细菌感染的实验诊疗.pptx

第二章第二章细菌感染试验诊疗细菌感染试验诊疗细菌感染的实验诊疗1/58感染诊疗感染诊疗有赖于有赖于l从标本中检出病原体或检出病原从标本中检出病原体或检出病原体可溶性抗原体可溶性抗原,或病原体或病原体DNAl病人血清中检出病原体抗体病人血清中检出病原体抗体 本章主要讨论检出病原体问题本章主要讨论检出病原体问题细菌感染的实验诊疗2/58第一节第一节试验诊疗目标与要求试验诊疗目标与要求细菌感染的实验诊疗3/58l进行病原学诊疗进行病原学诊疗l进行药敏试验进行药敏试验,指导合理用药指导合理用药l用作流行病学调查用作流行病学调查,追踪传染源追踪传染源l研究病原生物与感染关系研究病原生物与感染关系一一.目标目标细菌感染的实验诊疗4/58鲍氏痢疾志贺菌鲍氏痢疾志贺菌13型暴发型暴发l时间：时间：1992年年9月月l发病：发病：26名名l死亡：死亡：10名名l地点：某婴儿室地点：某婴儿室l传染源：慢性携带者产妇传染源：慢性携带者产妇l传输方式：经过污染操作台接触传输方式：经过污染操作台接触细菌感染的实验诊疗5/58鼠伤寒暴发鼠伤寒暴发l时间：时间：1991年年11月月l地点：某婴儿室地点：某婴儿室l发病：发病：55名名 l 死亡：死亡：23名名l 56件物品（被褥，尿布，奶瓶）中件物品（被褥，尿布，奶瓶）中26件件检出鼠伤寒沙门菌检出鼠伤寒沙门菌细菌感染的实验诊疗6/58二二.诊疗试验选择诊疗试验选择l有价值有价值l快速简便快速简便l特异性和敏感性高特异性和敏感性高细菌感染的实验诊疗7/58可用方法可用方法:查病原体查病原体:直接涂片直接涂片 分离分离,对纯培养物进行判定对纯培养物进行判定查可溶性抗原查可溶性抗原:用已知抗体用已知抗体查查DNA:分子生物学方法分子生物学方法查抗体查抗体:用已知抗原用已知抗原 IgM IgG:效价有效价有4倍以上增高倍以上增高细菌感染的实验诊疗8/58三三.细菌判定流程细菌判定流程l双歧检索双歧检索:以某一试验分以某一试验分l表解表解:用各种试验整体分析用各种试验整体分析l数字编码数字编码:将各种试验分别编码将各种试验分别编码,数字化后查表数字化后查表细菌感染的实验诊疗9/58革兰氏阴性杆菌革兰氏阴性杆菌葡萄糖发酵葡萄糖发酵+-氧化酶氧化酶+-弧菌弧菌肠杆菌肠杆菌非发酵菌非发酵菌细菌感染的实验诊疗10/58A B C D E甲甲 乙乙 丙丙 丁丁+-+-+-+-+细菌感染的实验诊疗11/58组别组别 试验试验 代码代码 结果结果 结果代码结果代码 总值总值 1 A 4 -0 1 B 2 -0 C 1 +1 2 D 4 +4 5 E 2 -0 F 1 +1 15 细菌感染的实验诊疗12/58微量生化反应系统和自动化微量生化反应系统和自动化l 各试验孔含不一样试验脱水底物各试验孔含不一样试验脱水底物l 加入纯化被检菌加入纯化被检菌l 孵育孵育4-24h观察结果观察结果l 人工读取依据编码资料判定菌种或人工读取依据编码资料判定菌种或 电脑读取电脑读取 细菌感染的实验诊疗13/58第二节临床标本采集与处理临床标本采集与处理细菌感染的实验诊疗14/58一一.标本采集标准标本采集标准l早期早期,用抗菌药品前用抗菌药品前l依据病原体存在部位采集对应标本依据病原体存在部位采集对应标本l无菌技术无菌技术,防止正常菌群污染防止正常菌群污染,预防预防病原体播散病原体播散l采取适当方法采取适当方法细菌感染的实验诊疗15/58二二.标本处理标本处理l尽快接种到适当培养基上尽快接种到适当培养基上l依据抵抗力选择保留和运输条件依据抵抗力选择保留和运输条件 厌氧菌厌氧菌 奈瑟菌奈瑟菌 病毒病毒细菌感染的实验诊疗16/58第三节第三节细菌形态学检验细菌形态学检验细菌感染的实验诊疗17/58一一.