药物开发和研究疾病模型专家讲座.pptx

疾病模型药物开发和研究疾病模型第1页第1节 概述在动物身上复制人类疾病是促进医学科学发展主要路径之一，不论在疾病发生发展机制探讨上或预防与治疗上，都起着不容忽略作用药理学上：复制疾病模型属于试验治疗学范围病理学或病生理学：复制疾病模型属于试验病理学范围药物开发和研究疾病模型第2页Lehman AJ说：药理学家工作是含有独特征，这就象多数科学家一样，他们不愿完全重复他人技术，而是在应用过程中进行各种改造。然而在评价新药安全性时，必须遵照基本原理和技术 药物开发和研究疾病模型第3页借用相关学科方法 早期：动物试验、临床观察和机遇今后：生物化学方法，如酶、受体及其亚型最近：分子生物学技术、培养哺乳动物细胞，受体和离子通道，防止了显著种属差异，但增加了生理学和病理学相关联问题现在：基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢物组学、药品基因组学等思想和方法，基因芯片、蛋白质芯片技术、组合化学原理用于药品高通量筛选 药物开发和研究疾病模型第4页面临挑战依然是体外数据和整体作用相互关联，海量数据分析、挖掘和利用体外试验简单，体内试验确实培养组织中发觉作用经常不能代表对整体器官作用药物开发和研究疾病模型第5页用适当模型发觉治疗人类疾病药品药理学模型必须含有关联性，即这些模型要能够表现出所欲得到治疗指征如从某个药理学模型中证实药品作用与人类疾病治疗结果相吻合，则这个药理学模型可认为是相关联性或相关H.Gerhard Vogel和Wolfgang H.Vogel提出模型必须符合一些基本要求：药物开发和研究疾病模型第6页模型必须对标准化合物有敏感计量依赖性特征，标准化合物是含有治疗作用物质已知作用化合物在模型中表现相关效能应该与其临床应用相关效能相比较模型应该有选择性，即已知物质在该模型中治疗指征要与药品对其它指征作用有显著区分。新化合物阳性数据可反应对病人治疗作用假如新方法所适用指征尚没有已知药品作对照，就必须要有充分证据证实该模型与所观察适应症及病理状态有相关性药物开发和研究疾病模型第7页只有整体动物才能够反应出人类疾病和生理反应复杂性。但即使是以志愿人员进行试验，依然是一个模型，是一个研究对病人治疗作用高度相关性模型各种试验方法相关程度依以下次序增加：游离分子模型(如受体和酶)、细胞器、器官、整体清醒动物、自愿人员动物试验在新药发觉和药品作用评价中是必须，也只有在必须时和认真设计以后才能进行药物开发和研究疾病模型第8页试验动物科学 试验病理学 比较病理学喂养条件(屏障设施、隔离器、超净层流架)(等级动物室)等级动物(无菌动物，germ free,GF；已知菌动物，gnotobiote,GB；无特定病原体动物,specific pathogen free,SPF；清洁动物,minimal disease animal,MD；普通动物,conventional,CV)育种：严格按照遗传学原理来设计育种方案，培育出近交系、远交系、同源系、杂交子1代、重组近交系、突变系等试验动物研究(营养、生态、疾病)，遗传监测、微生物监测 药物开发和研究疾病模型第9页1961年，NIH支持召开了比较病理学会议，(医学、兽医学和生物学教授)，强调加强试验动物病理模型研究今后30年，美国试验生物学会联合会(FASEB)、美国国家研究委员会(NRC)、国际试验动物科学学会(ICLAS)等机构相继召开了以试验动物病理模型为专题会议，出版论文集，设置研究基金1982年，美国Hegreberg 和Leathers发表了一部两卷动物模型目录，第1卷自发动物疾病模型1289篇文件，第2卷诱发动物模型2707篇文件人类疾病动物模型收载82个疾病模型复制方法药理试验方法学 一些动物模型病理生理学进展(四)介绍了一些自发性疾病模型药理学试验指南新药发觉和药理学评价(Vogel HG,Vogel WH)载近400种体内模型，部分为疾病模型药物开发和研究疾病模型第10页第2节 