1971.6确认讯号良好及注射针内样品量充足!2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训仪器质量校正仪器质量校正2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训仪器质量校正仪器质量校正ESI+参数设置(参数设置确保校正样品最大质谱信号响应)Capillary(kV)3.5Cone(V)30Extractor(V)3RF lens(V)0.3Source Temp100Desolvation Temp200Gas Flow-Desolvation350Gas Flow-Cone502005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训仪器质量校正仪器质量校正2.在质量分析器页面（Analyzer）设定以下的数值，括号内的数值即为设定值：LM Resolution 1（15.0）HM Resolution 1（15.0）Ion Energy 1（0.5）Entrance（50）Collision（2）Exit（50）LM Resolution 2（15.0）HM Resolution 2（15.0）Ion Energy 2（0.5）此为第一段和第二段扫描模式参数。这是因为在进行质量校正的时候必须同时校正两个质量分析器的三种模式（静态扫描、动态扫描、扫描速率补偿）的缘故。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训仪器质量校正仪器质量校正2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训仪器质量校正仪器质量校正3.在质谱调机页面（MS Tune）选择校正仪器以开启的质量校正页面。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训仪器质量校正仪器质量校正4.开启质量校正页面后，质量校正前请先确定目前仪器处于未校正的状态，所有六种校正都为未校正（No Calibration），若不然则开启一个未校正（Uncal.cal）的档案。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训仪器质量校正仪器质量校正5.从下拉式选单选择适当的参考档案，如以碘化钠铯，从下拉式选单选择适当的参考档案，如以碘化钠铯校正质量范围两千以内可选择 Naics2。确认后按开始键。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训仪器质量校正仪器质量校正6.按开始键后会跳出自动校正选单请勾选所有种类（Type）处理程序部分选择讯号采集和校正（Acquire&Calibrate），可勾选打印报告（Print Report）勾选完成后点压采集参数（Acquisition Parameters）！注意，在设定采集参数前请不要按OK键。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训仪器质量校正仪器质量校正static calibration静态精确校正:使四极杆质量分析器准确地停在指定的质荷比上(如：Tuning，SIR，MRM)。scanning calibration 扫描校正:能确保所采集到的质谱峰进行准确质量测量(如在全扫描方式)scan speed compensation扫描速度补偿:当仪器进行快速扫描时，对系统进行延时补偿校正。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训仪器质量校正仪器质量校正7.设定采集参数：选择适当的校正质量范围，校正大范围的全质量从22校正到2000，其余的参数可以使用预设参数default即可，设定完后按OK键。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训仪器质量校正仪器质量校正8.按OK键后会跳出步骤6的自动校正选单，此时按此页面OK键就会开始进行质量校正。9.当所有的校正都完成后，将校正的结果储存起来，从质量校正页面的档案（File）选取另存新档（Save As）。输入所欲储存之文件名称后按OK即可。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训仪器质量校正仪器质量校正2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训仪器质量校正仪器质量校正10.输入所欲储存之文件名称后按存盘即可，确认所有的扫描模式都已经被校正。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训仪器质量校正仪器质量校正11.根据实验要求，分别按上述步骤实验LM/HM=15，LM/HM=14，LM/HM=13三条校正曲线。用途:根据实验需求分别调用不同分辨率的校正曲线.用途:根据实验需求分别调用不同分辨率的校正曲线.2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器实验要点:通过调谐仪器各项参数,不同化合物ESI/APCI的响应,毛细管电压,锥孔电压,RF lens,离子能量,去溶剂化气温度,去溶剂化气流量,反吹气流量等参数,找出目标化合物最佳响应参数,发挥最佳仪器检测灵敏度.1全扫描 full scanMS1MS2CollisionCellMS1MS2CollisionCellScanning(m/z M)RF onlyScanning(m/z M)RF only2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器样品：利血平标样,调谐最佳实验锥孔cone voltage(CV)、毛细管电压、RF lens、离子能量等参数，进行全扫描获最大分子离子峰609。样品：利血平1ppm(乙腈：水=1:1配置)ESI+scan:609(CV=45)2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器2子离子扫描 daughter scan MS1MS2CollisionCellMS1MS2CollisionCellStatic(m/z 609.1)ScanningStatic(m/z 609.1)ScanningArgon gasArgon gasPrecursorPrecursorProductsProducts利血平标样,根据全扫描获得最佳实验锥孔CV、毛细管电压、RF lens、离子能量等参数，调谐碰撞能量collision energy(CE)、碰撞压力，进行子离子扫描实验准备。