牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺.pptx

中国医药生物技术学会质量控制专业委员会第三届动物血清生产与管理学术研讨会牛血清病毒安全检测与病毒灭活工艺Viral Safety Detection and Viral Removal/Inactivation of Bovine Serum 章金刚军事医学科学院输血医学研究所国家生物医学分析中心病毒安全检测试验室北京 10085009月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第1页牛血清主要性与生物药品病毒安全性牛病原与病毒安全性关注重点欧盟对牛血清病毒检测要求病毒分类与牛一些病毒牛血清病毒安全检测技术血清病毒去除/灭活工艺病毒安全试验室部分研究工作09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第2页在人用和动物用疫苗制备过程中，牛血清是最为主要细胞培养添加物。鉴于世界卫生组织（WHO）提倡疫苗生产细胞基质从动物使用转换为细胞培养，牛血清应用会得到深入扩大。能够认为，假如没有充分牛血清供给，许多医药产品生产和供给均将受到极大影响。牛血清主要性与生物药品病毒安全性09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第3页WHO和各国管理当局、行业协会等高度关注医药产品生产使用细胞基质安全问题，尤其是潜在病毒污染问题。疫苗病毒安全性可能污染路径：活疫苗种毒污染，制备工艺中原、敷料污染和其它需要考虑问题。其中，牛血清质量控制与病毒安全检测最受关注。牛血清主要性与生物药品病毒安全性09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第4页牛血清主要性与生物药品病毒安全性牛病原与病毒安全性关注重点欧盟对牛血清病毒检测要求病毒分类与牛一些病毒牛血清病毒安全检测技术血清病毒去除/灭活工艺病毒安全试验室部分研究工作09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第5页细菌性疾病：结核杆菌病、布鲁氏杆菌病、沙门氏菌病、炭疽病毒性疾病：口蹄疫、传染性海绵样脑病、白血病、蓝舌病.寄生虫性疾病：日本分体吸虫病、弓形体病牛感染性疾病09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第6页消除牛源病原体技术09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第7页DNA病毒牛乳头状瘤病毒（bovine papillomaviruses,BPV）牛多型瘤病毒（bovine polyomaviruses,BPyV）腺病毒（Adenoviruses）疱疹病毒（Herpesviruses）牛痘病毒（Poxviruses）细小病毒（Parvovirus）等牛能够感染病毒09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第8页RNA病毒口蹄疫病毒（FMDV）牛病毒性腹泻病毒（BVDV）轮状病毒（Rotavirus）呼肠孤病毒（Reovirus）牛白血病病毒（BLV）牛免疫缺点病病毒（BIV）蓝舌病病毒（BTV）牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）狂犬病病毒（RV）等倍受关注朊病毒牛海绵状脑病(Bovine spongiform encephalpopathy,BSE)因子。牛能够感染病毒09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第9页值得关注对象潜在性感染病毒：（1）隐性感染而不引发任何疾病病毒；（2）一些连续性感染病毒；（3）处于潜伏状态病毒。因为机体生理状态（如怀孕）、外界环境改变，机体抵抗力下降等原因，这类病毒可能大量增殖或引发疾病发生。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第10页关注对象内源性病毒：内源性反转录病毒（ERV）是指以前病毒DNA形式整合进宿主细胞基因组中，并随细胞染色体复制而复制反转录病毒。朊病毒：朊病毒是亚病毒中主要感染因子，侵害动物与人类。因其主要由蛋白质组成，迄今尚无含有核酸确实切证据，故暂定名为朊病毒(Virino)或蛋白侵染子(Prion)。因为对各种朊病毒本质了解不够，采取“因子”命名，比如痒疫因子和牛海绵状脑病因子等，似乎较为恰当。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第11页重点关注两大类病毒应该考虑生物安全性病毒集中在两个方面：人兽共患病病毒与致癌、免疫抑制或严重退行疾病相关病毒09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第12页牛血清主要性与生物药品病毒安全性牛病原与病毒安全性关注重点欧盟对牛血清病毒检测要求病毒分类与牛一些病毒牛血清病毒安全检测技术血清病毒去除/灭活工艺病毒安全试验室部分研究工作09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第13页09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第14页09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