酶的生物合成法生产公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件.pptx

第三章第三章 酶生物合成与发酵生产酶生物合成与发酵生产 第1页第1页酶生产办法提取分离法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化学合成(chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea organ/tissue/cellAmylase from BacillusProtease from BacillusPhosphatase from BacillusGlucoamylase from AspergillusPlant cell cultureAnimal cell cultureFew example第2页第2页 第一节第一节 酶生物合成及调整酶生物合成及调整一、酶生物合成一、酶生物合成 遗传信息传递中心法则遗传信息传递中心法则转转录录传传递递给给RNA，再再由由RNA 蛋白质蛋白质翻译翻译转录转录逆转录逆转录复制复制复制复制DNARNA 第3页第3页（一）（一）RNARNA生物合成生物合成-转录转录(transcription)(transcription)定义定义 以以DNADNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNARNA聚合酶（转录酶）作用下，生成聚合酶（转录酶）作用下，生成RNARNA分子过程。分子过程。.第4页第4页转录模板转录模板 启动子（启动子（promotor)终止子终止子(terminator)模板链（模板链（template strand）反意义链反意义链(antisense strand)编码链编码链(coding strand)故意义链故意义链(sense strand)DNADNA5533反意义链反意义链:指导转录作用一条指导转录作用一条DNADNA链链故意义链故意义链:无转录功效一条无转录功效一条DNADNA链链.第5页第5页T C G A G T A CA G C T C A T GC G A G U A CG C A URNA聚合酶聚合酶故意义链故意义链反意义链反意义链RNAPPi555533GTPUTPCTPATPUTPRNA在在DNA模板上生物合成模板上生物合成333355第6页第6页RNA转录过程转录过程(三步三步)1.1.起始起始2.2.延长延长3.3.终止终止 第7页第7页 原核生物原核生物RNA聚合酶聚合酶(DDRP)E.coliRNAE.coliRNA聚合酶是由四种亚基构成五聚体（聚合酶是由四种亚基构成五聚体（2 2 ）起始因子第8页第8页RNARNA合成过程合成过程起始起始双链双链DNA局部解开局部解开磷酸二酯磷酸二酯键形成键形成终止阶段终止阶段解链区到达解链区到达基因终点基因终点延长阶段延长阶段5 3 RNA 启动子启动子（promotor)终止子终止子(terminator)5 RNA聚合酶聚合酶 5 3 5 3 5 5 3 离开离开第9页第9页RNA链延伸图解链延伸图解35RNA-DNA杂交螺旋杂交螺旋聚合酶移动方向聚合酶移动方向新生新生RNA复链复链解链解链有义链有义链模板链（反义链）模板链（反义链）延长部位延长部位第10页第10页 定义定义 以以mRNAmRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种体上通过各种tRNAtRNA、酶和辅助因子作用，合成、酶和辅助因子作用，合成多肽链过程。多肽链过程。（二）蛋白质生物合成（二）蛋白质生物合成（二）蛋白质生物合成（二）蛋白质生物合成-翻译翻译翻译翻译(translation)(translation)(translation)(translation)第11页第11页酪酪555533AUGGUU UAC ACA酪氨酰酪氨酰-tRNA反密码反密码mRNA密码与反密码碱基配对密码与反密码碱基配对第12页第12页AUG ACA55蛋蛋苏苏UGUGUU33受受 位位(A位位)给给 位位(P位位)大亚基大亚基小亚基小亚基第13页第13页 蛋白质合成过程蛋白质合成过程 （大肠杆菌）（大肠杆菌）v 氨基酸活化氨基酸活化v 肽链合成起始肽链合成起始v 肽链延伸肽链延伸v 肽链合成终止与释放肽链合成终止与释放第14页第14页氨基酸活化与转运氨基酸活化与转运氨基酸活化与转运氨基酸活化与转运反应式：反应式：AA +tRNA +ATPAA +tRNA +ATP氨酰氨酰-tRNA-tRNA合成酶合成酶氨酰氨酰-tRNA-tRNA+AMP+PPi+AMP+PPi 对于对于E.coliE.coli而言，肽链合成时第一个氨而言，肽链合成时第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMetfMet）。）