Daughter scan：609/195，448，397，174 2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器碰撞压力 310-3mbar2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器3.多反应监控MRM MS1MS2CollisionCellMS1MS2CollisionCellStatic m/z 609.1Static m/z 195.1Static m/z 195.1Argon gasArgon gasArgon gasArgon gasPrecursorsPrecursorsProductProduct2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器样品1利血平标样1ppm,根据全扫描获得最佳实验锥孔（CV），调谐特定碎片最佳实验碰撞能量（CE），进行多反应监控MRM实验准备ESI+MRM:609/195(CV=45,CE=55)样品2.对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸乙酯/对羟基苯甲酸丁酯1ppm实验，调谐最佳实验锥孔电压（CV/碰撞能量（CE）ESI-对羟基苯甲酸甲酯MRM:151/136,92 CV 30/CE 15/CE 20对羟基苯甲酸丙酯MRM:179/136,92 CV 30/CE 15/CE 20对羟基苯甲酸丁酯MRM:193/136,92 CV 30/CE 18/CE 25 2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器4母离子扫描MS1MS2CollisionCellScanningStatic m/z92Argon gasArgon gasPrecursorPrecursorProductsProducts样品：对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯/对羟基苯甲酸丁酯实验与氨基酸混合液。调谐最佳实验锥孔电压（CV）/碰撞能量（CE），对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸乙酯/对羟基苯甲酸丁酯三种化合物有共同碎片92，可进行母离子扫描将其与氨基酸区别开。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器5.中性丢失扫描neutral loss：MS1MS2CollisionCellMS1MS2CollisionCellScanning(m/z M)Scanning(m/z M-46Da)Scanning(m/z M)Scanning(m/z M-46Da)Argon gasArgon gasArgon gasArgon gasPrecursorPrecursorProductsProducts样品：混合氨基酸实验中性丢失46(甲酸)中性丢失63(甲酸+NH3)2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器常见17种混合氨基酸m/zM+H+天门冬氨酸(Asp或D)134丝氨酸(Ser或S)106谷氨酸(Glu或E)148甘氨酸(Gly或G)76*组氨酸(His或H)156*精氨酸(Arg或R)175苏氨酸(Thr或T)120丙氨酸(Ala或A)90脯氨酸(Pro或P)116半胱氨酸(Cys或C)121酪氨酸(Tyr或Y)182缬氨酸(Val或V)118蛋氨酸(Met或M)150*赖氨酸(Lys或K)147异亮氨酸(Ile或I)132亮氨酸(Leu或L)132苯丙氨酸(Phe或F)166备注：*碱性氨基酸 易中性丢失63(甲酸+NH3)带苯环氨基酸 仲氨酸 易中性丢失46(甲酸)2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器6.混合扫描样品：对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯/对羟基苯甲酸丁酯与氨基酸混合液。要求：一次实验同时完成多种扫描组合方式羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯/对羟基苯甲酸丁酯采用母离子扫描氨基酸采用中性丢失扫描2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器Full scan(MS),daughter scan(MS/MS),MRM实验参数设置建议如下：Full scan(MS)MRM(MS/MS)daughter scan(MS/MS)2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器parent scan(MS/MS),neutral loss scan(MS/MS)实验参数设置建议如下：parent scan(MS/MS)neutral loss scan(MS/MS)2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器7.其它 参数设置Interscan delay time：一般设定为0.1s,如果选择正负离子同时扫描，扫描间隔要设为0.3s。Interchannel delay time：一般设定为0.02s。Dwell time：停留时间，一般设定为1s，（最少不低于0.1s），较长的停留时间可以增加灵敏度。停留时间设置与色谱图采集点数有关，通常要求色谱图采集点数至少为15 个，一个色谱图出峰时间15秒计，停留时间设定为1s,Dwell time还与实验采集的通道有关,检测通道数目增加,要保证色谱图采集点数为15 个,需适当减少Dwell time 时间。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器液相梯度：2695带11条梯度曲线，inlet method编辑中可更改curve，从而实现液相梯度的调整。11条梯度曲线，inlet method编辑中可更改curve，从而实现液相梯度的调整。