动物模型分类和产生、保种方法试验动物病理模型按其产生原因，可分为诱发和自发两大类诱发模型是指研究者经过使用物理、化学和生物致病原因人工地诱发动物发生特定疾病自发模型指不加任何人工伎俩而动物自然发生疾病，如中国仓鼠自发糖尿病、山羊家族性甲状腺肿和小鼠自发性肿瘤药物开发和研究疾病模型第11页诱发动物病理模型优点：能依据研究者需要在短时间内复制出大量疾病模型，为近代研究所惯用，尤其是药品筛选多用诱发动物模型不足：诱发病理模型和自然产生疾病毕竟在一些方面有所不一样(如诱发肿瘤和自发肿瘤对药品敏感性有差异，动物酒精性肝纤维化不如人类酒精性肝纤维化程度重)，有些人类疾病至今尚不能用人工方法在动物身上诱发最近十分重视对自发动物病理模型研究药物开发和研究疾病模型第12页自发动物病理模型优点：自然条件下产生疾病，有较大理论和实际意义不足：往往是散发，不易被人们检出并加以利用；甚至被人们看成不健康动物而丢弃各国都重视试验动物模型开发后，才注意保留和利用Jezyk试验室曾对6000只狗和猫进行检验，以期发觉先天性代谢缺点病模型药物开发和研究疾病模型第13页发觉动物自发遗传病后，如欲把病理模型保留下来，并培育成含有一定遗传特征突变系，必须以近代遗传学知识为基础，制订出一套育种方法人为地引发某种基因缺失，如knock-out小鼠、大鼠；或人工导入某种基因，诱发某种疾病状态，用于药品作用确实证和作用机理研究药物开发和研究疾病模型第14页第3节 自发动物病理模型(一)心血管系统1.动脉粥样硬化 以高脂高胆固醇饮食诱发家兔动脉粥样硬化：仅在血脂极度增高情况下才产生动脉粥样硬化；局部病理改变与人不一样(人动脉内膜损伤和中层增生；人动脉病变在大动脉远侧端)；兔是草食动物。猪、狗、大鼠、鸡、鸽、猴等都能产生自发或诱发动脉粥样硬化：小型猪发生AS与人类很相同；一些老龄猪饲以残羹剩饭后，能产生大动脉、冠状动脉和脑血管粥样硬化病变。鸽AS与人很相同，甚至冠状动脉狭窄和心肌梗死药物开发和研究疾病模型第15页非人灵长类动物模型有很大优越性：分类学地位、杂食特征、解剖结构、代谢特点、局部组织病理、临床特征均与人类近似。如猕猴食饵性粥样硬化，病变广泛(大动脉、冠脉、脑、肾动脉)，甚至肾性高血压，病变和年纪关系十分显著(主动脉病损范围幼猴为0.25%,老龄猴7.5%)。猴自发性AS随增龄而发病率增加。食蟹猴是研究冠状动脉梗塞和心肌梗塞良好模型动物。黑猴可用于研究粥样硬化和糖尿病之间关系。松鼠猴惯用于研究与遗传相关发病原因。非人灵长类是研究人类动脉粥样硬化最好动物模型药物开发和研究疾病模型第16页2.高血压 大鼠、小鼠、兔、狗、猴均可发生自发性高血压。已培育成突变系高血压大鼠：日本SHR大鼠、美国Dahl大鼠、法国Lyon大鼠和意大利Milan大鼠，以SHR大鼠应用最广。SHR系，在出生后几个月内几乎100%发生自发性高血压，可达200mmHg以上，与人类原发性高血压相同，并可发生脑血栓形成、梗死、出血、肾硬化、心肌梗塞和纤维化。以SHR为基础2个亚系：易发生脑卒中亚系(stroke-prone SHR,SHRSP)，快速发生严重高血压，90%以上出现脑出血和脑栓塞；抗脑卒中自发性高血压大鼠(stroke-resistant SHR,SHRSR)，不易发生脑卒中；自发性血栓形成大鼠和心肌缺血大鼠药物开发和研究疾病模型第17页高血压模型高血压模型（SHR大鼠）大鼠）肥胖模型肥胖模型（Zucker大鼠）大鼠）糖尿病模型糖尿病模型GK大鼠大鼠肥胖并糖尿病肥胖并糖尿病模型模型（db/db小鼠）小鼠）药物开发和研究疾病模型第18页3.心肌病 可见于猫、狗、仓鼠、火鸡多见于成年猫和狗(突然起病，呼吸困难、收缩期杂音伴奔马律、心脏扩大、肺水肿、EKG异常、左室舒张期末压力高)半数病猫发生主动脉血栓栓塞金黄仓鼠心肌病呈常染色体隐性遗传，为一个自发肌肉病变和心肌衰竭模型(病变早期见心肌组织溶解，晚期有单核细胞浸润和心肌内纤维组织增生，最终死于心力衰竭)，寿命仅正常者1/3火鸡中发觉心肌病损与猫和人缩窄性心肌病相同(左心室肥大、扩张、心内膜纤维化，类似C型病毒颗粒)药物开发和研究疾病模型第19页(二)呼吸系统1.慢性支气管炎和肺气肿 马、兔、大鼠、小鼠均可自发性肺气肿。花斑鼠可自发性进行性全小叶肺气肿，有遗传性弹力蛋白合成缺点而造成弹力组织网发育缺点，此将肺气肿病因与一些遗传性缺点联络起来大鼠、小鼠定时吸入SO2引发慢支。SO2、烟雾、甲醛蒸气、辣性气体可诱发猴、兔、大鼠、小鼠慢支。烟草燃烧和SO2混合熏蒸4个月引发猕猴慢支药物开发和研究疾病模型第20页2.过敏性肺炎 农民肺(farmers lung)，因为吸入长有霉菌干草灰尘而急性发作过敏性抗原物质(霉菌孢子、干燥霉菌、昆虫碎片、鸟粪颗粒)牛、马、猴，血清中有抗体，肺泡间隔有广泛淋巴细胞、浆细胞、间质细胞浸润 惯用家兔造模(因易于产生和检出沉淀素)药物开发和研究疾病模型第21页(三)消化系统猪和非洲啮齿类自发性胃溃疡豚鼠诱发性结肠溃疡花斑小鼠自发性巨结肠仓鼠肝淀粉样变性羊和大鼠先天性高胆红素血症South Down变种羊，先天性肝摄取有机阴离子(如胆红素)缺点，血中未结合胆红素增高，与人类Gilbert综合征相同Gilbert syndrome:因肝细胞摄取非结合胆红素障碍及微粒体内葡萄糖醛酸转移酶不足所致。