沉淀法生物分离工程公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件.pptx

16 16 沉淀法沉淀法第1页第1页原料液原料液细胞分离细胞分离(离心，过滤离心，过滤)细胞胞内产物细胞胞内产物细胞破碎细胞破碎碎片分离碎片分离清液胞外产物清液胞外产物粗分离粗分离(沉淀沉淀/超出滤超出滤/萃取萃取)纯化纯化(层析、离子互换、吸附层析、离子互换、吸附)脱盐脱盐(凝胶过滤、超滤凝胶过滤、超滤)浓缩浓缩(超滤超滤)精制精制(结晶、干燥结晶、干燥)包括体包括体溶解溶解(加盐酸胍、脲加盐酸胍、脲)复性复性第2页第2页沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中溶解度沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中溶解度减少而形成无定形固体沉淀过程。减少而形成无定形固体沉淀过程。沉淀目的：沉淀目的：(浓缩；浓缩；(有选择地沉淀杂质或所需成份，初步纯化有选择地沉淀杂质或所需成份，初步纯化 ；(将已纯化产品由液态变成固态。将已纯化产品由液态变成固态。一一.概述概述第3页第3页(改变溶液理化参数，控制溶液中各种成份改变溶液理化参数，控制溶液中各种成份溶解度溶解度。(溶剂组分改变或加入一些沉淀剂以及改变溶剂组分改变或加入一些沉淀剂以及改变溶液溶液pHpH值、离子强度和极性都会使溶质溶值、离子强度和极性都会使溶质溶解度产生明显改变。解度产生明显改变。沉淀法原理：沉淀法原理：第4页第4页沉淀生成动力学沉淀生成动力学分子互相碰撞分子互相碰撞并产生汇集作用：并产生汇集作用：热运动；热运动；对流运动；对流运动；差示沉降。差示沉降。第5页第5页长处：操作简朴、经济、浓缩倍数高长处：操作简朴、经济、浓缩倍数高缺点：分离度不高、选择性不强，产品质缺点：分离度不高、选择性不强，产品质 量较差。量较差。第6页第6页二二.蛋白质溶解特性蛋白质溶解特性n部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水区。n亲水性氨基酸残基基本分布在外表面。亲水性氨基酸残基基本分布在外表面。n蛋白质表面由不均匀分布荷电基团形成荷电蛋白质表面由不均匀分布荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。区、亲水区和疏水区构成。第7页第7页第8页第8页三三.蛋白质胶体溶液稳定性蛋白质胶体溶液稳定性u蛋白质周围水化层。蛋白质周围水化层。u蛋白质蛋白质两性电解质两性电解质，分子间静电排斥作用分子间静电排斥作用第9页第9页四四.沉淀法分类沉淀法分类n所加入沉淀剂不同：n（1）盐析法；n（2）等电点沉淀法；n（3）有机溶剂沉淀法；n（4）非离子型聚合物沉淀法；n（5）聚电解质沉淀法；n（6）金属离子沉淀法；n（7）亲和沉淀法。第10页第10页(1)(1)盐析盐析概念：概念：概念：概念：在高浓度中性盐存在下，蛋白质（酶）等生在高浓度中性盐存在下，蛋白质（酶）等生在高浓度中性盐存在下，蛋白质（酶）等生在高浓度中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中溶解度减少，产生沉淀过物大分子物质在水溶液中溶解度减少，产生沉淀过物大分子物质在水溶液中溶解度减少，产生沉淀过物大分子物质在水溶液中溶解度减少，产生沉淀过程。程。程。程。盐析是可逆，而变性是不可逆盐析是可逆，而变性是不可逆第11页第11页盐析法机理盐析法机理（1 1）破坏水化膜，分子间易碰撞汇集）破坏水化膜，分子间易碰撞汇集。（2 2）中和电荷，减少静电斥力）中和电荷，减少静电斥力。第12页第12页第13页第13页盐析过程盐析过程（1 1）“盐溶盐溶”低盐浓度下，蛋白质溶解度增大低盐浓度下，蛋白质溶解度增大（2 2）“盐析盐析”现象现象高盐浓度下，蛋白质溶解度下降高盐浓度下，蛋白质溶解度下降 A.A.中和蛋白质表面电荷；中和蛋白质表面电荷；B.B.中性盐亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水中性盐亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水 区暴露；区暴露；第14页第14页盐析用盐选择盐析用盐选择规律：半径小高价离子盐析作用较强，半径大规律：半径小高价离子盐析作用较强，半径大低价离子作用较弱低价离子作用较弱阴离子盐析效果阴离子盐析效果 ：柠檬酸根柠檬酸根POPO4 43-3-SOSO4 42-2-CHCH3 3COOCOO-Cl Cl-NO NO3 3-SCNSCN-阳离子盐析效果：阳离子盐析效果：NHNH4 4+K K+NaNa+阴离子影响不小于阳离子阴离子影响不小于阳离子第15页第15页惯用盐：惯用盐：硫酸铵硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠n（1 1）价廉）价廉 ；n（2 2）溶解度大，温度系数小；）溶解度大，温度系数小；n（3 3）不易引起蛋白质变性。）