。第15页第15页在核糖体上合成多肽（三阶段）在核糖体上合成多肽（三阶段）在核糖体上合成多肽（三阶段）在核糖体上合成多肽（三阶段）1 1、起始阶段、起始阶段2 2、延伸阶段、延伸阶段3 3、终止阶段、终止阶段第16页第16页肽链合成起始阶段肽链合成起始阶段1.1.mRNAmRNA与小亚基结合：与小亚基结合：形成形成30S-mRNA-IF30S-mRNA-IF3 3复合物复合物2.2.AUGAUG与蛋氨酰与蛋氨酰-tRNAtRNA结合：结合：30S-mRNA-IF30S-mRNA-IF3 3 fMet-tRNA-IFfMet-tRNA-IF2 2-GTP-GTP fMet-tRNA fMet-tRNA正好位于正好位于mRNAmRNA起始密码子上（起始密码子上（AUGAUG）。）。3.3.大小亚基结合大小亚基结合IF130S30S起始复合物起始复合物第17页第17页AUG ACA5533AUG ACA5533UACUACAUG ACA5533小亚基小亚基mRNA蛋氨酰蛋氨酰tRNA GTP大亚基大亚基GDP+Pi受位受位给位给位蛋蛋蛋蛋肽链合成起始阶段肽链合成起始阶段第18页第18页肽链合成延伸阶段肽链合成延伸阶段1.1.进位进位:氨基酰氨基酰-tRNA-tRNA进入受位进入受位;2.2.转肽转肽:形成肽键形成肽键,在转肽酶作用下在转肽酶作用下,给位与给位与 受位结合受位结合;3.3.移位移位:核蛋白体向核蛋白体向33端移动一个密码子端移动一个密码子 位置位置,空出受位空出受位,不断地进位、转肽、不断地进位、转肽、移位移位,使肽链延长。使肽链延长。第19页第19页AUG ACA5533UAC蛋蛋苏苏UGUAUG ACA55UAC蛋蛋苏苏UGUGUUAUG ACA55UAC蛋蛋苏苏UGUGUUAUG ACA55蛋蛋苏苏UGUGUU333333GTP GDP+PiGDP+PiGTP起始复合体起始复合体进位进位转肽转肽移位移位Mg+K+第20页第20页肽链合成终止阶段肽链合成终止阶段1.1.出现终止密码并与终止因子结合出现终止密码并与终止因子结合;2.2.肽键水解肽键水解,多肽释放多肽释放;3.3.tRNA,mRNAtRNA,mRNA,大小亚基解离大小亚基解离.第21页第21页AUG UAA55UACAUG UAA55UAC3333终终终终AUG UAA55UAC33终终5533UAC终终肽链肽链第22页第22页第23页第23页二、酶生物合成调整二、酶生物合成调整二、酶生物合成调整二、酶生物合成调整定义：定义：通过调整酶合成量来控制微生物代通过调整酶合成量来控制微生物代谢速度调整机制，是在基因转录水平上进行。谢速度调整机制，是在基因转录水平上进行。意义：意义：通过制止酶过量合成，节约生物合通过制止酶过量合成，节约生物合成原料和能量。成原料和能量。第24页第24页 操纵子基因表示协同单位操纵子操纵子结构基因结构基因（编码蛋白质（编码蛋白质,structural gene,S）控制部位控制部位操纵基因（操纵基因（operator gene,O）启动子（启动子（promotor gene,P）（一）基因调控理论（一）基因调控理论 Jacob and Monod操纵子学说（operon theoryoperon theory）第25页第25页结构基因（结构基因（Structural gene）:决定某一多肽决定某一多肽DNA模板，与酶有各自模板，与酶有各自相应关系，其中遗传信息可转录为相应关系，其中遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。，再翻译为蛋白质。第26页第26页 cAMP-CRPcAMP-CRP复合物作用示意图复合物作用示意图 启动基因（启动基因（promotor genepromotor gene）（启动子）：）（启动子）：有两个位点：有两个位点：（1 1）RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点（2 2）cAMP-CAPcAMP-CAP结合位点。结合位点。