Gilbert综合征是最常见家族性成人遗传性非溶血性黄疸。患者除有黄疸外,多无其它症状,或仅有乏力、消化不良、肝区不适等。感染、手术、酗酒、妊娠等可诱发或加重黄疸。血清非结合胆红素增高,红细胞脆性正常,肝功效检验正常。普通无需特殊治疗,预后良好药物开发和研究疾病模型第22页Corriedale羊遗传性缺点，为有机阴离子从肝细胞内排入胆汁障碍，与人类Dubin-Johnson综合征类似。适合用于研究人类遗传性肝病及肝内胆红素形成、转变和排泄 Gunn大鼠(是Wistar大鼠突变系)，存在慢性非溶血性未结合胆红素血症，葡萄糖醛酸酶活性缺点以致胆红素醛酸盐形成障碍，与人类Crigler-Narjjar综合征相同。是研究胆红素代谢、肠内醛酸盐形成及核黄疸极好模型Dubin-Johnson综合征是慢性良性间歇性黄疸。由肝细胞先天性缺点,使结合胆红素不能在肝内运转,也不能被排出细胞外,致血清结合胆红素增高、尿中胆红素阳性。还存在分泌非水溶性有机阴离子(如BSP、碘造影剂、雌激素)障碍,此为Dubin-Johnson综合征所特有表现。口服胆囊造影剂时,75%患者胆囊不显影,显影者也甚暗淡;静脉法造影时有半数不显影。此病多在青少年时期被发觉,有显著家族背景。患者多无自觉症状,或偶有乏力、肝区不适。约半数病人肝脏轻度肿大,如行肝活组织检验可发觉肝细胞内有弥漫性棕色色素颗粒。本病无需任何治疗,预后良好,并不演变为慢性肝病药物开发和研究疾病模型第23页(四)泌尿系统注射异种抗肾血清、大量异种血清、细菌抗原与肾组织复合抗原，抗原抗体复合物，可诱发兔、羊肾小球肾炎屠宰场羊患增生性肾炎百分比高，牛和山羊亦见类似损害。芬兰Landrace羊羔中可见一个进展快速并致死肾小球肾炎伴肾小球免疫复合物沉积，与人类系膜-毛细血管性肾炎(mesangial-capillary nephritis)相同。灵长类中，濑猴患膜性肾炎，食蟹猴和枭猴可出现自发性肾小球肾炎改变(肾活检)，狗和猫可见自发性免疫性肾炎药物开发和研究疾病模型第24页(五)内分泌与代谢1.糖尿病 在小鼠、大鼠、中国仓鼠、沙漠鼠、猫、狗、猴均可见，包含自发和诱发模型Wistar大鼠自发性糖尿病模型(bb)与人少年型糖尿病最为相同(中度或显著糖尿、酮尿、多尿、体重减轻、血糖升高达800 mg%、高酮血症、低胰岛素血症01 ng/mL、胰高血糖素过多、无肥胖症、胰岛细胞破坏显著)，对胰岛素治疗反应良好，寿命较非糖尿病鼠短BB大鼠是和本身免疫性毁坏胰腺细胞胰岛炎以及胰岛素缺乏相关自发性糖尿病模型(60120周龄时突然发病；数天后出现严重高血糖、低胰岛素和酮血症，除非开始胰岛素治疗)，用胰岛素治疗，用免疫抑制剂预防，对病鼠可移植纯化胰岛细胞B!oBreedin(BB)大鼠是一个白发性、遗传性糖尿病动物模型，l974年在加拿大渥太华BioBreedin试验室首次发觉，并以该中心字母缩写来命名药物开发和研究疾病模型第25页近交系Wistar老龄雄大鼠、WBN/Kob大鼠，有自发性高血糖、糖尿和葡萄糖耐量降低(雄大鼠12周龄时胰岛大小与数目降低，12周龄时围绕退化胰岛和胰管周围胰腺组织中出现纤维性渗出与变性，21周龄时出现葡萄糖耐量降低和糖尿)Cohen糖尿病大鼠表现为高血糖、糖尿、高胰岛素血症，然后发展为低胰岛素血症、胰岛素抵抗和胰岛素受体数目和敏感性降低，喂以富含蔗糖或精制糖又缺乏铜元素饲料大鼠形成显著糖尿病及其并发症，但喂淀粉或粗料时则不发病药物开发和研究疾病模型第26页Zucker肥胖大鼠是经典高胰岛素血症肥胖模型。肥胖是因为单常染色体隐性基因，在幼时发病，表现为轻度葡萄糖耐量降低、高胰岛素血症和外周胰岛素抵抗，类似人非胰岛素依赖性糖尿病，但其血糖水平终生是正常幻灯片 18药物开发和研究疾病模型第27页WDF/Ta-fa大鼠通常指Wistar肥胖大鼠，是从Zuker大鼠脂肪基因转至Wistar Kyoto大鼠而得到遗传性肥胖高血糖大鼠，表现为肥胖、高胰岛素血症、葡萄糖耐量降低、高脂血症和多食症均类似Zuker大鼠，但存在更差葡萄糖耐量和更大胰岛素抵抗 通常雌鼠不出现高血糖，但饲料中添加蔗糖则可诱发。