疟原虫血片制作方法.pptx

血片制作染色与疟原虫计数血片制作染色与疟原虫计数血膜制作血膜制作用于检验疟原虫血涂片有两种：一个是将血液涂呈用于检验疟原虫血涂片有两种：一个是将血液涂呈薄膜状，称薄膜状，称薄薄血膜；一个是血液涂成圆盘，称；一个是血液涂成圆盘，称厚血膜。薄血膜上血细胞要求平辅在玻片上面。薄血膜上血细胞要求平辅在玻片上面。发烧病人血片发烧病人血片标本片标本片疟原虫血片制作方法第1页 血膜制作（取血时间）血膜制作（取血时间）n取取血血时时机机 现现症症病病人人普普通通可可随随时时取取血血，疟疟疾疾普普查查时时可可不不考考虑虑取取血血时时机机。但但在在诊诊疗疗或或需需要要某某期期疟原虫作标本时，则应掌握适宜取血时机。疟原虫作标本时，则应掌握适宜取血时机。间间日日疟疟在在寒寒热热发发作作时时，外外周周血血液液中中主主要要可可见见环环状状体体期期；发发作作后后数数小小时时，环环状状体体发发育育到到滋滋养养体体期期，疟疟色色素素形形成成，形形态态较较易易辩辩认认，为为诊诊疗疗有有利利时时机机；3648小小时时，可可检检出出裂裂殖殖体体；发发作作一一、二次后，配子体出现较多。二次后，配子体出现较多。n恶恶性性疟疟较较理理想想取取血血时时间间是是在在发发作作后后至至20小小时时内取血，初发患者退热后常查不到原虫。内取血，初发患者退热后常查不到原虫。疟原虫血片制作方法第2页 血膜制作（取血操作）血膜制作（取血操作）n取血方法取血方法 采血部位普通人为耳垂，指头，采血部位普通人为耳垂，指头，通常在耳垂取血（现场取血提议用大头针通常在耳垂取血（现场取血提议用大头针采血，一人一针，防止血传疾病）。先用采血，一人一针，防止血传疾病）。先用75%酒精棉球消毒取血部位（冬季用手酒精棉球消毒取血部位（冬季用手捻动耳垂使其充血后再行消毒），待酒精捻动耳垂使其充血后再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方，干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方，右手持消毒针快速刺入耳垂下端右手持消毒针快速刺入耳垂下端12毫米，毫米，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向挤压出血。挤压出血。疟原虫血片制作方法第3页 取血量及涂片法（涂片操作）取血量及涂片法（涂片操作）n薄薄血血膜膜 取取洁洁净净载载玻玻片片2张张，1张张平平置置在在桌桌上上，以以左左手手拇拇指指，食食指指夹夹持持载载玻玻片片两两端端（手手指指切切勿勿接接触触玻玻片片表表面面），用用另另一一张张边边缘缘平平滑滑（最最好好为为磨磨口口边边缘缘）载载玻玻片片做做推推片片，用用推推片片一一端端边边缘缘中中点点从从取取血血部部分分取取约约1微微升升血血量量（相相当当于于1/4火火柴柴头头大大小小），使使血血滴滴与与平平置置载载玻玻片片接接触触，并并形形成成2530度度夹夹角角，待待血血液液向向两两侧侧扩扩展展约约2厘厘米米长长度度时时，均均匀匀而而快快速速地地轻轻轻轻向向左左推推出出（约（约2.5厘米长）。厘米长）。疟原虫血片制作方法第4页（涂片操作）（涂片操作）厚血膜厚血膜 用推片一角，从取血部位刮取约用推片一角，从取血部位刮取约4微升血量微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置载玻片接触，（相当于火柴头大小），使血滴与平置载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转再由里向外一个方向旋转，转24圈，涂成直径圈，涂成直径0.81厘米大小圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚厘米大小圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率要求。