不染色标本不染色标本l用悬滴法或压片用悬滴法或压片l细菌是活细菌是活,可观察运动可观察运动l加入特异抗体可抑制其运动加入特异抗体可抑制其运动l结合标本起源可作初步诊疗结合标本起源可作初步诊疗,如霍乱如霍乱,梅毒梅毒l用相差或暗视野显微镜效果更加好用相差或暗视野显微镜效果更加好细菌感染的实验诊疗18/58压片压片悬滴法悬滴法细菌感染的实验诊疗19/58二二.染色标本染色标本l革兰染色革兰染色(Gram stain):紫色革兰阳性紫色革兰阳性;红红色革兰阴性色革兰阴性.注意细菌大小注意细菌大小,形状形状,排列以排列以及着色均一性及着色均一性l抗酸染色抗酸染色(acid-fast stain):红色抗酸阳性红色抗酸阳性,蓝色抗酸阴性蓝色抗酸阴性l荧光染色荧光染色:更易观察更易观察细菌感染的实验诊疗20/58特殊染色可用于观察荚膜特殊染色可用于观察荚膜,鞭毛等鞭毛等细菌特殊结构细菌特殊结构细菌感染的实验诊疗21/58第四节第四节细菌分离培养细菌分离培养细菌感染的实验诊疗22/58一一.细菌生长要求细菌生长要求 培养基培养基:营养物质营养物质,pH7.4 气体气体:需氧菌需氧菌,厌氧菌厌氧菌,兼性厌兼性厌氧氧 菌菌,微需氧菌微需氧菌 温度温度:普通普通37C 时间时间:普通普通1824h细菌感染的实验诊疗23/58二二.培养基培养基1.对对培养基基本要求培养基基本要求l足够营养物质足够营养物质l适当适当pHl无菌无菌l澄清澄清细菌感染的实验诊疗24/582.培养基种类培养基种类l按培养基成份分按培养基成份分:基础培养基基础培养基:满足普通细菌要求满足普通细菌要求 营养培养基营养培养基:满足苛求细菌要求满足苛求细菌要求 判别培养基判别培养基:加有被利用物和指示剂加有被利用物和指示剂 选择培养基选择培养基:加有抑制剂加有抑制剂,能抑制非目标能抑制非目标菌生长菌生长 特殊培养基特殊培养基:满足特殊细菌要求满足特殊细菌要求细菌感染的实验诊疗25/58l按培养基物理性状分按培养基物理性状分:液体液体:增菌增菌 固体固体:加加2%琼脂琼脂,平板用于分离纯种平板用于分离纯种,斜面用于传代或保留细菌斜面用于传代或保留细菌 半固体半固体:加加0.5%琼脂琼脂,用于观察动力用于观察动力,保留菌种保留菌种细菌感染的实验诊疗26/58三三.主要接种方法主要接种方法l分区划线法分区划线法:用于分离纯种用于分离纯种,屡次烧灼降低屡次烧灼降低菌数菌数,以获取单个菌落以获取单个菌落l连续划线连续划线:不要求单个菌落不要求单个菌落,用于保留或繁用于保留或繁殖细菌殖细菌l涂布涂布:使细菌长成菌苔使细菌长成菌苔,可观察细菌被抑制可观察细菌被抑制情况或用于繁殖细菌情况或用于繁殖细菌l倾注平板倾注平板:少许细菌混于琼脂中倒板少许细菌混于琼脂中倒板,计数计数,分离纯种分离纯种细菌感染的实验诊疗27/58四四.细菌生长表现细菌生长表现固体基固体基:菌落形成菌落形成,注意其注意其 大小大小,形状形状 表面表面,边缘边缘 质地质地,透明度透明度 溶血情况溶血情况液体基液体基:浑浊浑浊,菌膜菌膜,沉淀沉淀细菌感染的实验诊疗28/58五五.纯种取得纯种取得l纯种是细菌学工作基础纯种是细菌学工作基础l取得方法取得方法:划线分离法划线分离法(倾注平倾注平板法板法)取得大单个菌落取得大单个菌落 斜面斜面 纯培养物纯培养物l纯培养物外观表现应是一致纯培养物外观表现应是一致细菌感染的实验诊疗29/58细菌感染的实验诊疗30/58细菌感染的实验诊疗31/58六六.培养细菌目标培养细菌目标l确定有没有细菌确定有没有细菌l判定细菌判定细菌l药敏试验药敏试验l计数细菌计数细菌l利用细菌利用细菌:制备菌苗制备菌苗,生产抗生素或生产抗生素或基因工程产品基因工程产品细菌感染的实验诊疗32/58第五节第五节l细菌代谢产物检测细菌代谢产物检测细菌感染的实验诊疗33/58一一.