不易引起蛋白质变性。盐析用盐选择盐析用盐选择缺点：缺点：（1 1）水解变酸，腐蚀；）水解变酸，腐蚀；（2 2）高）高pH pH 释氨；释氨；（3 3）残留产品有影响。）残留产品有影响。第16页第16页盐析操作盐析操作(加盐方式）加盐方式）1 1）加入固体盐法）加入固体盐法 2 2）加入饱和溶液法）加入饱和溶液法3 3）透析平衡法）透析平衡法第17页第17页盐析用盐量拟定-饱和度：uu饱和度（饱和度（饱和度（饱和度（SaturationSaturationSaturationSaturation）以硫酸铵为例：以硫酸铵为例：以硫酸铵为例：以硫酸铵为例：252525250 0 0 0C C C C时，硫酸铵饱和溶解度是时，硫酸铵饱和溶解度是时，硫酸铵饱和溶解度是时，硫酸铵饱和溶解度是767g/L767g/L767g/L767g/L定义为定义为定义为定义为100%100%100%100%饱和度饱和度饱和度饱和度u目的蛋白质盐析沉淀操作之前，所需硫酸铵浓目的蛋白质盐析沉淀操作之前，所需硫酸铵浓度或饱和浓度可通过试验拟定。度或饱和浓度可通过试验拟定。u对多数蛋白质，当达到对多数蛋白质，当达到85%85%饱和度时，溶解度饱和度时，溶解度都小于都小于 0.l mg 0.l mgL L，通常为兼顾收率与纯度，通常为兼顾收率与纯度，饱和度操作范围在饱和度操作范围在40%-60%40%-60%之间。之间。第18页第18页硫酸铵盐析过程硫酸铵盐析过程最适饱和度是最适饱和度是30%30%，55%55%204060800100总蛋白总蛋白目的蛋白质目的蛋白质上清液蛋白浓度上清液蛋白浓度不同蛋白质溶解度不同，沉淀时所需离子强度也不相同。改变盐浓度，将混合液中蛋白质分批盐析分开。分段盐析分段盐析(fractional salting out)(fractional salting out)第19页第19页PH两种蛋白质相对溶两种蛋白质相对溶解度随解度随pHpH而改变很大而改变很大lgS盐析影响原因：盐析影响原因：pHpH值值在等电点时蛋白质溶在等电点时蛋白质溶解度最小解度最小第20页第20页盐析注意事项盐析注意事项(选择适宜饱和度选择适宜饱和度(采用分步盐析采用分步盐析(盐析成败决定于溶液盐析成败决定于溶液pHpH值与离子强度，稳定值与离子强度，稳定pHpH用磷用磷酸缓冲液酸缓冲液(在加入盐时应当缓慢均匀在加入盐时应当缓慢均匀(盐析后最好缓慢搅拌一个小时并且在冰浴中放置一盐析后最好缓慢搅拌一个小时并且在冰浴中放置一段时间。段时间。(脱盐处理后再测酶活性。脱盐处理后再测酶活性。(盐析后蛋白质最好尽快脱盐处理盐析后蛋白质最好尽快脱盐处理第21页第21页盐析注意事项盐析注意事项硫酸铵使用硫酸铵使用硫酸铵中常含有少许重金属离子，使用前用硫酸铵中常含有少许重金属离子，使用前用H H2 2S S处理处理高浓度硫酸铵溶液普通呈酸性（高浓度硫酸铵溶液普通呈酸性（PH=5.0PH=5.0左右），左右），使用前用氨水调整至所需使用前用氨水调整至所需PHPH。硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意第22页第22页盐析法特点：盐析法特点：1.成本低。成本低。2.操作简朴、安全。操作简朴、安全。3.不会引起蛋白质变性。不会引起蛋白质变性。4.分离效果不抱负，初步分离纯化。分离效果不抱负，初步分离纯化。第23页第23页(2)(2)等电点沉淀法等电点沉淀法调调pHpH至等电点，蛋白质至等电点，蛋白质所带净电荷为零，减少所带净电荷为零，减少了静电斥力，而疏水力了静电斥力，而疏水力能使分子间互相吸引，能使分子间互相吸引，形成沉淀操作称为等电形成沉淀操作称为等电点沉淀点沉淀第24页第24页等电点沉淀法注意事项等电点沉淀法注意事项F适合用于憎水性较强蛋白质；适合用于憎水性较强蛋白质；F往往不能取得高回收率；往往不能取得高回收率；往往不能取得高回收率；往往不能取得高回收率；F在调整等电点时，预防酶失活或蛋白变性。在调整等电点时，预防酶失活或蛋白变性。第25页第25页l l概概概概念念念念：在在在在含含含含有有有有溶溶溶溶质质质质水水水水溶溶溶溶液液液液中中中中加加加加入入入入一一一一定定定定量量量量亲亲亲亲水水水水有有有有机机机机溶剂，减少溶质溶解度，使其沉淀析出。溶剂，减少溶质溶解度，使其沉淀析出。溶剂，减少溶质溶解度，使其沉淀析出。溶剂，减少溶质溶解度，使其沉淀析出。