易于脱落，过薄达不到检出率要求。疟原虫血片制作方法第5页血膜制作血膜制作（涂片操作）（涂片操作）n涂涂制制厚厚、薄薄血血膜膜位位置置 通通常常是是将将厚厚、薄薄血血膜膜涂涂在在一一张张载载片片上上。方方法法是是将将载载片片分分为为6等等分分，第第1、2格格备备贴贴标标签签及及编编号号用用；厚厚血血膜膜涂涂在在第第3格格中中央央，薄薄血血膜膜涂涂在在第第4格格前前缘缘至至第第6格格中中部部。作作为为标标本本血血片片每每张张玻玻片片涂涂厚厚、薄薄血血膜膜各各1个个；门门诊诊和和发发烧病人血片每片烧病人血片每片1人，涂人，涂 涂涂2个厚血膜个厚血膜1个薄血膜，个薄血膜，以以 防血膜脱落而影响检验防血膜脱落而影响检验；疟疾调查时，每张玻片疟疾调查时，每张玻片 可涂制可涂制23人血膜。人血膜。标本片发烧病人血片标签标签疟原虫血片制作方法第6页血膜制作血膜制作n血膜编号血膜编号 血膜制成后，马上用特种血膜制成后，马上用特种蜡笔或水笔于玻片面上写上受检者号蜡笔或水笔于玻片面上写上受检者号码，以防差错，待薄血膜干后再用铅码，以防差错，待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜中写上血片种类代号和受笔于薄血膜中写上血片种类代号和受检者个人编号，依次次序插入标本盒检者个人编号，依次次序插入标本盒内。内。疟原虫血片制作方法第7页 制作制作血膜血膜注意事项注意事项 1.玻片清洗时，防止玻片碰撞、磨损。制作血膜载玻片必须完全清洁而毫无油渍或污垢。制片时，手指只能持载片边缘，不能接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。作为推片玻片边缘一定要平滑，才能使推出血膜均匀一致。疟原虫血片制作方法第8页制作制作血膜血膜注意事项注意事项n 2.刚刚涂涂制制血血膜膜要要平平放放在在标标本本盒盒内内，厚厚血血膜膜未未干干前前勿勿使使标标本本盒盒倾倾斜斜，以以免免血血膜膜倾倾向向一一侧侧，造造成成血血膜膜厚厚薄薄不不均均，厚厚处处不不一一溶溶血血和和着着色色而而影影响响检检验验结结果果；晾晾干干血血膜膜时时应应注注意意防防尘尘、预预防防苍苍蝇蝇、蟑蟑螂螂等等昆昆虫虫吮吮吸吸血血膜膜，干干后后应应及及时时装装入入标标本本盒盒并并盖盖严严，新新木木制制标标本本盒盒需需敞敞开开放放置置一一段段时时间间，让让木木醇醇挥挥发发后后才才能能使使用用，以以免免厚厚血血膜膜红红蛋蛋白白被被其固定，不能溶血或染色效果不佳。其固定，不能溶血或染色效果不佳。疟原虫血片制作方法第9页制作制作血膜血膜注意事项注意事项n 3.血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能夏天标本尽可能2448小时内固定染色；小时内固定染色；冬天也不能超出冬天也不能超出72小时。放置时间越久，小时。放置时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差。若厚血膜越不易脱血，染色效果也差。若不能及时染色，膜血膜宜先用甲醇固定不能及时染色，膜血膜宜先用甲醇固定（13分钟）然后用过滤清水对厚血膜分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干固定后装入盒内盖严，待以溶血，晾干固定后装入盒内盖严，待以后染色。后染色。疟原虫血片制作方法第10页血片染色血片染色（一）染液种类及染色原理（一）染液种类及染色原理染液种类染液种类：当前所用血片染色液，即使名称很当前所用血片染色液，即使名称很多，但都是从罗门诺夫斯基氏创造染液改变多，但都是从罗门诺夫斯基氏创造染液改变过来。总可分为水溶液和酒精溶液两大类，过来。总可分为水溶液和酒精溶液两大类，前者包含罗氏、西氏（前者包含罗氏、西氏（Simon)、J.S.B氏染氏染液等，后者包含利氏液等，后者包含利氏(Leishman)、瑞氏和吉氏瑞氏和吉氏染液等。这些染液中主要染剂都包含美兰、染液等。