细菌毒素检测细菌毒素检测l内毒素内毒素:致热作用致热作用:兔体温兔体温 鲎试验鲎试验l外毒素外毒素:体内体内:毒素与抗毒素中和试验毒素与抗毒素中和试验 体外体外:Elek平板法平板法:沉淀反应沉淀反应 ELISA细菌感染的实验诊疗34/58毒素和抗毒素中和试验毒素和抗毒素中和试验 外毒素外毒素?外毒素外毒素?+已知抗体已知抗体 小白鼠小白鼠 小白鼠小白鼠结果结果 发病发病 发病发病 有毒性有毒性,但不但不是相是相 应应 发病发病 不发病不发病 是对应毒素是对应毒素 不发病不发病 不发病不发病 无毒性无毒性细菌感染的实验诊疗35/58抗毒素抗毒素待测细菌待测细菌沉淀线沉淀线Elek 试验试验细菌感染的实验诊疗36/58二二.生化反应生化反应 欲检测细菌生化反应欲检测细菌生化反应,普通普通是在适当培养基中加入被测物和是在适当培养基中加入被测物和检测其代谢产物试剂检测其代谢产物试剂,即在判别即在判别培养基中进行培养培养基中进行培养,或直接加试或直接加试剂于培养物中剂于培养物中,观察呈色等现象观察呈色等现象判定结果判定结果 细菌感染的实验诊疗37/58(一一)碳水化合物代谢试验碳水化合物代谢试验l糖糖(醇醇)发酵试验发酵试验:酸酸,气体气体l氧化氧化-发酵发酵(O/F)试验试验:l-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(ONPG)试验试验l七叶苷水解试验七叶苷水解试验l甲基红试验甲基红试验lV-P试验试验细菌感染的实验诊疗38/58(二二)蛋白质和氨基酸代谢试验蛋白质和氨基酸代谢试验l明胶液化试验明胶液化试验lIndol试验试验lUra试验试验lH2S试验试验l苯丙氨酸脱氨酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验l氨基酸脱羧酶试验氨基酸脱羧酶试验细菌感染的实验诊疗39/58(三三)碳源氮源利用碳源氮源利用l枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验l丙二酸盐利用试验丙二酸盐利用试验细菌感染的实验诊疗40/58枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验细菌感染的实验诊疗41/58(四四)酶酶l氧化酶试验氧化酶试验l过氧化氢酶试验过氧化氢酶试验l硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验l卵磷脂酶试验卵磷脂酶试验l凝固酶试验凝固酶试验lCAMP试验试验l胆汁溶菌试验胆汁溶菌试验细菌感染的实验诊疗42/58(五五)抑菌试验抑菌试验lO/129试验试验l杆菌肽试验杆菌肽试验lOptochin试验试验细菌感染的实验诊疗43/58第六节第六节感染血清学检测感染血清学检测l已知抗体检测细菌抗原用于判定细已知抗体检测细菌抗原用于判定细菌菌l已知抗原检测病人血清中抗体已知抗原检测病人血清中抗体 用于诊疗感染性疾病用于诊疗感染性疾病细菌感染的实验诊疗44/58一一.血清学判定血清学判定l了解微生物抗原结构了解微生物抗原结构l 用已知抗体检测细菌抗原组合用已知抗体检测细菌抗原组合l 特异性较高特异性较高l 多在判定最终进行多在判定最终进行l 可用各种血清学方法可用各种血清学方法,细菌多细菌多用凝用凝集反应集反应,病毒多用中和试验病毒多用中和试验细菌感染的实验诊疗45/58二二.血清学诊疗血清学诊疗l查抗体查抗体:用已知抗原用已知抗原 IgM:感染指标感染指标 IgG:效价有效价有4倍以上增高或倍以上增高或 高于当地人群水平高于当地人群水平l多用于病程较长全身性感染多用于病程较长全身性感染细菌感染的实验诊疗46/58第七节第七节感染分子生物学检测感染分子生物学检测检出病原体检出病原体DNA证实病原体存在证实病原体存在细菌感染的实验诊疗47/58一一.