第15页09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第16页09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第17页09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第18页09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第19页牛血清主要性与生物药品病毒安全性牛病原与病毒安全性关注重点欧盟对牛血清病毒检测要求病毒分类与牛一些病毒牛血清病毒安全检测技术血清病毒去除/灭活工艺病毒安全试验室部分研究工作09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第20页三 牛源制品病毒安全性脊椎动物病毒形态DNA病毒09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第21页脊椎动物病毒形态RNA病毒09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第22页DNA病毒牛乳头状瘤病毒牛乳头状瘤病毒（bovine papillomaviruses,BPV）分类地位：乳多空病毒科，乳头状瘤病毒属形态特征：无囊膜，55nm理化特征：对酸、碱、有机溶剂有抵抗A model of the papillomavirus capsid 09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第23页DNA病毒牛乳头状瘤病毒依据交叉杂交试验，能够感染牛乳瘤病毒分为6个主要亚群，每一个病毒在牛皮肤产生特定病变。一些亚群能够转化人细胞，这些病毒与牛消化道、生殖道和眼部肿瘤等发展相关。不能用细胞感染检测，可用PCR检测。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第24页DNA病毒牛多型瘤病毒牛多型瘤病毒（bovine polyomaviruses,BPyV）分类地位：乳多空病毒科，多型瘤病毒属形态特征：无囊膜，45nm理化特征：对酸、碱、有机溶剂有抵抗PCR检测，BPyV在胎牛血清中污染批次达70，可从一些批次血清中分离到病毒。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第25页DNA病毒牛多型瘤病毒BPyV倍受关注，它可能是一个人兽共患病，喂养人员、兽医体内有较高水平抗体，而对大多数人群则缺乏抵抗力。能够感染灵长类细胞，包含人细胞。影响细胞培养结果。检测：能用细胞感染检测，在猴肾细胞能够产生特异性病变，即胞浆、胞核空泡化。PCR检测，使用特异性引物扩增、杂交或测序。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第26页DNA病毒牛腺病毒牛腺病毒（Adenoviruses）分类地位：腺病毒科，哺乳动物腺病毒属形态特征：无囊膜，90nm理化特征：对酸、碱、有机溶剂有抵抗分2个主要亚群，10个血清型。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第27页DNA病毒牛腺病毒尚不清楚是否人兽共患，但能够转化人细胞。能用细胞感染检测，1群感染牛胚肾细胞并快速产生细胞病变，2群感染牛睾丸细胞，有时需要盲传。也可用PCR检测。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第28页DNA病毒牛疱疹病毒牛疱疹病毒（Herpesviruses）：有囊膜，150nm，有4个种。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第29页DNA病毒牛疱疹病毒BHV-1:引发牛鼻气管炎，牛源制品应该检测病毒。能用细胞感染检测，也可用PCR检测。BHV-2:引发牛溃疡性乳头炎，奶制品污染。BHV-3:引发牛恶性卡他热，含有异源宿主感染性。BHV-5:引发牛脑炎。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第30页DNA病毒牛痘病毒牛痘病毒（Poxviruses）：有囊膜，300nm，有2个种病毒必须考虑。假牛痘病毒牛丘疹性口炎病毒Orf virus09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第31页DNA病毒牛痘病毒假牛痘病毒:引发牛乳房和乳头增生性病变、挤奶工皮肤丘疹。牛丘疹性口炎病毒引发牛口腔粘膜、鼻镜、鼻孔上皮溃疡，人手、臂丘疹。牛源制品应该检测病毒。能用细胞感染检测，也可用PCR检测。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第32页RNA病毒口蹄疫病毒口蹄疫病毒（FMDV）：无囊膜，20nm，人兽共患，最主要。能用细胞感染检测，也可用PCR检测。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第33页RNA病毒牛病毒性腹泻病毒牛腹泻病毒（BVDV）：有囊膜，70nm，牛群中普遍存在，倍受关注。能用细胞感染检测，也可用PCR检测。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第34页RNA病毒牛轮状病毒牛轮状病毒：无囊膜，80nm，牛群中普遍存在，对人和牛危害不大。能用细胞感染、ELISA等检测，也可用PCR检测。