这些染液中主要染剂都包含美兰、伊红和由美兰氧化所成天青，所以称多色性伊红和由美兰氧化所成天青，所以称多色性染剂。染剂。疟原虫血片制作方法第11页血片染色血片染色（一）染液种类及染色原理（一）染液种类及染色原理染色原理：染色原理：伊红是伊红是酸性酸性水溶性钠盐，美兰是水溶性钠盐，美兰是碱性碱性水溶性盐酸盐，当它们各自溶化水中时，就离水溶性盐酸盐，当它们各自溶化水中时，就离解为带阳电和阴电离子。伊红主要离解为酸性解为带阳电和阴电离子。伊红主要离解为酸性阳离子，在碰到碱性蛋白质如血红蛋白、嗜伊阳离子，在碰到碱性蛋白质如血红蛋白、嗜伊红白血球颗粒等即可结合成不易溶于水沈淀物红白血球颗粒等即可结合成不易溶于水沈淀物染成红色。美兰主要离解为碱性美兰离子，美染成红色。美兰主要离解为碱性美兰离子，美兰就与疟原虫、淋巴和大单核细胞胞浆、嗜碱兰就与疟原虫、淋巴和大单核细胞胞浆、嗜碱性白细胞颗粒等酸性蛋白质结合染成兰色。性白细胞颗粒等酸性蛋白质结合染成兰色。疟原虫血片制作方法第12页血片染色血片染色（一）染液种类及染色原理（一）染液种类及染色原理染色原理染色原理：美兰与伊红都不能使原虫和白细胞：美兰与伊红都不能使原虫和白细胞核着色，必须由天青作为媒介（染媒）才能核着色，必须由天青作为媒介（染媒）才能使其着色。天青即使也是碱性染剂，但又含使其着色。天青即使也是碱性染剂，但又含有染媒作用，使原虫核和白细胞核等原来只有染媒作用，使原虫核和白细胞核等原来只能染上极淡兰色结构染上显著酸性染剂伊红，能染上极淡兰色结构染上显著酸性染剂伊红，这么，就使白细胞粗大核染成显著既兰又红这么，就使白细胞粗大核染成显著既兰又红紫兰色，而较小或菲薄原虫核和淋巴细胞原紫兰色，而较小或菲薄原虫核和淋巴细胞原浆中颗粒染成紫红色。浆中颗粒染成紫红色。疟原虫血片制作方法第13页血片染色血片染色（一）染液种类及染色原理（一）染液种类及染色原理注意注意：蛋白质是：蛋白质是二性二性电解质，当其处于较电解质，当其处于较等电点等电点为酸溶液中时，为酸溶液中时，便呈硷作用，即与酸或阴离子结合，这就说明为何在染液偏酸便呈硷作用，即与酸或阴离子结合，这就说明为何在染液偏酸时，伊红着色力强，使红细胞着色鲜艳而淋巴细胞和原虫胞浆时，伊红着色力强，使红细胞着色鲜艳而淋巴细胞和原虫胞浆着色不著；反之，蛋白质在偏硷溶液中呈酸作用而中和硷基，着色不著；反之，蛋白质在偏硷溶液中呈酸作用而中和硷基，也就说明为何染液偏硷时，红细胞和嗜伊红白细胞颗粒等被染也就说明为何染液偏硷时，红细胞和嗜伊红白细胞颗粒等被染成紫兰色。成紫兰色。伊红在水溶液内碰到美兰或天青，即可相互化合而产生沈伊红在水溶液内碰到美兰或天青，即可相互化合而产生沈淀从而失去染色力，所以，吉氏母液绝对不能进水。淀从而失去染色力，所以，吉氏母液绝对不能进水。疟原虫血片制作方法第14页血片染色血片染色（二）吉氏染液母液配置方法（二）吉氏染液母液配置方法 取吉氏粉取吉氏粉0.5克置于研钵中，克置于研钵中，加少许甘油充分研磨，再加再磨，加少许甘油充分研磨，再加再磨，至至25毫升加完为止，倒入毫升加完为止，倒入60或或100毫升带有玻塞有色玻瓶中。毫升带有玻塞有色玻瓶中。在研钵中加少许甲醇，洗去甘油在研钵中加少许甲醇，洗去甘油浓液混入瓶内，至浓液混入瓶内，至25毫升甲醇毫升甲醇洗净钵中甘油染液为止，塞紧瓶洗净钵中甘油染液为止，塞紧瓶塞，充分摇匀，置于塞，充分摇匀，置于5560水浴中或温箱内水浴中或温箱内24小时或室温小时或室温内内35天，多加摇动，即成原天，多加摇动，即成原液。吉氏染液是当前较优良血膜液。吉氏染液是当前较优良血膜染剂，即使在酷热天气中，亦可染剂，即使在酷热天气中，亦可经久不变。经久不变。材料：材料：1、吉氏粉、吉氏粉0.5克克 2、甘油、甘油25毫升毫升 3、甲醇、甲醇25毫升毫升疟原虫血片制作方法第15页血片染色血片染色（三）吉氏染液血片染色方法（三）吉氏染液血片染色方法 先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干后进行先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干后进行染色。