核酸检测用途核酸检测用途l细菌分类细菌分类l临床诊疗临床诊疗,快速判定快速判定l耐药性检测耐药性检测l毒素检测毒素检测l流行病学调查流行病学调查细菌感染的实验诊疗48/58二二.核酸检测方法核酸检测方法l G+C mol%l PCRl 限制性内切酶片段长度限制性内切酶片段长度l 核酸杂交核酸杂交细菌感染的实验诊疗49/58限制性内切酶酶切分析限制性内切酶酶切分析l限制性内切酶是能够在一定部位切限制性内切酶是能够在一定部位切开开DNADNA酶酶l一样内切酶可将相同一样内切酶可将相同DNADNA切成一样数切成一样数目标，一样大小分子量片段目标，一样大小分子量片段l电泳后对所得图谱进行分析可判断电泳后对所得图谱进行分析可判断DNADNA是否相同是否相同细菌感染的实验诊疗50/58 1989年国外某医院泌尿科年国外某医院泌尿科3周内从病人血，尿中分出周内从病人血，尿中分出8株不株不动杆菌，含有相同耐药性，经动杆菌，含有相同耐药性，经 Smal I 酶切后出现相同片段，但酶切后出现相同片段，但与环境中或其它科室分出不动杆与环境中或其它科室分出不动杆菌不一样，表明泌尿科病人是由菌不一样，表明泌尿科病人是由同一克隆引发暴发同一克隆引发暴发细菌感染的实验诊疗51/58 某医院某医院ICU病房，从水池病房，从水池和病人标本中分出多株铜绿和病人标本中分出多株铜绿假单胞菌，将其染色体假单胞菌，将其染色体DNA用用X Bal 酶切，发觉彼此之间酶切，发觉彼此之间没有共同酶切片段图谱，病没有共同酶切片段图谱，病人之间图谱也不相同，说明人之间图谱也不相同，说明这不是一次暴发这不是一次暴发细菌感染的实验诊疗52/58第八节第八节动物试验动物试验细菌感染的实验诊疗53/58一一.动物试验用途动物试验用途l 分离细菌分离细菌,获取纯种获取纯种l 检测其致病性检测其致病性,观察发病或死亡观察发病或死亡,可同可同时时加抗体进行中和试验或保护试验加抗体进行中和试验或保护试验l 制备抗体制备抗体l 诱导变异诱导变异l 建立感染模型建立感染模型l 检测生物制品安全性检测生物制品安全性 细菌感染的实验诊疗54/58二二.试验动物选择试验动物选择l多用易感小动物多用易感小动物,如小白鼠如小白鼠,豚鼠豚鼠l按需要选择按需要选择 纯系纯系,突变系突变系,杂种杂种 无菌动物无菌动物(GF),悉生动物悉生动物(GB),无特无特殊病原体动物殊病原体动物(SPF),最低程度疾病动物最低程度疾病动物(MDA),普通动物普通动物l可选取各种路径注射可选取各种路径注射,如腹腔如腹腔,静脉静脉,皮下皮下,颅内等颅内等细菌感染的实验诊疗55/58可供细菌判定方法可供细菌判定方法l形态形态:个体个体,菌落菌落,液体基生长情况液体基生长情况l生长需要生长需要:氧氧,温度温度,营养物营养物l生化反应生化反应:观察其酶活性观察其酶活性l抗原性抗原性:用已知抗体用已知抗体l致病性致病性:动物试验动物试验l核酸核酸:PCR,酶切片段长度酶切片段长度,杂交杂交细菌感染的实验诊疗56/58l界界_门门_纲纲_目目_科科_属属_种种l种是含有相同生物学特征生物聚种是含有相同生物学特征生物聚合群合群l型：生化型，血清型，噬菌体型型：生化型，血清型，噬菌体型l株：不一样起源株：不一样起源l双命名：金黄色葡萄球菌双命名：金黄色葡萄球菌 staphylococcus aureous staphylococcus sp(spp)细菌感染的实验诊疗57/58疾病病原体确实立疾病病原体确实立l分离培养出病原体分离培养出病原体l患者血清病原体抗体有四倍以上患者血清病原体抗体有四倍以上增高增高l能复制出动物模型能复制出动物模型细菌感染的实验诊疗58/58