组织化学技术免疫组化专家讲座.pptx

第三章第三章 免疫组织化学免疫组织化学 序言序言 免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。它 是组织化学分支，它是用标识特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）分布进行组织和细胞原位检测技术。组织化学技术免疫组化第1页1发展简史发展简史1941年 Coons 首先用荧光素标识抗体检 测肺组织内肺炎双球菌取得成功。60年代 Nakane建立酶标抗体技术铁 蛋白标识Ab技术。70年代 Stemberger 改良上述技术，建立 辣根过氧化物酶抗体过氧化物酶（PAP ）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。组织化学技术免疫组化第2页 80 80年代年代 Hsu Hsu 等建立了抗生物素等建立了抗生物素生素（生素（ABCABC）法之后，免疫金法之后，免疫金银染色法、半抗原标识法、银染色法、半抗原标识法、免疫电镜技术相继问世。免疫电镜技术相继问世。90 90年代年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细 胞化学分类方法快速发展。胞化学分类方法快速发展。各种免疫组化技术愈加成熟，使免疫组各种免疫组化技术愈加成熟，使免疫组 化技术成为当今生物医学中形态、功化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综能代谢综 合研究一项有力工具。其应用范围深达医学各合研究一项有力工具。其应用范围深达医学各 个学科，是当前生个学科，是当前生 命科学工作者应命科学工作者应 该掌握基该掌握基 本技术之一。本技术之一。组织化学技术免疫组化第3页2免疫组织化学技术分类免疫组织化学技术分类（1）依据染色方式分成：贴片染色 漂浮染色（2）依据AgAb结合方式分成：直接法 间接法 多层法组织化学技术免疫组化第4页（3）按标识物性质分成：免疫荧光技术（免疫荧光法）免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD 法、ABC法）免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金 染色法、蛋白A金法）3标识物标识物（1）必要性：组织细胞内AgAb结合反应一 般是不可见，若在镜下检测，则必须 含有可视性标识物。组织化学技术免疫组化第5页（2）惯用标识物 荧光素：最惯用是异硫一氰酸荧光 素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）荧光显微镜下呈绿色荧光 四乙基罗达明（rhodamine RB200）荧光显微镜下发橙红色荧光 酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。生物素：（Biotin）铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。其它：如同位素（因包括污染和防护 难普通不用）组织化学技术免疫组化第6页 4应用应用 凡是组织细胞内含有抗原性物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而当前在基础与临床科研中被广泛应用。最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学方法对所研究大分子分子进行定位，进而深入研究其功效。组织化学技术免疫组化第7页一、免疫组织化学技术一、免疫组织化学技术（一）染色方法（一）染色方法1直接法直接法 荧光素直接标识特异性抗体（抗）上，标识抗体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察检测抗原。酶标抗体要显示后镜检。组织化学技术免疫组化第8页直接法优点：简单，时间短，特异性强。缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不经济）。应用：基本不用了！组织化学技术免疫组化第9页2间接法间接法 荧光素标识在二抗上（二抗：抗产生一抗动 物 IgG抗体）。显色后镜检 特点：较直接法灵敏，可标识一个抗体 判定各种抗原。组织化学技术免疫组化第10页3非标识非标识Ab桥法：桥法：“桥法”是酶标识抗体改进，经过三次抗体，其二抗为未标识桥抗体。（1）单桥法）单桥法组织化学技术免疫组化第11页组织化学技术免疫组化第12页(2)双桥法双桥法 在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，可增大染色强度。尤其提醒：注意动物种属关系4PAP法（过氧化物酶法（过氧化物酶抗过氧化物酶法抗过氧化物酶法 Peroxidase antiperoxidase methodPeroxidase antiperoxidase method，PAP PAP法）法）是桥法改良，既先形成PAP复合物抗 原抗体抗IgG抗体PAP复合物。组织化学技术免疫组化第13页组织化学技术免疫组化第14页 该法简化了操作步骤，提升了灵敏度，所染该法简化了操作步骤，提升了灵敏度，所染标本可长久保留。标本可长久保留。