用吡格列酮激活Wistar肥胖大鼠胰岛素受体激酶可增强胰岛素敏感性eSS大鼠是Tarres等1981年发觉一个大鼠种群中发生自发性糖尿病大鼠。2月龄以上eSS大鼠葡萄糖耐量试验异常，但属轻型糖尿病，并不降低寿命；6月龄大鼠出现胰岛结构破坏和基质纤维化药物开发和研究疾病模型第28页SHR肥胖大鼠是由Koletsky(1973,1975)将Kyoto-Wistar自发性高血压雌大鼠和正常血压Spraque-Dawley大鼠交配育成，经数代选择性繁殖，出现高血压、高脂血症，一部分大鼠发生胰岛极度肥大、高血糖、糖尿SHR/N-cp大鼠：先天性糖尿病SHR/N-cp大鼠是由具肥胖基因(cp/+)杂合子雄大鼠和Okamato雌大鼠交配育成。最少12次逆代杂交后，纯合子(cp/cp)SHR/N-cp大鼠出现肥胖、轻度高血压、高胰岛素血症和葡萄糖耐量降低药物开发和研究疾病模型第29页BHE大鼠种群由宾夕法尼亚州立大学品系黑白头巾鼠和耶鲁品系白大鼠交配而来。只有在成熟期才发生糖尿病。50日龄时有高胰岛素血症、葡萄糖耐量降低、胰岛素抵抗，而后高胰岛素血症减轻，胰腺中胰岛素贮量降低，出现轻度高血糖和高脂血症 药物开发和研究疾病模型第30页自发性糖尿病小鼠：KK小鼠，KK-Ay小鼠，NOD小鼠，Wellesley小鼠。NZO小鼠，高血糖肥胖小鼠，糖尿病小鼠(db/db)(从C57BL/KsJ品系小鼠自发常染色体隐性突变衍化而来，严重糖尿病症状包含早发高胰岛素血症、体重下降、早死，以及显著肾病)中国仓鼠遗传性糖尿病：血糖从正常110mg%升至600mg%，严重多尿、糖尿、酮尿和蛋白尿。胰岛素和口服降糖药有效。胰腺、肝、肾组织可见病理改变，胰岛数目降低，剩下胰岛细胞异常 药物开发和研究疾病模型第31页沙漠鼠：北非和近东沙漠地带，经23月喂养而发病，糖尿病严重程度不一样，重者死于酮血症。疾病中期胰岛细胞脱颗粒，继之细胞变性、坏死，产生胰岛素缺乏和酮尿猫自发性糖尿病，多发于89岁，主要病理改变是胰岛淀粉样变性，相当于人成年型糖尿病非人灵长类黑猩猩糖尿病发病率随年纪而增加，胰岛呈淀粉样变性，类似成人型糖尿病。严重猿猴糖尿病可伴发动脉粥样硬化和白内障 药物开发和研究疾病模型第32页2.尿崩症 神经原性(下丘脑-垂体功效障碍，抗利尿激素分泌不足)尿崩症，呈常染色体半隐性遗传，Brattleboro大鼠患此病，患鼠天天饮水量10倍于正常鼠，纯合子鼠尿量为体重70%(正常鼠为3%)，注射抗利尿激素可纠正肾原性尿崩症(不能建立正常肾皮质乳头渗透压梯度和反抗利尿激素反应性降低)可见于小鼠，因尿液浓缩和水分排泄遗传性缺点而呈不一样程度多尿症状 药物开发和研究疾病模型第33页3.其它内分泌障碍 狗和兔肾上腺皮质功效亢进症，狗和小鼠垂体性侏儒，羊、山羊和牛家族性甲状腺肿，小鼠和大鼠睾丸雌性化(雄性假两性畸形)山羊家族性先天性甲状腺肿是一个常染色体隐性遗传病(呆滞、皮毛粗糙、毛稀少而皮肤厚，甲状腺功效低下，甲状腺球蛋白含量降低，甲状腺腺泡缩小，腺上皮细胞变高，腺泡内无胶性蛋白液)，甲状腺球蛋白合成障碍睾丸雌性化模型TFM大鼠和TFM/Y小鼠是2株研究雄激素及其受体有用突变系，呈X连锁隐性遗传，为染色质内受体部位缺点引发受体病药物开发和研究疾病模型第34页(六)免疫系统1.原发性免疫缺点病(1)B淋巴细胞缺乏：马无球蛋白血症、鸡异常球蛋白血症、免疫缺点CBA/N小鼠及遗传性无脾小鼠。其中马无球蛋白血症(雄性，用各种抗原免疫均无特异性抗体产生，淋巴结内没有原发滤泡及生发中心，也无浆细胞产生)，是与人Bruton氏症对应动物模型(2)T淋巴细胞缺乏：裸小鼠、免疫缺点无毛豚鼠、丹麦黑牛变种药物开发和研究疾病模型第35页裸小鼠(nu/nu)：Flanagan于1966年首先发觉并报道无毛突变小鼠胸腺不发育和免疫功效缺损，为常染色体隐性遗传缺点，第3对鳃弓和鳃囊发育缺点，纯合子胸腺发育不良，皮肤无毛裸小鼠缺乏TH淋巴细胞，对胸腺依赖抗原不产生抗体，不产生细胞毒T细胞，对促细胞分裂剂几无反应，对同种移植物和异种移植物无排斥反应，无宿主抗移植物反应，广泛用于人类肿瘤组织移植试验裸小鼠T细胞缺乏与胸腺发育不良或缺乏相关 药物开发和研究疾病模型第36页裸大鼠(rnu/rnu)：1953年在英国Rowett Research Institute发觉有触须，皮肤有稀疏毛，胸腺发育不良但有一定数量T细胞免疫功效严重缺损，脾淋巴细胞对促有丝分裂剂及胸腺依赖抗原不起反应，淋巴结细胞对PHA和ConA起反应同种皮肤移植可被接收，而异种皮肤移植可能被接收或排斥，对异种肿瘤移植普通可被接收体型较大，可接收裸小鼠难以接收手术，对不宜环境耐受力较小鼠强药物开发和研究疾病模型第37页无毛免疫缺点豚鼠：体形小，皮皱、毛干、触须短，胸腺发育不良或缺如，对移植排斥反应推迟，低球蛋白血症，对病毒感受性增加丹麦黑牛突变型 为常染色体隐性遗传。