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器11条梯度曲线表述11条梯度曲线表述124356789 10 112005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器从上到下，分别为curve 6，7，8变化影响分离情况（凹形变化）从上到下，分别为curve 6，5，4变化影响分离情况（凸形变化）2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定量实验定量实验对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯/对羟基苯甲酸丁酯定量实验、Quanlynx数据处理、标准曲线调用、报告输出对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸丙酯对羟基苯甲酸丁酯分子量152 分子量180 分子量194 2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定量实验定量实验实验内容：样品：对羟基苯甲酸甲酯/丙酯/丁酯1ppm(甲醇：水=1：1配置)实验甲醇：水=1：1，0.2ml/min 2.1mm*50mm*3.5um稀释10倍，进样2/4/6/8/10/12/14ul （对于细内径短柱进样量少好）或分别稀释10/20/30/40/50/100/200进样10ulESI-为达到仪器最佳检测灵敏度,MRM 设置母离子/子离子建议精确到小数后一位对羟基苯甲酸甲酯MRM:151/136,92 CV 30/CE 15,CE 20对羟基苯甲酸丙酯MRM:179/136,92 CV 30/CE 15,CE 20对羟基苯甲酸丁酯MRM:193/136,92 CV 30/CE 18,CE 252005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定量实验定量实验利用Quanlynx软件Quan optimise 自动优化实验参数 找出最佳锥孔电压cone voltage（CV）/碰撞能量collision energy（CE）对羟基苯甲酸丙酯标样1ppm,根据全扫描获得最佳实验锥孔（CV），调谐特定碎片最佳实验碰撞能量（CE），进行多反应监控MRM实验准备并自动完成定量实验。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定量实验定量实验用用 QuanLynx来编辑定量方法来编辑定量方法2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定量实验定量实验1.在Quanlynx界面中选择，会出现定量方法编辑界面。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定量实验定量实验定量实验定量实验2.在里输入组份名称，点击，这时组份名称会被添加到左侧的组份表里。重复第二步，将所要使用的组份逐一添加到组份表里。3.同时打开相应的色谱图，用鼠标右键选择相应的色谱峰，该色谱峰对应的信息(质谱通道、保留时间、保留时间窗口等参数)会自动被添加到定量方法编辑界面里.2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定量实验定量实验4.如果某组份是内标物，则需要在Internal Ref.里选中该组份。5.注意：Concentration of Standards 项目中,各组份一定要与样品表中的浓度表相对应.6.点击，编辑通用参数。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定量实验定量实验选择用面积还是峰高定量输入浓度单位选择是用内标法还是外标法选择校正曲线形式：线性二次方校正曲线是否过原点2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定量实验定量实验7.点击，编辑相关积分参数。A.谱图平滑参数设定点击Smooth进入下面谱图平滑参数设定窗口。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定量实验定量实验用鼠标右键选中目标峰的半峰宽，Window Size(scans)会被自动计算出来。选择Savitzky Golay 方式2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定量实验定量实验B.峰积分选择这里有二组参数，1）Baselines 它用来设定色谱峰基线位置以便进行积分，2）Peak Seperation是用来设定色谱峰的分离度参数或者，直接勾选Apex Track Peak Integration软件自动处理。勾选2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定量实验定量实验选择Threshold进行阈值设定。(根据实际情况设定)2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定量实验定量实验9.选择File-Save As 并输入方法名。8.在Concentration of Standards中，选择样品表所对应的浓度(CONC_A column)，如果用内标法定量时，内标物用Fixed选项。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定量实验定量实验用QuanLynx进行批处理定量分析用QuanLynx进行批处理定量分析1.在样品表中，选择要进行定量分析的样品。2.选择 QuanLynx，在QuanLynx软件中，选择Process Sample。3.选择三项处理功能：Integrate,Calibrate,and Quantify.4.选择相应的定量方法。5.QuanLynx软件就能根据所选的定量方法进行自动定量分析，并显示出定量结果2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定量实验定量实验浏览定量报告（浏览定量报告（Browse Result）1.在QuanLynx软件中，选择Browse Result，就可浏览定量结果且打印报告。2.用QuanLynx 软件可浏览定量数据，浏览方法是选择File Import QuanData,，选择相应的数据结果。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定量实验定量实验3.点击 Display在customize the display中选择 results table,chromatogram,summary,calibration,colors和fonts.?在 Summary area项目中选择 Summary 选择“List by compound”就能显示所有组份的结果。?选择View-Statistics，可查看相同浓度的样品结果?选择View Totals Bar 可看到同一样品中所有组份的结果。4.选择 Display-Slideshow 要显示样品的色谱图，以及各组份的定量结果。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定量实验定量实验5.修正QuanLynx定量方法和批处理方法：?选择 Edit Method，可修正定量方法，然后保存并退出。?