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第35页RNA病毒牛呼肠孤病毒呼肠孤病毒：无囊膜，80nm，牛群中普遍存在，对人和牛危害不大。能用细胞感染、ELISA等检测，也可用PCR检测。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第36页RNA病毒牛反转录病毒与生物安全性相关牛反转录病毒有两种牛白血病病毒（BLV）牛免疫缺点病病毒（BIV）09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第37页RNA病毒牛白血病病毒牛白血病病毒（BLV）：有囊膜，100nm，牛群中普遍存在。未发觉对人感染性，可用PCR检测。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第38页RNA病毒牛免疫缺点病病毒牛免疫缺点病病毒（BIV）：有囊膜，120nm，国内牛群阳性率2.32，对人和牛危害不大。用蛋白印迹法检测，也可用PCR检测。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第39页朊病毒朊病毒引发人和动物疾病各种动物和人亚急性海绵样脑病与羊痒疫因子相关人库鲁病(Kuru)、克-雅氏病(Creutzfeldt-Jakobdisease)、阿耳茨海默病(Alzheimerdisease)、格-史氏综合征(Gerstmann-Strausslersyndrome)羊痒疫(Scrapie)，水貂传染性脑病(Transmissibleminkencephalopathy)，黑尾鹿和糜鹿慢性消耗病(Chronicwastingdiseaseofmuledeerandelk)，牛海绵状脑病(Bovinespongiformencephalpopathy)以及一些公园动物相关感染症。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第40页朊病毒 Prusiner1982:theplaqueproteinistheinfectiousagentPrusiner1982:theplaqueproteinistheinfectiousagent(prion)(prion)Thenormal,Thenormal,non-infectiousProteinnon-infectiousProtein(PrP(PrPC C)isencodedbythe)isencodedbythehostandismainlyexpressedonlymphocytesandneuronshostandismainlyexpressedonlymphocytesandneurons TheTheinfectiousprionproteininfectiousprionprotein(PrP(PrPScSc)hasthesameaminoacid)hasthesameaminoacidcomposition,butisresistanttoproteasesandtendstocomposition,butisresistanttoproteasesandtendstopolymerizepolymerize09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第41页朊病毒09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第42页朊病毒09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第43页veryveryslowslowrapidrapidrapidrapidPrPCPrPScPrPCPrPScSeedingmodel(nucleatedcrystallization)Refoldingmodel(templatedirected)朊病毒09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第44页牛血清主要性与生物药品病毒安全性牛病原与病毒安全性关注重点欧盟对牛血清病毒检测要求病毒分类与牛一些病毒牛血清病毒安全检测技术血清病毒去除/灭活工艺病毒安全试验室部分研究工作09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第45页细胞培养抗体检测抗原检测核酸检测牛血清病毒安全检测技术09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第46页细胞培养主要检测血清中是否存在可致敏感细胞病变病毒，普通要求最少使用2种细胞，其中1种细胞为牛源细胞。牛血清病毒安全检测技术09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第47页抗体检测主要检测血清中一些病毒抗体，预示牛群曾经感染病毒或接种过疫苗，普遍要求BVDV抗体为必检项目牛血清病毒安全检测技术09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第48页抗原检测主要检测血清中一些病毒蛋白存在，预示血清起源牛群近期感染或潜在感染了某种病毒，如BVDV、BTV、腺病毒、狂犬病病毒等，惯用方法是ELISA、免疫荧光技术等牛血清病毒安全检测技术09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第49页核酸检测主要检测血清中一些病毒核酸存在，预示血清起源牛群近期感染或潜在感染了某种病毒，如BVDV、FMDV、BTV、细小病毒等，惯用方法是PCR、RT-PCR、荧光定量PCR等。