病牛胸腺、淋巴结和脾T细胞缺乏，细胞免疫显著抑制，而免疫球蛋白水平及免疫后抗体滴度正常。患牛口服ZnO或ZnSO4后可完全恢复(皮损痊愈，淋巴组织发育正常，对DNCB(二硝基氯苯)和结核菌素反应也恢复)，如停顿摄Zn2+，则13周后复发，故此种免疫缺点病与体内Zn2+缺乏(肠吸收Zn2+先天性缺点)相关。此模型与人肠胃型肢皮炎相同，也可用于研究Zn2+在细胞免疫和胸腺功效中作用 药物开发和研究疾病模型第38页(3)T、B淋巴细胞缺乏(联合免疫缺点)：见于阿拉伯马驹、N:NIH(S)11-nu/nu小鼠及Motheaten小鼠在美国出生阿拉伯马驹约有2%患联合免疫缺点病，出生时正常，野外条件下5月龄便死亡，严重呼吸道(马腺病毒和肺囊肿病毒)感染症状，重度淋巴细胞(包含B细胞)缺乏，不能合成免疫球蛋白，T细胞显著降低乃至测不到，皮肤延迟过敏反应和对PHA反应减弱或缺如，对同种异体淋巴细胞无反应，用于研究小儿联合免疫缺点病及其试验性治疗，研究免疫缺点与代谢缺点关系 药物开发和研究疾病模型第39页2.本身免疫病 新西兰小鼠(NZBNZW)F1杂交系中，有一个严重进行性病变过程，常引发肾功效衰竭、死亡，有免疫复合物沉积于肾小球基底膜，检测到抗组织细胞和抗核抗体，此模型与人系统性红斑狼疮相同，可用于研究红斑狼疮环境和遗传原因狗可见类似模型，出现类似慢性肾炎肾损害狗和鼠自家免疫性溶血性贫血狗和马特发性血小板紫癜狗类风湿性关节炎鸡和大鼠自家免疫性甲状腺炎狗重症肌无力症和寻常性天疱疮 药物开发和研究疾病模型第40页(七)肿瘤化学致瘤，病毒诱发，移植性肿瘤(八)传染病九带犰狳体温低(32-35)，对低氧负荷耐受性好，麻风杆菌接种于其皮下和足趾间(九)遗传病遗传病模型突变系先天性代谢缺点动物，如各种先天性溶酶体贮积病(糖原贮积症、神经磷脂增多症、高雪氏病、尼曼匹克氏病、粘多糖贮积病)药物开发和研究疾病模型第41页第4节 诱发动物病理模型一、分类1.动物模型、细胞模型 体内模型、体外模型2.器官、组织、细胞、分子、基因、功效基因、mRNA、蛋白质、非蛋白质分子、基因敲除、基因导入药物开发和研究疾病模型第42页二、动物模型特点、标准与人类疾病相同而不相同用作研究人类疾病动物模型有效性是选择动物模型最主要标准可行性、稳定性、标准性、相同程度三、怎样模拟1.全模拟 用NIN小鼠腹腔接种细粒棘球蚴和多房棘球蚴原头节制成包虫病动物模型,以包虫囊湿囊重和囊重抑制率进行药效学评价小鼠或家兔血吸虫病肝纤维化模型药物开发和研究疾病模型第43页2.病因上 体质量20-25kg1年期雄性健康小香猪16只,以标准大肠杆菌由右侧颈内静脉迟缓注入,分别于注入大肠杆菌前及注入后1、3、5、7h检测血清内毒素、血常规、血气分析、血生化,同时统计动脉压及平均动脉压(MAP)、心率(HR)、体温及呼吸频率。结果:注入大肠杆菌3h后,动物100%出现内毒素血症,5h后全部出现MODS,制模成功多原因随机性慢性刺激引发慢性应激/抑郁症移植性肿瘤模型我国已建立小鼠可移植肿瘤株10余种1969年Rygarrd首次用人结肠癌移植于裸小鼠取得成功；直肠癌、黑色素瘤、鼻咽癌、骨肉瘤、胰腺癌、胃癌、结肠癌等百余种；我国建成人类肿瘤裸鼠移植瘤数十种药物开发和研究疾病模型第44页病毒诱发肿瘤模型当前几乎全部禽类肿瘤和小鼠肿瘤以及部分其它动物肿瘤均可用肿瘤无细胞滤液诱发，电镜下可见滤液中有病毒颗粒，应用无细胞滤液或病毒培养物可将动物肿瘤传递下去，并可诱发其它种类动物新肿瘤模型，如Rous鸡肉瘤病毒动物肿瘤病毒：RNA病毒和DNA病毒，仅小鼠白血病病毒就多于14种化学致瘤物诱发动物肿瘤模型 多环碳氢化合物、氨基偶氮染料、芳香胺、亚硝胺黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2等重金属农药药物开发和研究疾病模型第45页3.病理过程上 80只Wistar大鼠,雌雄各半。分别采取复合原因法、四氯化碳(CCl4)加乙醇法及玉米面、胆固醇加乙醇法建立大鼠肝硬化模型(假小叶形成为判定CM成功唯一标准)。