紫外可见分光在医学检验中的应用.pptx

紫外-可见分光光度法紫外-可见吸收光谱朗伯朗伯-比耳定律比耳定律紫外-可见分光光度计分析条件选择分析条件选择测定方法在医学检验中应用紫外可见分光在医学检验中的应用第1页紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visiblespectrophotometry,UV-VIS)按所吸收光波长区域不一样，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。它是利用物质分子或离子对某一波长范围光吸收作用，对物质进行定性分析定性分析、定量分析定量分析及结构分析结构分析,所依据光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长光而产生吸收光谱。紫外可见分光在医学检验中的应用第2页紫外-可见分光光度法特点：1与其它光谱分析方法相比，其仪器设备和仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快操作都比较简单，费用少，分析速度快;2灵敏度高灵敏度高;3选择性好选择性好;4 精密度和准确度较高精密度和准确度较高;5用途广泛用途广泛。紫外可见分光在医学检验中的应用第3页1.紫外-可见吸收光谱1.物质对光选择性吸收物质对光光吸收是选择性选择性，利用被测物质对某波长光吸收来了解物质特征，这就是光谱法基础光谱法基础。紫外可见分光在医学检验中的应用第4页经过测定被测物质对不一样波长光吸收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范围吸收曲线吸收曲线。如图3-1；在吸收曲线中，通常选取最大吸收波长max进行物质含量测定。紫外可见分光在医学检验中的应用第5页2有机化合物紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱相关电子有三种，即形成单键电子、形成双键电子以及未参加成键n电子。跃迁类型有：*、n*、*、n*四种。2.1有机化合物电子跃迁紫外可见分光在医学检验中的应用第6页 饱合有机化合物饱合有机化合物电子跃迁类型为*，n*跃迁，吸收峰普通出现在真空紫外区，吸收峰低于200nm，实际应用价值不大。不饱合机化合物不饱合机化合物电子跃迁类型为n*，*跃迁，吸收峰普通大于200nm。紫外可见分光在医学检验中的应用第7页生色团：是指分子中能够吸收光子而产生电子跃迁原子基团。人们通常将能吸收紫外、可见光原子团或结构系统定义为生色团。见表3-1和3-2。助色团：是指带有非键电子正确基团，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它们本身不能吸收大于200nm光，不过当它们与生色团相连时，会使生色团吸收峰向长波方向移动，而且增加其吸收强度。见表3-4。紫外可见分光在医学检验中的应用第8页红移和紫移在有机化合物中，经常因取代基变更或溶剂改变，使其吸收带最大吸收波长max发生移动。向长波方向移动称为红移(表3-3)，向短波方向移动称为紫移。紫外可见分光在医学检验中的应用第9页2.2有机化合物吸收带吸收带(absorptionband):在紫外光谱中，吸收峰在光谱中波带位置。依据电子及分子轨道种类，可将吸收带分为四种类型。(1)R吸收带(2)K吸收带(3)B吸收带(4)E吸收带紫外可见分光在医学检验中的应用第10页3无机化合物紫外-可见吸收光谱镧系和锕系元素离子对紫外和可见光吸收是基于内层f电子电子跃迁而产生。其紫外可见光谱为一些狭长特征吸收峰，这些峰几乎不受金属离子配位环境影响。1.f电子跃迁吸收光谱紫外可见分光在医学检验中的应用第11页过渡金属电子跃迁类型为d电子电子在不一样d轨轨道道间跃迁，吸收紫外或可见光谱。这些峰强烈受配位环境影响。比如cu2+以水为配位体，吸收峰在794nm处，而以氨为配位体，吸收峰在663nm处。这类光谱吸收强度弱，较少用于定量分析。2.d电子跃迁吸收光谱紫外可见分光在医学检验中的应用第12页3.电荷迁移光谱一些分子既是电子给电子给体体，又是电子受体电子受体，当电子受辐射能激发从给体外层轨道向受体跃迁时，就会产生较强吸收，这种光谱称为电荷迁移光谱。如苯酰基取代物在光作用下异构反应。紫外可见分光在医学检验中的应用第13页1.4影响紫外-可见吸收光谱原因物质吸收光谱与测定条件有亲密关系。测定条件（温度、溶剂极性、pH等）不一样，吸收光谱形状形状、吸收峰吸收峰位置、吸收强度吸收强度等都可能发生改变。1.温度在室温范围内，温度对吸收光谱影响不大。紫外可见分光在医学检验中的应用第14页2.