牛血清病毒安全检测技术09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第50页朊病毒构象依赖性免疫测定构象依赖性免疫测定方法（conformation-dependent immunoassay,CDI）能检出微量prion蛋白，5 h即可出结果。可检测出8株prion，其中包含分别造成绵羊痒病、鹿慢性消耗性疾病和疯牛病各株prion。可用于检测活动物。对西班牙、德国和英国11000头屠宰牛检测结果完全与现在应用方法相符，而且在试验室和田间试验中，还没有发觉假阴性或假阳性结果。该方法另一突出优点是自动化，所以能够用于大量动物筛选。牛血清病毒安全检测技术09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第51页Positive Control Dilution to End-PointPositive Control Dilution to End-Point朊病毒09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第52页牛血清主要性与生物药品病毒安全性牛病原与病毒安全性关注重点欧盟对牛血清病毒检测要求病毒分类与牛一些病毒牛血清病毒安全检测技术血清病毒去除/灭活工艺病毒安全试验室部分研究工作09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第53页血清病毒去除/灭活工艺鉴于牛血清中病毒污染危险性，在进行病毒直接检测同时，对血清进行病毒去除与灭活很有必要。医药管理当局也强烈推荐对牛血清进行病毒灭活和验证。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第54页血清病毒去除/灭活工艺生物技术产品病毒去除与灭活技术方法巴斯德消毒法（巴氏消毒法）干热法（冻干制品）有机溶剂/去污剂（S/D）处理法膜过滤法低pH孵放法-射线法09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第55页血清病毒去除/灭活工艺适于牛血清病毒去除与灭活技术方法对于牛血清，病毒灭活多项选择取-射线法。选取标准均需验证病毒去除/灭活工艺有效性，不影响血清质量。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第56页惯用射线放射源有两种:60钴和137铯射线产生 射线来自核转变,由光子组成。在放射性衰变过程中所形成子核处于激发和不稳定状态,当由高激发态跃迁回到低激发态时即释放出 射线。射线灭活病原体种类与产生09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第57页射线灭活病原体机理直接作用：指射线直接破坏病原体核酸、蛋白质和酶等生命相关物质。当病原体受到射线照射时，接收光子能量电子由低能级壳层跃到高能级壳层，使原子呈激发状态，而当激发能高于分子电离电位时，则分子发生电离，破坏了共价键，从而破坏了病原体分子结构。间接作用：指射线作用于病原体时，其中水分子等辐解产生自由基，自由基再作用于生命物质而使病原体死亡。自由基攻击DNA分子中碱基、核糖和磷酸二酯键,造成碱基与核糖氧化、链断裂、与蛋白质交联等各种类型损伤。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第58页射线消毒杀菌优缺点优点：不使物品升温；穿透力强；被照物品不会产生放射性，辐照后无残留毒性；方法简便；节约人力、节约能源。缺点：安全性（人吸收剂量达12Gy即可引发轻度急性放射病，若靠近放射源，则数秒钟即可致死；30cm铅板、150cm混凝土或5cm深水能够阻挡放射源对人危害）；对物品影响（可使血液溶血，有些药品如蛋白酶水溶液、胰岛素溶液等，照射后几乎90以上被破坏；可使普通玻璃变黄，也可使棉纤维解聚而降低其抗张强度；亦可使食物变色变味，有蔬菜、水果香味丧失，一些营养成份丧失）。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第59页纤维蛋白原病毒灭活前后效果比较病毒灭活前纤维蛋白原 病毒灭活后纤维蛋白原09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第60页射线辐照在血浆病毒灭活中应用马平,周锡鹏,张艳宇,等.60Co-射线对冻干血浆中病毒灭活效果研究J.中国消毒学杂志,22(4):424-426冻干血浆中病毒灭活效果60Co-射线辐照处理结果显示,60Co-射线灭活冻干血浆中病毒效果随辐照剂量增加而增强。30kGy以上辐照剂量能完全灭活血浆中滴度在5.5lgTCID50以上各指示病毒。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第61页牛血清主要性与生物药品病毒安全性牛病原与病毒安全性关注重点欧盟对牛血清病毒检测要求病毒分类与牛一些病毒牛血清病毒安全检测技术血清病毒去除/灭活工艺病毒安全试验室部分研究工作09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第62页病毒安全检测相关工作血液生物制品与病毒安全检测研究室：应用发展研究为主，应用基础研究为辅；以血液制品及病毒安全性为根本，适当拓展研究领域；主动寻求合作，发挥集成优势。