复合原因法:40只大鼠,饲料为80%玉米面、20%动物油药物开发和研究疾病模型第46页 、0.5%胆固醇,饮料仅为15%酒精,首次sc注射40%CCl4-橄榄油溶液5mLkg-1(以下浓度相同),以后每3d皮下注射CCl4 3mLkg-1。第6周末随机处死6只大鼠做肝脏病理,均符合肝硬化诊疗标准。将余下存活26只(逃逸2只、死亡6只)随机分为两组,每组13只均正常喂养,其一组每7d sc注射3mLkg-1CCl4,观察第7、8周末病理改变。CCl4加乙醇法:20只大鼠,以正常饲料喂养,余条件同复合原因法前6周。玉米面、胆固醇加乙醇法:20只大鼠,不用CCl4,余条件同复合原因法前6周。结果:复合原因法6周末处死6只大鼠均形成CM,成模后正常喂养,2周后假小叶均消失,而继续应用CCl4 2周后，大鼠假小叶基本存在。其余2种方法药物开发和研究疾病模型第47页 大鼠均未见经典肝硬化改变4.临床表现上5.处理方法上：病原生物、异种蛋白、药品、手术等血吸虫尾蚴经皮肤感染引发小鼠或大耳白兔肝纤维化BSA、HAS、ConA分别引发大鼠、小鼠肝纤维化，ConA也引发急性肝损害CCl4、DMN引发大鼠肝纤维化、DMN和黄曲霉毒素等诱发肝癌、酒精引发慢性肝损害、D-氨基半乳糖和CCl4引发急性肝损害胆管结扎引发黄疸及肝纤维化药物开发和研究疾病模型第48页药物开发和研究疾病模型第49页四、怎样选择动物1.首先应考虑试验目标和要求2.动物是否轻易取得、经济、轻易喂养和管理3.注意试验动物种类(species)、品种(breed)或品系(strain)、健康状态4.选择与人类机能、代谢、结构以及疾病特点相近似动物猴、狒狒、猩猩、长臂猿等灵长类动物是最近似于人类理想动物猕猴、红面猴和熊猴是研究脊髓灰白质炎、脑炎、痢疾、肝炎、麻疹等疾病理想试验动物，也是放射医学、口腔医学、病毒学、妇产科学、胚胎学、外科学、病理学、生理学、免疫学等试验研究及药品毒理、营养、行为研究良好动物 药物开发和研究疾病模型第50页猕猴对人痢疾杆菌和结核杆菌最易感染，是肠道杆菌病和结核病很好动物模型猕猴生殖生理与人非常靠近，月经周期和人一样为28天左右，是研究人类避孕药理想动物猕猴是制造和检定脊髓灰白质炎疫苗唯一试验动物原猴类动物树鼩信贷代谢过程较狗、鼠类更与人相同，大致解剖和生理功效方面也与其它灵长类相同；在乙型肝炎和睡眠生理研究有主要用途；还能自然感染和试验感染单纯疱疹病毒；适合用于人疱疹病毒研究药物开发和研究疾病模型第51页狗含有发达血液循环和神经系统以及与人基本相同消化过程，在药理方面研究和人比较靠近，适合用于外科、营养、药理、毒理、生理、行为等研究猪皮肤结构与人相同，上皮修复性再生、皮下脂肪层及烧伤后内分泌与代谢等也相同，选取小猪皮敷盖人烧伤后创面，降低患者疼痛、感染，无排斥反应、血管联合好，愈合速度较快蛙适合用于简单反射弧试验药物开发和研究疾病模型第52页5.选取遗传背景明确；含有已知菌丛或无菌动物纯系动物存在遗传规律性、反应一致性、试验结果准确可靠使动物试验结果有规律性清洁级是最基本要求；SPF级优先6.选取解剖、生理特点符合试验目标要求试验动物狗甲状旁腺位于甲状腺表面，位置比较固定；家兔甲状旁腺分布比较散，位置不固定，除甲状腺周围外，甚至到主动脉弓附近，故作甲状旁腺摘除试验应选择狗；作甲状腺摘除试验如要保留甲状旁腺功效，则应选取兔药物开发和研究疾病模型第53页猴气管腺数量较多，直至三级支气管中部仍有腺体存在，用于慢性支气管炎模型或祛痰平喘药疗效试验较适当家兔颈部交感神经、迷走神经和主动脉减压神经是分别存在、独立走行，如要观察减压神经对心脏等作用，就必须用家兔地鼠颈部颊囊是缺乏组织相容性抗原免疫特殊区，适合用于作免疫学、组织培养、肿瘤学和微循环功效等试验研究乌贼骨有一条巨大神经，足以允许把一个微电计插入其内，适合用于做神经纤维膜电位和动作电位试验 药物开发和研究疾病模型第54页7.选取含有一些特殊反应动物家兔对体温改变十分灵敏，适合用于发烧、解热和检验致热源等试验鸽子、狗、猴、猫呕吐反应敏感，适于作呕吐试验金黄地鼠和豚鼠对各型钩端螺旋体敏感，适合用于钩端螺旋体病研究大鼠垂体-肾上腺系统功效发达，应激反应灵敏，适合用于作应激反应和垂体、肾上腺、卵巢等内分泌试验大鼠肝再生能力强，适合用于肝外科研究大鼠对炎症反应灵敏，踝关节对炎症反应更敏感，适合用于多发性关节炎和化脓性淋巴腺炎研究药物开发和研究疾病模型第55页也适于中耳疾病和内耳炎研究大鼠是化学物质致畸最敏感动物，适合用于畸胎学研究豚鼠易于致敏，适于做过敏性试验研究家兔、鸡、鸽、猴食用高胆固醇、高脂肪饲料一定时间后轻易形成动脉粥样硬化病变，适合用于动脉粥样硬化试验研究药物开发和研究疾病模型第56页8.