溶剂注意以下几点：（1）尽可能选取低极性溶剂；（2）能很好地溶解被测物，而且形成溶液含有良好化学和光化学稳定性；（3）溶剂在样品吸收光谱区无显著吸收。3.pH值紫外可见分光在医学检验中的应用第15页1.5紫外-可见吸收光谱应用紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质定量分定量分析析外，还能够用于物质定性分析、纯度判定、结构分析。1.定性分析紫外可见分光在医学检验中的应用第16页2.纯度判定用紫外吸收光谱确定试样纯度是比较方便。如蛋白质与核酸纯度分析中，可用A280/A260比值，判定其纯度。紫外可见分光在医学检验中的应用第17页3.结构分析紫外-可见吸收光谱普通不用于化合物结构分析，但利用紫外吸收光谱判定化合物中共轭结构和芳环结构还是有一定价值。比如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明该物质无共轭结构和芳香结构。紫外可见分光在医学检验中的应用第18页2.朗伯-比尔定律设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia,透射光强度为It，反射光强度为Ir，则I0=Ia+It+Ir因为反射光强度基本相同，其影响可相互抵消，上式可简化为：I0=Ia+It一、吸光度和透光度一、吸光度和透光度紫外可见分光在医学检验中的应用第19页吸光度吸光度:为透光度倒数对数，用A表示，即A=lg1/T=lgI0/It透光度：透光度：透光度为透过光强度It与入射光强度I0之比，用T表示：即T=It/I0紫外可见分光在医学检验中的应用第20页二、朗伯二、朗伯-比尔定律比尔定律朗伯-比尔定律：当一束平行单色光经过含有吸光物质稀溶液时，溶液吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即A=cl 式中百分比常数与吸光物质本性，入射光波长及温度等原因相关。c为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法理论基础。紫外可见分光在医学检验中的应用第21页三、吸光系数当l以cm，c以g/L为单位，称为吸光吸光系数系数，用a表示。A=acla单位为L/(g.cm)紫外可见分光在医学检验中的应用第22页当l以cm，c以mol/L为单位，称为摩尔摩尔吸光系数吸光系数，用表示。单位为单位为L/mol.cm，它表示物质浓度为它表示物质浓度为1mol/L，液层厚度为液层厚度为1cm时，溶液吸光度时，溶液吸光度。摩尔吸光系数紫外可见分光在医学检验中的应用第23页比吸光系数比吸光系数是指百分含量为1%，l为1cm时吸光度值，用表示。紫外可见分光在医学检验中的应用第24页四、偏离朗伯-比耳定律原因（1）入射光为非单色光）入射光为非单色光（3）光程不一致性。）光程不一致性。光源不是点光源，比色皿光径长度不一致，光学元件缺点引发屡次反射等，均造成光径不一致，从而与定律偏离。（2）溶液不均性。）溶液不均性。实际样品混浊，加入保护胶体，蒸馏水中微生物，存在散射以及共振发射等，均可吸光质点吸光特征改变大。紫外可见分光在医学检验中的应用第25页3.紫外-可见分光光度计一、主要部件性能与作用基本结构:光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器信号显示系统信号显示系统样品样品紫外可见分光在医学检验中的应用第26页在紫外可见分光光度计中，惯用光源有两类：热辐射光源和气体放电光源热辐射光源和气体放电光源1光源热辐射光源用于可见光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。紫外可见分光在医学检验中的应用第27页单色器主要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。2单色器单色器质量优劣，主要决定于色散元件质量。色散元件惯用棱镜和光棱镜和光栅栅。紫外可见分光在医学检验中的应用第28页吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外区。3吸收池吸收池种类很多，其光径可在0.110cm之间，其中以1cm光径吸收池最为惯用。紫外可见分光在医学检验中的应用第29页4检测器检测器作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。现今使用分光光度计大多采取光电管或光电倍增管作为检测器。5信号显示系统惯用信号显示装置有直读检流计，电位调整指零装置，以及自动统计和数字显示装置等。紫外可见分光在医学检验中的应用第30页二、紫外-可见分光光度计类型按其光学系统可分为单波长分光光度计和双波长分光光度计。