选择 Processing Execute.这将对样品表进行批处理，并建立一新的校正曲线且对结果进行列表。?打印输出报告?选择 File Report Format 可改变报告输出格式选择 File Print，打印报告2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训定量实验定量实验6.输出样品信息(包括Areas,Amounts,etc)，使用的方法：?File-Export Current Summary 输出现行样品表中所列的各组份结果。?File-Export Complete Summary 输出样品表中每个样品的所有组份结果。File Export All Groups Summary输出所有样品结果2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训维护及故障排除维护及故障排除实验要求：15-28摄氏度 氮气99%：0.7MPa，氩气99.9%：0.10.2 MPa通常维护包括：ESI源更换毛细管/一级、二级锥孔清洗/机械泵油更换/液相单向阀更换/液相在线过滤器更换2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训维护及故障排除维护及故障排除12695 面板提示lost prime 12695 面板提示lost prime 冲程50ul，压力25psi时会发生冲程50ul，压力25psi时会发生一般情况一般情况wet prime 或或dry prime即可，或为单向阀脏见图示，需清洗即可，或为单向阀脏见图示，需清洗/更换；更换；2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训维护及故障排除维护及故障排除22695面板plunger homing over pressure 为在线过滤芯inline filter堵，需取下用超声波清洗或更换。22695面板plunger homing over pressure 为在线过滤芯inline filter堵，需取下用超声波清洗或更换。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训维护及故障排除维护及故障排除通常压力波动两元流动相50psi以内正常，单流动相20 psi以内正常，脱气真空0.8psi内正常。通常压力波动两元流动相50psi以内正常，单流动相20 psi以内正常，脱气真空0.8psi内正常。流速与冲程关系：0.3ml/min 冲程25ul。流速与冲程关系：0.3ml/min 冲程25ul。在软件inlet method 中可编冲程。在软件inlet method 中可编冲程。另外若seal wash所用洗液流空，可在新装洗液后，2695面板diagnose中选seal wash自动进行，还可配合针筒吸废液管同时进行。另外若seal wash所用洗液流空，可在新装洗液后，2695面板diagnose中选seal wash自动进行，还可配合针筒吸废液管同时进行。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训维护及故障排除维护及故障排除3MS连接通讯问题：3MS连接通讯问题：退出软件，重新进入或用Peek 管轻轻接触Quattro micro仪面板右下角热启动键,真空指示灯会闪一会，仪器自动进行重新通讯连接而无须关机。但Peek 管轻轻接触Quattro micro仪面板右下角热启动键不可时间太长，否则真空会自动卸掉。退出软件，重新进入或用Peek 管轻轻接触Quattro micro仪面板右下角热启动键,真空指示灯会闪一会，仪器自动进行重新通讯连接而无须关机。但Peek 管轻轻接触Quattro micro仪面板右下角热启动键不可时间太长，否则真空会自动卸掉。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训维护及故障排除维护及故障排除4ESI probe更换毛细管：2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训维护及故障排除维护及故障排除2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训维护及故障排除维护及故障排除2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训维护及故障排除维护及故障排除5.机械泵：泵的油面宜在2/3处，泵长期运作时每周需拧开灰色振气旋钮(56圈)进行半小时振气，使油内的杂物排出,然后再拧紧该旋钮。如果是做APCI 操作,每天工作结束后,应按上述方法对机械泵进行振气操作。通常3-6个月更换一次油。（发现油的颜色变深或液面下降至1/2以下，需及时更换。）2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训维护及故障排除维护及故障排除6锥孔的清洗：将离子源温度降至室温,关闭隔离阀，旋开固定锥孔的两个螺丝，取出锥孔滴甲酸数滴，浸润几分钟，在甲醇：水（50：50）溶剂中超声清洗15分钟，此时切记：锥孔尖不能碰撞，否则损坏不能使用。（仪器灵敏度下降需及时清洗。）若锥孔太脏需用甲酸先超声清洗几分钟。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训维护及故障排除维护及故障排除7直接进样Loop环改装为液相流路切换阀,减少LC流分对MS 的污染 Quattro micro仪器面板六通阀除直接进样功能外，可改装为液相流路切换阀，A load位置从HPLC直接接废液瓶，B inject位置从HPLC直接接MS。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训维护及故障排除维护及故障排除直接进样Loop环改装为液相流路切换阀，MS method编辑中增加如下功能：option下选solvent delay2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训维护及故障排除维护及故障排除编辑solvent delay，选择start time/end time，勾选Enable Divert Valve，即0-5min，10-15min为HPLC组分直接流出至废液瓶的流路,减少无需检测的LC流分对MS 的污染。2005 Waters CorporationWaters 四极杆质谱培训常用备件号常用备件号ESI源可更换毛细管：7000003412695单向阀：WAT2709412695 inline filter：WAT084560EDWARD机械泵油（Q45）7000008700.005”Peek 管:6436005