5ABC法（亲和素法（亲和素生物素生物素过氧化物酶复过氧化物酶复 合物法，合物法，Avidinbiotinperoxidase Complex method，ABC法）法）Avidin：亲和素，一个糖蛋白，其上有4个 与生物素相结合位点。Biotin：生物素维生素H，二者亲和力巨 大，牢不可破。组织化学技术免疫组化第15页（1）ABC复合物制备：ABC法与法与PAP法区分是：法区分是：以ABC复合物代替PAP复合物。组织化学技术免疫组化第16页（2）ABC法反应原理法反应原理组织化学技术免疫组化第17页6SP或或SAP法（过氧化物酶标识链霉卵法（过氧化物酶标识链霉卵 白素或过氧化物酶标识碱性磷酸酶染白素或过氧化物酶标识碱性磷酸酶染 色）色）Streptavidin/peroxidase or strepta-vidin/alkaline phosphatase）该法是ABC法基础上深入改良，使卵白 素与链霉（而非生物素）结合，而后再结 合PO。它有4个亚基可与生物素结合，灵敏特异，背景低，成本低。组织化学技术免疫组化第18页 现在还有plus盒。优点是：更简便，放大倍数，等电点中性更适合组织。分子量小，穿透力，原理保密。7蛋白蛋白A金法金法（ProteinA gold method）多用于电镜8双重组化染色法双重组化染色法 应用双重免疫组织化学激素可在同一张切片，同一细胞或亚细胞结构内同时显示两种不同抗原。组织化学技术免疫组化第19页9免疫金免疫金银染色法银染色法 （Immunogoldsilver staining IGSS）（二）固定（二）固定见前述见前述注意事项：注意事项：1固定剂选择：因组织而不一样，注意质量和 性能。2固定方式选择：浸渍固定（参考文件）灌注固定（+后固定）蒸汽固定组织化学技术免疫组化第20页（三）免疫组化染色步骤（以（三）免疫组化染色步骤（以ABCABC法为例）法为例）1切片脱蜡入水，入PAS 洗三次/15分钟。2封闭内源性过氧化物酶。用新配置0.3H2O2（在PAS或0.05Tris HCL缓冲液PH7.6中或甲醇中）室温，30 分 钟。3水洗，入PBS，洗三次，每次5分钟。4降低非特异性着色组织化学技术免疫组化第21页 用稀释20倍正常血清（产生二次抗体动物 血清！），室温，30分钟。5滴加第一抗体，4过液或室温51 hour。60.1MPBS，洗三次，每次5分钟。7滴加第二抗体，室温15 60。80.1MPBS 洗净，洗三次，每次5分钟。9滴加ABC复合物，室温1560分钟。100.1MPBS 洗三次，每次5分钟。组织化学技术免疫组化第22页110.05M Tris HCL 510分钟，此步可省略。12DABH2O2 显色：用0.01H2O2DAB溶 液，室温530分钟，随时镜检（DAB用时 新配）13自来水洗净。14用Mayer 苏木精或0.5甲基绿，复染胞 核（可不染）。15常规脱水、透明、封固、镜检。结果：棕褐色反应产物代表抗原结果：棕褐色反应产物代表抗原X定位。定位。组织化学技术免疫组化第23页（四）免疫组化染色基本技术及注意事项（四）免疫组化染色基本技术及注意事项1试验计划试验计划 依据课题内容选取动物，选取配套依据课题内容选取动物，选取配套AbAb。如如AbIAbI鼠抗人抗体，与其它种属间无鼠抗人抗体，与其它种属间无 交叉，则交叉，则 不能用其它动物，而且不能用其它动物，而且Ab-Ab-必须是羊抗鼠，若必须是羊抗鼠，若 PAP PAP法法Ab-Ab-必须起源于鼠，不然不能连接成复合物。必须起源于鼠，不然不能连接成复合物。若要比较染色深浅在对照组与试验组间差 异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否 则无可比性。组织化学技术免疫组化第24页 选取试剂可靠，货源充分，随时可取。2Ab稀释度稀释度 （如系购置药盒有工作液和原液）（如系购置药盒有工作液和原液）（1）工作液：无须稀释）工作液：无须稀释（2）原液：）原液：应参考其提供工作液浓度进行预试验验。如：工作液浓度为11000，可选1500 11000，11500试验；若:1500有背景，11000阳性反应稍 浅，可选1750进行试验。组织化学技术免疫组化第25页 原液保留（20）冻存应选最正确稀 度冻存。若工作浓度大于1500则要先将原液稀释 十倍，而后分装10l/瓶冻存（-20）于 冰箱备用。关于Ab保留应参考说明书。（3）Ab浓度选择 Ab浓度不可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少；极过剩时已形成复合物亦会解体而展现假阴性。并非Ab浓度越高越好。组织化学技术免疫组化第26页3Ab滴片技术滴片技术 所滴抗体应与切片上组织刚好吻合。注意注意 滴抗体前需把切片上水弄干，但不能 干片。要领：要领：甩净组织周围水。4PBS洗涤技术洗涤技术（1）洗涤目标 确保离子浓度和PH值。降低非特异反应（平时Ab不可靠很纯）组织化学技术免疫组化第27页Ab滴片图示：滴片图示：（2）方法：洗三次，每次5分钟。5Ab孵育技术孵育技术（1）必须在湿盒内进行，以防抗体蒸发和干片。组织化学技术免疫组化第28页（2）温度与时间 4：过液，16 37：1 h or 参考说明书6光镜控制显色方法光镜控制显色方法（1）室内操作：注意温度与时间关系，室温 最宜5分钟。（2）染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可 加深。