l长处：长处：1 1）分辨能力比盐析法高；）分辨能力比盐析法高；2 2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；l缺点：缺点：1 1）易引起变性失活；）易引起变性失活；2 2）操作要求在低温下进行；）操作要求在低温下进行；3 3）成本高）成本高(3)(3)有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法第26页第26页有机溶剂沉淀法机理有机溶剂沉淀法机理 *A 减少溶剂介电常数减少溶剂介电常数（介电常数（介电常数D有机有机 D水）；水）；*B 破坏水化膜；破坏水化膜；*C 疏水作用力；疏水作用力；第27页第27页惯用有机溶剂沉析剂惯用有机溶剂沉析剂选择依据：选择依据：n水溶性要好水溶性要好n介电常数要小介电常数要小n致变性作用要小（致变性作用要小（甲醇甲醇）n毒性要小、挥发性适中毒性要小、挥发性适中n容易获取容易获取第28页第28页1 1、温度、温度 低温操作，低温操作，须预先冷却到须预先冷却到-10-10-20-20；2 2、pHpH值值 蛋白质等电点附近。蛋白质等电点附近。3 3、样品浓度、样品浓度 初浓度以初浓度以0.50.52 2为好。为好。4 4、中性盐浓度、中性盐浓度有机溶剂沉淀法影响原因有机溶剂沉淀法影响原因第29页第29页(4)(4)非离子型聚合物非离子型聚合物聚聚乙乙二二醇醇等等非非离离子子性性聚聚合合物物减减少少蛋蛋白白质质溶溶解解度度，有有选选择性沉淀蛋白质。择性沉淀蛋白质。机理：机理：能减少水活度，破坏蛋白质水化膜。能减少水活度，破坏蛋白质水化膜。长处：长处：1.1.室温室温 2.2.沉淀颗粒大，易于搜集沉淀颗粒大，易于搜集 3.3.提升蛋白质稳定性提升蛋白质稳定性 缺点：缺点：PEG PEG 难清除难清除第30页第30页(5)(5)聚电解质沉淀聚电解质沉淀 机理：机理：架桥与静电架桥与静电n离子型多糖聚合物离子型多糖聚合物n合成聚合物：合成聚合物：n聚丙烯酸聚丙烯酸（pH 2.8 90%pH 2.8 90%蛋白沉淀）蛋白沉淀）n聚苯乙烯季胺盐聚苯乙烯季胺盐（pH 10.4,95%pH 10.4,95%蛋白沉淀）蛋白沉淀）n聚甲基丙烯酸聚甲基丙烯酸n聚乙烯亚胺聚乙烯亚胺第31页第31页（6 6）金属离子沉淀）金属离子沉淀与蛋白质分子中特殊部位起反应造成与蛋白质分子中特殊部位起反应造成分三类：分三类：与与羧羧基基、氨氨基基等等含含氮氮化化合合物物以以及及含含氮氮杂杂环环化化合合物物强强烈结合一些金属离子，如：烈结合一些金属离子，如：MnMn2+2+、ZnZn2+2+;与与羧羧酸酸结结合合而而不不与与含含氮氮化化合合物物结结合合一一些些金金属属离离子子，如：如：CaCa2+2+、Ba Ba2+2+、Mg Mg2+2+、Pb Pb2+2+;与与巯巯基基化化合合物物强强烈烈结结合合一一些些金金属属离离子子，如如：g g2+2+、AgAg2+2+、Pb Pb2+2+。第32页第32页(7)(7)亲和沉淀亲和沉淀u利用蛋白质与特定生物合成份子（免疫配位体、利用蛋白质与特定生物合成份子（免疫配位体、基质、辅酶等）之间高度专一互相作用基质、辅酶等）之间高度专一互相作用u其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度差别，而是其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度差别，而是依据依据“吸附吸附”有特殊蛋白质聚合物溶解度大小。有特殊蛋白质聚合物溶解度大小。u从复杂混合物中分离提取单一产品从复杂混合物中分离提取单一产品第33页第33页各种沉淀办法应用范围各种沉淀办法应用范围盐析法：盐析法：各种蛋白质和酶分离纯化。各种蛋白质和酶分离纯化。有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法：生物小分子、多糖及核酸产品分离：生物小分子、多糖及核酸产品分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。纯化，有时也用于蛋白质沉淀。等电点沉淀法等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质等两性物质沉淀用于氨基酸、蛋白质等两性物质沉淀。但单独应用较少，多与其它办法结合使用。但单独应用较少，多与其它办法结合使用。非离子多聚体沉淀法：非离子多聚体沉淀法：用于分离生物大分子。用于分离生物大分子。聚电解质沉淀法聚电解质沉淀法：各种化合物：各种化合物金属离子沉淀：金属离子沉淀：用于各种化合物，尤其是小分子物质用于各种化合物，尤其是小分子物质沉淀。沉淀。第34页第34页