CAPCAP：分解代谢产物基因活化蛋白（：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene catabolite gene activator proteinactivator protein），又称环腺苷酸受体蛋白），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP(cAMP receptor proteinreceptor protein，CRPCRP）。）。只有只有cAMP-CRPcAMP-CRP复合物结合到启动子位点上，复合物结合到启动子位点上，RNARNA聚聚合酶才干结合到其在启动子位点上，酶合成才干开始。合酶才干结合到其在启动子位点上，酶合成才干开始。第27页第27页操纵基因（操纵基因（Operater geneOperater gene）:位于启动基因和结构基因之间一段碱基位于启动基因和结构基因之间一段碱基顺序，能特异性地与调整基因产生变构蛋白顺序，能特异性地与调整基因产生变构蛋白结合，操纵酶合成结合，操纵酶合成时机与速度时机与速度。第28页第28页 调整基因调整基因(regulator gene)(regulator gene)：可产生一个构成型可产生一个构成型调整蛋白调整蛋白(regulatory(regulatory protein)protein)（一个变构蛋白），通过与效应物（一个变构蛋白），通过与效应物(effector)（包括诱导物和辅阻遏物）特异结（包括诱导物和辅阻遏物）特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因结合力。结合力。调整基因常位于调控区上游。调整基因常位于调控区上游。第29页第29页基因操纵子调整系统示意图基因操纵子调整系统示意图 调整基因调整基因 启动基因启动基因 操纵基因操纵基因 结构基因结构基因 DNA 转录转录 （-）RNA聚合酶聚合酶 （+）转录转录 翻译翻译 mRNA 翻译翻译 调整蛋白调整蛋白 蛋白质蛋白质 效应物效应物控制区控制区 信息区信息区操纵子操纵子第30页第30页(二二)酶合成调整类型酶合成调整类型 1.1.诱导诱导 (induction)(induction)构成酶：细胞固有酶类。构成酶：细胞固有酶类。诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似 物而暂时合成一类酶。物而暂时合成一类酶。2.2.阻遏阻遏 (repression)(repression)分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏(catabolite repression)(catabolite repression)反馈阻遏反馈阻遏(feedback repression)(feedback repression)第31页第31页（三）酶合成调整机制 1.酶合成诱导加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。酶合成诱导现象：酶合成诱导现象：已知分解利用乳糖酶有：已知分解利用乳糖酶有：-半乳糖苷酶；半乳糖苷酶；-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。试验：试验：（1 1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；内无上述三种酶合成；（2 2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；上述三种酶合成；（3 3）表明菌体生物合成经济原则：）表明菌体生物合成经济原则：需要时才合成需要时才合成。第32页第32页调整调整基因基因操纵操纵基因基因乳糖酶结构基因乳糖酶结构基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏物阻遏物(调调整蛋白整蛋白)（有活性有活性）基基 因因 关关 闭闭启启动动子子ORPLacZLacYLaca调整调整基因基因操纵操纵基因基因乳糖酶结构基因乳糖酶结构基因启启动动子子ORmRNAZmRNAYmRNAa阻遏物阻遏物（无活性无活性）基基 因因 表表示示mRNAA、乳糖操纵子结构、乳糖操纵子结构B、乳糖酶诱导、乳糖酶诱导 乳糖乳糖(效应物效应物)阻遏物阻遏物（有活性）（有活性）诱导诱导第33页第33页 2.2.反馈（末端产物）阻遏反馈（末端产物）阻遏 由某代谢路径末端产物过量累积引起阻遏由某代谢路径末端产物过量累积引起阻遏。