选择试验动物时既要考虑其特殊要求也不能忽略普通要求年纪体重：幼年动物较灵敏；通常选成年动物进行试验；慢性试验时，可选择年幼、体重较小动物 成年试验动物：小鼠1828 g，大鼠180280 g，豚鼠350650 g，家兔23 kg，猫1.52.5 kg，狗315 kg动物性别：普通应优先选取雄性动物或雌雄各半做试验；动物性别不影响试验结果试验或一定要用雌性动物试验例外健康状态：一定要选取健康动物做试验；应没有该动物所特有疾病，如小鼠脱脚病、肝炎和肺炎、鼠伤寒 药物开发和研究疾病模型第57页试验季节和昼夜过程：如狗在春夏两季受辐射后死亡率比秋冬高；普通放射敏感性白天低、夜间高；体温、血糖、基础代谢率、内分泌激素等皆有昼夜节律性改变试验重复和必定：在必定一个试验结果时最好采取2种以上动物进行比较观察，其中一个应该是非啮齿类动物由动物试验结果要外推到人试验，所选取动物品种应不少于3种，而且其中之一不应是啮齿类动物惯用生物序列是：小鼠大鼠 狗(猴)药物开发和研究疾病模型第58页五、怎样选择指标1.形态指标、生化指标、功效指标、行为指标等2.金指标、普通指标将雄性Bcl-2高表示转基因小鼠(Bcl-2 transgenic mice)和受GFAP开启子控制表示疱疹病毒-胸苷激酶转基因雌性小鼠(GFAP-TK)交配产生4只812周成年小鼠(2030g),Bcl-2/GFAP-TK双转基因小鼠作为试验组,同周龄4只Bcl-2转基因小鼠作为对照组。其中Bcl-2/GFAP-TK双转基因小鼠皮下植入缓释泵,连续7d释放更昔洛韦(GCV)100mgkg-1d-1选择性地去除视神经损伤后激活星形胶质细胞。更昔洛韦缓释泵植入术后2d在两组动物中制作右侧单眼标准完全药物开发和研究疾病模型第59页 性视神经钳夹损伤模型,视神经钳夹10d后获取组织标本。采取免疫荧光染色特异性检测再生轴突纤维并进行定量分析，结合罗丹明霍乱毒素B亚单位(CTB-R)或增强表示绿色荧光蛋白复制缺点型腺相关病毒(AAV-EGFP)为标识物以显示再生轴突是否抵达大脑靶器官。结果:在Bcl-2/GFAP-TK双转基因小鼠中存在免疫荧光阳性再生视神经轴突,再生轴突计数为71.9924.04,并可见生长锥(growth cone)样结构,不过再生轴突纤维未能延伸抵达大脑靶器官。在对照组Bcl-2转基因小鼠中未见显著再生迹象 药物开发和研究疾病模型第60页自体血注入和胶原酶注入大鼠尾状核建立脑出血模型是当前国内外使用最多两种脑出血模型。但自体血注入法在取血过程中需控制在3min内完成,不然血液凝固；注血过程中血液大多从进针处冒出,血肿大小很不稳定；神经功效损伤不明，Bederson评分普通在2分左右。但血肿周围水肿带比较显著,所以该模型可用于脑水肿机制、药品疗效及其作用机制研究。胶原酶注入法:由胶原酶诱导大鼠尾状核脑出血模型所产生脑出血以渗出为主,出血量大,产生血肿大小基本一致,而且神经功效障碍比较显著,Bederson评多在4分左右，是比较惯用疾病动物模型 药物开发和研究疾病模型第61页肝纤维化模型1.造模原因：(1)化学毒物：如CCl4、DMN；(2)生物原因：血吸虫尾蚴、细菌细胞壁、异种血清、异种动物蛋白、刀豆球蛋白(concanavalin A)；(3)机械原因：如结扎胆管2.指标(1)生物化学指标，如肝hydroxyproline(2)组织形态学指标，如肝组织切片HE染色、胶原染色、免疫组化(3)血清学指标，如HA,PIIIP,IV Col,LN(4)细胞学及分子生物学指标(5)各种反应模型产生与药品作用机制指标 药物开发和研究疾病模型第62页第5节 新方法介绍 转基因动物(transgenic animal)没有新筛选模型，就没有新型药品转基因动物指体内基因组中稳定地整合有外源性基因动物，转基因动物技术发展，使人为对动物基因组进行遗传修饰成为可能转基因动物一个较为严谨概念是：“外源DNA”导入(包含同一物种DNA)动物基因组而产生了能够遗传改变药物开发和研究疾病模型第63页转基因动物就是把外源性目标基因导入动物受精卵或其囊胚细胞中；然后注入受精卵任何一个前核，并在细胞基因组中稳定整合，再将合格重组受精卵或囊胚细胞筛选出来；采取借腹怀孕法寄养在雌性动物（foster mother）子宫内,使之发育成能表示目标基因胚胎动物,并能传给下一代。