（五）对照组和染色结果评价（五）对照组和染色结果评价组织化学技术免疫组化第29页免疫组化染色试验组与对照组结果分析表免疫组化染色试验组与对照组结果分析表组织化学技术免疫组化第30页 从表上能够看出，只有6，7试验结果有意义。15均因对照组结果已否定Ab特异性or因IHC技术操作存在错误等而使试验结果失去意义，必须重复试验or换用Ab。除上述对照结果分析之外，还必须从以下几 个方面综合评价：组织化学技术免疫组化第31页1阳性染色特点 Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质含有结构 性。（非特异性细胞与组织无区分）染色强度不一样：颜色深浅不一（非特异性染 色 弥散性均匀）2组织切片制作过程影响 固定不良非特异性染色，显示不均。边缘干燥非特异性染色（常见），加抗体 时勿干片。3人工假象与特异性结果显示不在同一平面上。组织化学技术免疫组化第32页阳性对照：阳性对照：用已知抗原阳性切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。阴性对照阴性对照：用确证不含已知抗原标本作对照，应呈 阴性结果，称阴性对照。其实这只是阴性 对照中一个，阴性对照还应包含空白、替换、吸收和抑制试验。组织化学技术免疫组化第33页 染色失败几个原因：染色失败几个原因：（1）所染全部切片均为阴性结果，包含阳性 对照在内。全部（）原因可能：染色未完全严格按照操作步骤进行；漏加一个抗体，或抗体失效；缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶活性；底物中所加H2O2 量少或失效；复染或脱水剂使用不妥组织化学技术免疫组化第34页（2）全部切片均呈阳性反应，原因可能是：切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了。缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确，洗涤不彻底。使用已变色呈色底物溶液，或呈色反应 时间过长。抗体温育时间过长。H2O2 浓度过高，呈色速度过快。粘附剂太 厚。组织化学技术免疫组化第35页（3）全部切片背景过深，原因可能是：未加酶消化处理切片。未加酶消化处理切片。切片或涂片过厚。切片或涂片过厚。漂洗不够。漂洗不够。底物呈色反应过久。底物呈色反应过久。蛋白质封闭不够或所用血清溶血。蛋白质封闭不够或所用血清溶血。使用全血清抗体稀释不够。使用全血清抗体稀释不够。组织化学技术免疫组化第36页（4）阳性对照染色良好，检测阳性标本呈阴 性反应。最常见原因是：标本固定和处理不妥。二、免疫电镜技术二、免疫电镜技术 序言：序言：免疫电镜技术又称电子显微镜免疫细胞化学技术。是免疫细胞化学与电镜技术相结合产物，即在电镜下对细胞内抗原做定性或定量研究。其中免疫铁蛋白技术，免疫胶体金技术，免疫酶细胞化学技术等，皆为惯用技术组织化学技术免疫组化第37页 免疫细胞化学技术细胞水平（光镜分辨率）（光镜分辨率）电镜免疫细胞化学技术超微结构水平 （电镜分辨率）（一）组织固定与取材（一）组织固定与取材要求：即要求保持良好超微结构，又要求保 持组织Ag性，固定选择不宜过强。惯用：1 4多聚甲醛+1戊二醛 2 过 碘 酸 赖 氨 酸 多 聚 甲 醛 液（PLPPLP）液组织化学技术免疫组化第38页（二）免疫染色（二）免疫染色1.包埋前染色：包埋前染色：即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修整成小 块，按常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱 水、包埋。优点：优点：抗原不易被破坏，易于取得良好免 疫反应。可在免疫反应阳性部位定位做超薄 切片，检出率。组织化学技术免疫组化第39页 缺点：缺点：经过一系列染色步骤，易损伤结构。应用应用：尤其适合用于含抗原量较少组织。2.包埋后染色包埋后染色：组织标本经过固定脱水及树脂包埋、制成超薄切片后，再进行免疫组化染 色。由于是以贴在网上超薄切片进行免疫染色，故又称载网染色（on grid staining ）。）。组织化学技术免疫组化第40页优点：优点：Ultrastructure 保留良好。超薄切片易穿透，可标识细胞任何 部位。方法简便，（+）结果高度可重复性。同一张切片上可进行多重免疫染色。缺点：缺点：抗原活性可能减弱或消失。树脂中组织不易进行免疫反应。组织化学技术免疫组化第41页3超薄冰冻切片：超薄冰冻切片：T2.3mol/L（蔗糖）液氮速冻冰冻超薄切片上切片（厚于光镜片）（三）包埋（三）包埋1树脂包埋2低温包埋 K4 M ：单体 ，17.3；支联体，2.70g；引发剂，0.10g。组织化学技术免疫组化第42页（四）免疫电镜包埋前染色（四）免疫电镜包埋前染色前法前法 4多聚甲醛（0.05MPBS，PH7.2）原位固 定，4，1h 0.05M PBS 充分洗前 处理 0.05M PBS 充分洗前处理。PAP或ABC染色系列过程呈色。PBS洗53次。1戊二醛固定301h，PBS洗。组织化学技术免疫组化第43页 1锇酸固定301h 。常规脱水，树脂包埋。半薄切片定位，超薄切片。切片复染。电镜观察。谢谢！再见！组织化学技术免疫组化第44页