下设课题组/方向：血浆蛋白分离纯化工艺、特征判定、药理药效等重组蛋白研究：原核、酵母、哺乳细胞、转基因动物等抗体制备与应用：单抗、基因重组单抗等配套研究病毒安全检测：国家生物医学分析中心分支血型抗原相关研究09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第63页病毒安全检测相关工作病毒安全检测试验室挂靠在国家生物医学分析中心。主要工作包含以下几个方面：病毒灭活工艺与检测技术：血浆衍生物、生化制品、相关原材料等异种移植病毒安全性研究：国家项目为主抗病毒药品筛选：自选与合作项目为主单克隆抗体制备与应用：自选与合作项目为主09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第64页病毒安全检测相关工作生物活性材料病毒安全性检测：牛血清、血浆衍生物、生化制品、相关原材料等符合规范二级早晨安全试验室09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第65页牛血清病毒安全检测相关工作细胞基质与指示病毒细胞基质体系完善：拥有30种以上动物传代细胞系；自行制备牛、人原代与继代细胞指示病毒体系完善：DNA病毒与RNA病毒；有囊膜病毒与无囊膜病毒完全能够满足牛血清病毒安全检测与病毒去除/灭活工艺研究与验证要求。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第66页牛血清病毒安全检测相关工作BVDV方面抗体检测：当前直接使用IDEXXELISA试剂盒，正在组建全病毒抗原和基因重组抗原ELISA试剂盒。1 阳性对照平均值22 阴性对照平均值2-21 样品1-20 s/p值按试剂盒要求，阴性平均值应小于0.20，此次测定阴性平均值小于0.05，测定结果有效。样品S/P值大于0.5判为阳性，此次试验20份原料血样品抗体检测S/P值均小于此值，故全部判为阴性。原料血浆BVDV抗体检测结果 09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第67页牛血清病毒安全检测相关工作BVDV方面核酸检测：自行建立了RT-PCR检测技术。抗原检测：正在制备BVDV单克隆抗体和表示了相关基因09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第68页牛血清病毒安全检测相关工作BTV方面抗体检测：自行建立了c-ELISA试剂盒。抗原检测：正在进行中，主要是标识荧光抗体。纯化纯化VP7VP7蛋白和蛋白和3E2-HRP3E2-HRP单抗竞争单抗竞争ELISAELISA反应特异性柱状图反应特异性柱状图 与VMRD企业c-ELISA试剂盒比较样品1:2和1:4倍稀释时，组装试剂盒检测与美国c-ELISA试剂盒符合率为100%；样品1:8倍稀释，BTV-18和BTV-22组装试剂盒为阳性，进口试剂盒为阴性；1:16倍稀释时，BTV-6组装试剂盒为阳性，进口试剂盒为阴性，其余相同；1:32和1:64倍稀释时；BTV-19组装试剂盒为阳性，进口试剂盒为阴性；1:64倍稀释时，两试剂盒检测结果一致。09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第69页牛血清病毒安全检测相关工作BTV方面核酸检测：自行建立了通用RT-PCR和Q-PCR试剂盒，正在报批中。M：DL；A：50l BTV5+150l小牛血清；B：100l BTV5+100l小牛血清C：150l BTV5+50l小牛血清；D：200l BTV5 BTVRT-PCR检测09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第70页牛血清病毒安全检测相关工作BTV方面核酸检测：自行建立了通用RT-PCR和Q-PCR试剂盒，正在报批中。BTV1、3、5、8、10、11、21、22 RT-QPCR扩增曲线 BTV RT-QPCR检测方法特异性试验(a)P121灵敏性试验扩增曲线(b)P121扩增标准曲线 检测BTV1灵敏性试验 AE：51 CCID50 BTV1 09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第71页牛血清病毒安全检测相关工作P121重复性试验扩增曲线 模拟血清样品荧光PCR检测 BTV1重复性检测扩增曲线 09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第72页牛血清病毒安全检测相关工作BLV方面抗体检测：当前直接使用IDEXXELISA试剂盒，正在组建全病毒抗原和基因重组抗原ELISA试剂盒。BLV抗体检测结果 09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第73页牛血清病毒安全检测相关工作BLV方面核酸检测：自行建立了Nest-PCR扩增技术。样品及BTV5阳性对照品cDNA扩增后结果 Nest-PCR扩增后结果 09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第74页牛血清主要性与生物药品病毒安全性牛病原与病毒安全性关注重点欧盟对牛血清病毒检测要求病毒分类与牛一些病毒牛血清病毒安全检测技术血清病毒去除/灭活工艺病毒安全试验室部分研究工作09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第75页谢谢各位！09月军事医学科学院输血医学研究所牛血清的病毒安全检测和病毒灭活工艺第76页