亦可在固定薄血膜后用清水对厚血膜溶脱血红染色。亦可在固定薄血膜后用清水对厚血膜溶脱血红蛋白，然后才进行染色。蛋白，然后才进行染色。成批血片染色成批血片染色：将已固定薄血膜血片插入染色：将已固定薄血膜血片插入染色缸，倒入缸，倒入2%吉氏染液稀释液（吉氏染液稀释液（2毫升原液加中性蒸毫升原液加中性蒸馏水馏水98毫升稀释均匀即成），同时对厚薄血膜染色毫升稀释均匀即成），同时对厚薄血膜染色30分钟（如染液不合标按时，得酌情增减染色时间）分钟（如染液不合标按时，得酌情增减染色时间），然后用清水轻轻将染液冲去，再用清水轻轻冲洗一，然后用清水轻轻将染液冲去，再用清水轻轻冲洗一次，洁净后将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上，次，洁净后将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上，待干镜检。待干镜检。疟原虫血片制作方法第16页血片染色血片染色（三）吉氏染液血片染色方法（三）吉氏染液血片染色方法 先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干后进行染色。亦可在固定薄血膜后用清水对厚后进行染色。亦可在固定薄血膜后用清水对厚血膜溶脱血红蛋白，然后才进行染色。血膜溶脱血红蛋白，然后才进行染色。单张血片染色单张血片染色：薄血膜经固定干燥后，：薄血膜经固定干燥后，用用2%吉氏染液稀释液吉氏染液稀释液12毫升，滴入血片标毫升，滴入血片标本上染色本上染色30分钟左右，或用中性蒸馏水分钟左右，或用中性蒸馏水1毫升，毫升，加吉氏母液加吉氏母液12滴，混合均匀后滴入血片标滴，混合均匀后滴入血片标本上，染色本上，染色1020分钟，然后用清水轻轻将分钟，然后用清水轻轻将片上染液冲洗洁净，晾干镜检。片上染液冲洗洁净，晾干镜检。疟原虫血片制作方法第17页影响染色效果原因影响染色效果原因n血血片片染染色色好好坏坏除除了了与与玻玻片片是是否否清清洁洁，血血片片制制作作质质量量好好坏坏等等相相关关外外，还还受受到到以以下下几几个个原因影响：原因影响：n（1）染染料料溶溶剂剂质质量量 染染料料、甲甲醇醇和和甘甘油油假假如如不不纯纯，常常使使配配制制染染液液偏偏酸酸或或偏偏碱碱而而影影响响染染色色效效果果。所所以以必必须须用用分分析析纯纯甲甲醇醇和和中中性性甘甘油油，而而且且在在配配制制时时所所用用器器具具必必须须洁洁净净而而无水份。无水份。疟原虫血片制作方法第18页影响染色效果原因影响染色效果原因n（2）染染液液新新旧旧 新新配配制制染染液液因因色色素素还还未未充充分分溶溶解解，染染色色力力较较弱弱且且常常展展现现偏偏碱碱性性。染染液液存存放放时时间间越越久久，染染色色力力越越强强。通通常常在在染染液液配配制制12周周后后才才使使用用，盛盛装装染染液液瓶瓶子子应应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。疟原虫血片制作方法第19页影响染色效果原因影响染色效果原因n（3）染染液液稀稀释释后后使使用用时时间间 吉吉氏氏和和瑞瑞氏氏染染液液主主要要成成份份是是美美蓝蓝、伊伊红红和和由由美美蓝蓝氧氧化化产产生生天天青青，三三者者能能在在酒酒精精溶溶液液中中溶溶解解，但但在在水水溶溶液液中中伊伊红红碰碰到到美美蓝蓝和和天天青青即即产产生生沉沉淀淀。所所以以，必必须须在在稀稀释释染染液液当当初初使使用用，普普通通在在半小时内半小时内染色力最强。染色力最强。