酶合成阻遏现象：酶合成阻遏现象：试验：试验：（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖培养基上时，）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖培养基上时，检测检测到细胞内有色氨酸合成酶存在；到细胞内有色氨酸合成酶存在；（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发觉细胞内色氨）在上述培养基中加入色氨酸，检测发觉细胞内色氨酸合成酶活性减少，直至消失。酸合成酶活性减少，直至消失。（3）表明色氨酸存在制止了色氨酸合成酶合成，表达了）表明色氨酸存在制止了色氨酸合成酶合成，表达了菌体生长经济原则菌体生长经济原则:不需要就不合成不需要就不合成。第34页第34页 色氨酸操纵子色氨酸操纵子酶阻遏酶阻遏调整基因调整基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表示结构基因表示调整基因调整基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因辅阻遏物辅阻遏物代谢产物与阻遏蛋白结代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生改变合，使之构象发生改变与操纵基因结合，结构基与操纵基因结合，结构基因不能表示因不能表示调整蛋白调整蛋白第35页第35页酶酶诱诱导导和和阻阻遏遏操操纵纵子子模模型型B.有活性阻遏物加诱导剂有活性阻遏物加诱导剂A.有活性阻遏物有活性阻遏物C.无活性阻遏蛋白无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂操纵基因操纵基因启动基因启动基因调整基因调整基因结构基因结构基因 阻遏蛋白阻遏蛋白(有活性有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表示结构基因不表示诱导物诱导物诱导物与阻遏蛋白结合诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因作用到阻挡操纵基因作用,结构基因能够表示结构基因能够表示酶蛋白酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合阻遏蛋白不能跟操纵基因结合,结构基因能够表示结构基因能够表示阻遏蛋白阻遏蛋白(无活性无活性)酶蛋白酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因白能够阻挡操纵基因,结构基因不表示结构基因不表示代谢产物代谢产物第36页第36页调控方式 阻遏蛋白 添加物 与操纵基因结合阻遏效应举例酶诱导有活性不转录，继而不翻译诱导物转录，继而翻译乳糖操纵子酶阻遏无活性阻遏物不转录，继而不翻译色氨酸操纵子酶合成诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比酶合成诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比第37页第37页3.3.分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏n指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快那种分解底物会阻遏源）存在时，利用快那种分解底物会阻遏利用慢底物相关酶合成现象。利用慢底物相关酶合成现象。n分解代谢物阻遏作用，并非由于快速利用分解代谢物阻遏作用，并非由于快速利用甲碳源本身直接作用结果，而是通过甲碳甲碳源本身直接作用结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生中源（或氮源等）在其分解过程中所产生中间代谢物所引起阻遏作用。间代谢物所引起阻遏作用。第38页第38页分解代谢物阻遏现象：分解代谢物阻遏现象：试验：试验：细菌在含有葡萄糖和乳糖培养基上生长，优先利细菌在含有葡萄糖和乳糖培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期“二次生长二次生长现象现象”(diauxie(diauxie或或biphasic growthbiphasic growth）。）。这一现象又称葡萄糖效应，这一现象又称葡萄糖效应，产生原因是由于葡萄糖降解物产生原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系合成。