紫外可见分光在医学检验中的应用第31页1.单波长单光束分光光度计当前国内广泛采取721型分光光度计。含有结构简单、价格低廉、操作方便、维修也比较轻易，适合用于常规分析。单波长单光束分光光度计还有国产751型、XG-125型、英国SP500型和伯克曼DU-8型等。紫外可见分光在医学检验中的应用第32页2.单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计有国产710型、730型、740型、日立UV-340型等就属于这种类型。紫外可见分光在医学检验中的应用第33页3.双波长分光光度计双波长分光光度计优点：是能够在有背景干忧或共存组分吸收干忧情况下对某组分进行定量测定。国产WFZ800-5型、岛津UV-260型、UV-265型等。紫外可见分光在医学检验中的应用第34页三、分光光度计校正和检验1.波长校正2.吸光度校正3.杂散光检验4.稳定性检验紫外可见分光在医学检验中的应用第35页4分析条件选择一、仪器测量条件选择1.适宜吸光度范围由朗伯-比尔定律可知：A=lg1/T=cl微分后得：dlgT=0.4343dT/T=-ldc或0.4343T/T=-lc紫外可见分光在医学检验中的应用第36页代入朗伯-比尔定律有：c/c=0.4343T/TlgT要使测定相对误差c/c最小最小，求导取极小得出：lgT=-0.4343=A即当A=0.4343时，吸光度测量误差最小时，吸光度测量误差最小。最适宜测量范围为0.20.8之间。紫外可见分光在医学检验中的应用第37页通常是依据被测组分吸收光谱，选择最强吸收带最大吸收波长为入射波长。当最强吸收峰峰形比较尖锐时，往往选取吸收稍低，峰形稍平坦次强峰或肩峰进行测定。2.入射光波长选择紫外可见分光在医学检验中的应用第38页3狭缝宽度选择为了选择适当狭缝宽度，应以降低狭缝宽度时试样吸光度不再增加吸光度不再增加为准。普通来说，狭缝宽度大约是试样吸收峰半宽度十分之一。紫外可见分光在医学检验中的应用第39页对各种物质进行测定，常利用显色反应将被测组分转变为在一定波长范围有吸收物质。常见显色反应有配位反应、氧化还原反应等。二、显色反应条件选择紫外可见分光在医学检验中的应用第40页这些显色反应，必须满足以下条件：4.反应生成物组成恒定。3.反应生成产物有足够稳定性足够稳定性，以确保测量过程中溶液吸光度不变；2反应有较高选择性较高选择性，即被测组分生成化合物吸收曲线应与共存物质吸收光谱有显著差异；1反应生成物必须在紫外紫外-可见光区可见光区有较强较强吸光能力吸光能力，即摩尔吸光系数较大；紫外可见分光在医学检验中的应用第41页1酸度显色反应最适宜酸度范围可经过试验来确定：测定某一固定浓度试样吸光度随酸度改变，以吸光度为纵坐标，溶液PH值为横坐标作图。3.显色时间和温度2.显色剂用量紫外可见分光在医学检验中的应用第42页测定试样溶液吸光度，需先用参比溶液调整透光度（吸光度为0）为100%，以消消除其它成份及吸光池和溶剂等对光反射和除其它成份及吸光池和溶剂等对光反射和吸收带来测定误差吸收带来测定误差。三、参比溶液选择紫外可见分光在医学检验中的应用第43页参比溶液选择视分析体系而定，详细有：1溶剂参比溶剂参比试样简单、共存其它成份对测定波长吸收弱，只考虑消除溶剂与吸消除溶剂与吸收池收池等原因；2试样参比试样参比假如试样基体溶液在测定波长有吸收，而显色剂不与试样基体显色时，可按与显色反应相同条件处理试样，只是不加入显色剂。紫外可见分光在医学检验中的应用第44页3试剂参比试剂参比假如显色剂或其它试剂在测定波长有吸收，按显色反应相同条件，不加入试样，一样加入试剂和溶剂作为参比溶液。4.平行操作参比平行操作参比用不含被测组分试样，在相同条件下与被测试样同时进行处理，由此得到平行操作参比溶液。紫外可见分光在医学检验中的应用第45页5测定方法一、单组分定量方法单组分是指样品溶液中含有一个组分，或者是在混合物溶液中待测组分吸收峰与其它共有物质吸收峰无重合。其定量方法包含校准曲线法校准曲线法、标准对比法和吸收系数法。紫外可见分光在医学检验中的应用第46页1校准曲线法方法：配制一系列不一样含量标准溶液，选取适宜参比，在相同条件下，测定系列标准溶液吸光度，作A-c曲线曲线，即标准曲线，也可用最小二乘数处理，得线性回归方程回归方程。在相同条件下测定未知试样吸光度，从标准曲线上就能够找到与之对应未知试样浓度。紫外可见分光在医学检验中的应用第47页2标准对比法即将待测溶液与某一标样溶液，在相同条件下，测定各自吸光度，建立朗伯-比尔定律，解方程求出未知样浓度与含量。As=KcsAx=Kcx紫外可见分光在医学检验中的应用第48页例1.血清铜测定例2.新生儿血清胆红素测定6紫外-可见分光光度法在医学检验中应用紫外可见分光在医学检验中的应用第49页