疟原虫血片制作方法第20页影响染色效果原因影响染色效果原因n（4）染液稀释浓度）染液稀释浓度 染液浓度高其着色就染液浓度高其着色就快而深，从而疟原虫寄生红细胞薛氏点粗快而深，从而疟原虫寄生红细胞薛氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度过低则大显著，但颜色常偏碱；染液浓度过低则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不显著或染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不显著或消失。消失。疟原虫血片制作方法第21页影响染色效果原因影响染色效果原因n（5）染色时间）染色时间 染色时间长染色效果好，染色时间长染色效果好，反之较差。室温高则着色快，染色时间可反之较差。室温高则着色快，染色时间可略缩短，气温低可适当延长。所以染色时略缩短，气温低可适当延长。所以染色时间应依据染液质量、新旧、稀释浓度和气间应依据染液质量、新旧、稀释浓度和气温而适当增减。温而适当增减。疟原虫血片制作方法第22页影响染色效果原因影响染色效果原因n（6）染色用水）染色用水 染液稀释用水和染色后冲洗用水染液稀释用水和染色后冲洗用水应选择应选择Ph7.07.2清洁水，通常使用新鲜蒸馏水清洁水，通常使用新鲜蒸馏水或过滤冷开水，以及自来水、井水、河水、泉水或过滤冷开水，以及自来水、井水、河水、泉水和雨水等。假如偏酸或偏碱，可用缓冲蒸馏水调和雨水等。假如偏酸或偏碱，可用缓冲蒸馏水调整。染色后发觉血膜颜色偏蓝（偏碱）或偏红整。染色后发觉血膜颜色偏蓝（偏碱）或偏红（偏酸）时，可用与之相反酸、碱度水冲洗血片（偏酸）时，可用与之相反酸、碱度水冲洗血片给予纠正。给予纠正。疟原虫血片制作方法第23页影响染色效果原因影响染色效果原因n（7）染染色色后后不不要要直直接接将将染染液液倒倒掉掉，应应沿沿玻玻片片或或染染色色缸缸边边缘缘加加水水使使染染液液表表面面一一层层溢溢出出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。疟原虫血片制作方法第24页显微镜普通结构显微镜普通结构1.镜座 9.粗调整器 17.滤光镜圈 2.镜柱 10.细调整器 18.反光镜3.镜臂 11.齿板4.倾斜度关节 12.镜台5.镜筒 13.推进器6.接目镜 14.弹簧夹7.旋转盘 15.聚光器8.接物镜 16.虹彩疟原虫血片制作方法第25页血片镜检血片镜检1.在学习镜检疟原虫之前，必须先对正常厚薄血膜中各在学习镜检疟原虫之前，必须先对正常厚薄血膜中各种血细胞形态、内部结构和染色性质加以识别。种血细胞形态、内部结构和染色性质加以识别。2.学习镜检疟原虫，首先要学看薄血膜，在基本上掌握学习镜检疟原虫，首先要学看薄血膜，在基本上掌握薄血膜中疟原虫形态后，才学习镜检厚血膜。薄血膜中疟原虫形态后，才学习镜检厚血膜。3.镜检疟原虫普通只查厚血膜，薄血膜仅作为原虫分类镜检疟原虫普通只查厚血膜，薄血膜仅作为原虫分类时参考和血片编号之用。时参考和血片编号之用。4.镜检疟原虫必须用油镜头配合镜检疟原虫必须用油镜头配合5X低倍目镜镜检，当低倍目镜镜检，当发觉疑难问题时可调换发觉疑难问题时可调换10X目镜进行观察。目镜进行观察。5.检验时应从厚血膜上缘开始，使血膜从上而下，自左检验时应从厚血膜上缘开始，使血膜从上而下，自左至右，由右至左，一行接一行，一个视野稍叠一个视至右，由右至左，一行接一行，一个视野稍叠一个视野次序地查完整个血膜。野次序地查完整个血膜。疟原虫血片制作方法第26页疟原虫计数法疟原虫计数法厚血膜疟原虫镜检厚血膜疟原虫镜检“记号记号”法法：全全血血膜膜发发觉觉同同种种、同同期期疟疟原原虫虫数数在在10个个以以内内均均记记实实际际数数，10个个以以上上但但还还不不到到平平均均每每个个视视野野一一个个虫虫登记登记“少少”。如。如P.V.T少S3.G1，P.f.R少G2。平平均均每每个个视视野野同同种种、同同期期疟疟原原虫虫数数在在15个个时时记记“”如如pfR+，610个个以以上上时时记记“”如如p.f.R+，10100个个时时记记“+”，100个个以以上上时时记记“”，如，如p.V.R+G+,p.f.R+。疟原虫血片制作方法第27页