这么，生育动物为转基因动物。这类动物因为外源性目标基因稳定存在而赋于子代动物个体药物开发和研究疾病模型第64页这些能够遗传改变包含：外源DNA片段最少整合到一条染色体一个位点上外源DNA插入使基因组中任何一个基因结构发生改变外源DNA插入使染色体发生重排导入能够持久存在遗传实体，如一条人工染色体或者能够自我复制并传递给子细胞非染色体DNA元件不属于转基因动物范围其它伎俩：因为化学品诱变作用造成基因发生改变因为辐射作用造成基因发生改变因为化学品或辐射作用使染色体发生畸变经过核移植交换遗传物质使用基因治疗技术导入DNA药物开发和研究疾病模型第65页转基因动物在基础生物学研究和医学及农业应用研究上有其独特作用，不可能被其它方法所取代研究基因功效和基因间互作，最有效伎俩是基因剔除技术和把人工修饰后基因序列定向地整合到它原来基因座上基因定向整合只能在细胞中完成，经过基因修饰细胞需要变成动物，只有在活动物体才能观察和检验基因功效“多莉”技术表明：动物体上各种类型体细胞都能够经过克隆变成动物个体，再没必要研究胚胎干细胞，体细胞培养条件比胚胎干细胞简单很多体细胞核移植技术为基因结构、功效和表示调控研究提供了飞速发展基本条件药物开发和研究疾病模型第66页体细胞克隆技术出现，使我们能够能动地改进动物基因组，应用基因工程伎俩培育动物优良品种使用基因定向转移技术，在基因座上对基因结构部分和调控部分进行修改，并把这种经过基因修改细胞变成动物个体取得理想基因修饰细胞能够大量繁殖，并使用它们克隆出一批动物在基因座上对基因进行修改相当于一个自然发生有利突变，并可成批生产基因定向转移和体细胞克隆，是生命科学中两项重大技术，二者结合就取得了按照事先设计，有计划地修改动物基因组能力药物开发和研究疾病模型第67页转基因小鼠技术广义转基因小鼠技术是指将外源基因导入到小鼠组织细胞内，并发挥作用过程将外源基因导入到小鼠体内，而且导入基因能够经过遗传传给子代(将SV40病毒DNA注射到小鼠囊胚腔中；小鼠受精卵原核DNA显微注射)明确了2个概念：导入基因能够在小鼠体内表示并发挥作用；人类基因一样能够在小鼠体内发挥与原来相同或相同作用应用或意义：研究导入基因表示产物体内功效；建立疾病动物模型；进行基因表示调控研究如特定基因表示时空特征；结合反义技术和RNAi技术，用于专一性抑制小鼠体内特定基因表示药物开发和研究疾病模型第68页u转基因小鼠试验内容：导入基因表示载体构建；转基因小鼠建立和判定；转基因小鼠品系繁复；表型判定药物开发和研究疾病模型第69页小鼠基因剔除技术 指利用细胞内染色体DNA能够与导入细胞外源DNA在相同序列区域内发生同源重组现象，在小鼠胚胎干细胞(ES细胞)中定点破坏内源基因，而后利用ES细胞发育全能性，取得从ES细胞发育而来带有预定基因缺点杂合子小鼠，经过遗传育种最终取得目标基因纯合缺点小鼠个体u1981年Evans和Martin等利用小鼠胚胎内细胞团建立体外能够连续扩增和传代含有发育全能性胚胎干细胞即ES细胞uRobertson等对ES细胞进行转基因操作，并取得ES细胞起源小鼠个体药物开发和研究疾病模型第70页u1988年Thomas等在ES细胞中利用DNA同源重组原理实现了对预定基因进行缺失突变(基因打靶)，基因剔除技术正式建立u1993年Gu等将Cre-LoxP系统用于ES细胞打靶，建立了条件性基因剔除和基因敲入(gene knockin)技术建立一个基因剔除小鼠步骤：基因打靶载体构建ES细胞DNA转染和基因剔除阳性细胞克隆筛选ES细胞囊胚注射和胚胎移植嵌合小鼠及基因剔除杂合子小鼠取得纯合小鼠取得及表型研究药物开发和研究疾病模型第71页制备免疫缺点型动物模型，用于免疫性疾病及抗肿瘤和抗感染药品研究制备各种与人类对应遗传病含有最靠近遗传改变转基因小鼠，并利用基因敲除(geneknock-out)技术完全排除其它基因影响，准确检测遗传改变所造成结果，研究致病基因功效，说明结构、功效及在染色体上定位药物开发和研究疾病模型第72页利用基因工程方法将致病基因导入胚胎，诱发带有特殊病种动物模型，如将乙肝病毒核酸基因导入小鼠生殖细胞，得到筛选抗肝炎药品模型转基因大动物提供了一个生产特殊药品生物工厂(bio-factories)，即在转基因动物乳汁中生产药用蛋白质，如能分泌1-抗胰蛋白酶(ATT)转基因绵羊；可分泌人tpA转基因山羊；如抗凝血酶，磷脂蛋白、血红蛋