阻遏了分解乳糖酶系合成。此此调整基因产物是环腺苷酸受体调整基因产物是环腺苷酸受体蛋白（蛋白（CRPCRP）,亦称亦称降解物基因降解物基因活化蛋白（活化蛋白（CAPCAP）。）。第39页第39页分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基基 因因 表表示示CRP基因基因结构基因结构基因TCRPOCAP结结合部位合部位 RNA聚合酶聚合酶TcAMP-CRPP葡萄糖葡萄糖分解代分解代谢产物谢产物腺苷酸腺苷酸环化酶环化酶磷酸二酯磷酸二酯酶酶ATPcAMP5-AMP克制克制激活激活葡萄糖降解物与葡萄糖降解物与cAMP关系关系cAMPCRP：环腺苷酸受体蛋白或降解物：环腺苷酸受体蛋白或降解物(分解分解代谢产物代谢产物)基因活化蛋白（基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）减少减少cAMP浓度浓度使使CRP呈失活状态呈失活状态第40页第40页三、提升酶产量策略三、提升酶产量策略（一）菌种选育（一劳永逸）（一）菌种选育（一劳永逸）1.1.诱变育种诱变育种 (1)使诱导型变为构成型使诱导型变为构成型选育构成型突变株选育构成型突变株(2)(2)使阻遏型变为去阻遏型使阻遏型变为去阻遏型 选育营养缺点型突变株选育营养缺点型突变株解除反馈阻遏解除反馈阻遏 选育结构类似物抗性突变株选育结构类似物抗性突变株解除分解代谢物阻遏解除分解代谢物阻遏选育抗分解代谢阻遏突变株选育抗分解代谢阻遏突变株 2.基因工程育种基因工程育种 第41页第41页（二）条件控制（二）条件控制1.1.添加诱导物添加诱导物 酶底物类似物最有效。酶底物类似物最有效。2.2.减少阻遏物浓度减少阻遏物浓度 除去终产物除去终产物产物阻遏产物阻遏 添加制止产物形成克制剂添加制止产物形成克制剂 避免使用葡萄糖避免使用葡萄糖分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏 避免培养基过于丰富避免培养基过于丰富 添加一定量添加一定量cAMPcAMP第42页第42页3.3.添加表面活性剂添加表面活性剂 离子型离子型 对细胞有毒害作用对细胞有毒害作用表面活性剂表面活性剂 TweenTween8080 非离子型非离子型 增长细胞通透性增长细胞通透性 TritonXTritonX1001004.4.添加产酶增进剂添加产酶增进剂第43页第43页 第二节第二节 酶发酵动力学酶发酵动力学 一、细胞生长动力学一、细胞生长动力学 在分批培养在分批培养(batch culture)(batch culture)过程中，细胞生过程中，细胞生长普通要经历延迟期、指数生长期、减速期、静长普通要经历延迟期、指数生长期、减速期、静止期和衰亡期止期和衰亡期5 5个阶段。个阶段。第44页第44页 细胞生长曲线细胞生长曲线 O-A 延迟期延迟期 A-B指数生长期指数生长期 B-C减速期减速期 C-D 静止期静止期 D-E 衰亡期衰亡期 第45页第45页 营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率之间动力学关系：之间动力学关系：MonodMonod模型模型n:比生长速率（比生长速率（1/h）（specific growth rate）nmax：最大比生长速率（最大比生长速率（1/h）nS：营养物浓度（营养物浓度（生长限制基质浓度生长限制基质浓度）克克/LnKs：莫诺德常数或莫诺德常数或饱和常数或营养物利用常数饱和常数或营养物利用常数 克克/L，或，或 mol/L第46页第46页 二、产酶动力学二、产酶动力学 （一）（一）酶生物合成模式酶生物合成模式 依据酶合成与细胞生长之间关系，可将酶生物依据酶合成与细胞生长之间关系，可将酶生物合成份为合成份为3 3种模式，即：种模式，即：同时合成型同时合成型 生长偶联型生长偶联型 中期合成型中期合成型 部分生长偶联型部分生长偶联型延续合成型延续合成型 非生长偶联型非生长偶联型 滞后合成型滞后合成型第47页第47页1.1.生长偶联型（又称同时合成型）生长偶联型（又称同时合成型）酶生物合成与细胞生长同时。酶生物合成与细胞生长同时。特点：特点：酶合成能够诱导，但不受分解代谢物阻遏和反酶合成能够诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。应产物阻遏。当清除诱导物、细胞进入平衡期后，酶合成马上当清除诱导物、细胞进入平衡期后，酶合成马上停止，表明这类酶所相应停止，表明这类酶所相应mRNAmRNA很不稳定。很不稳定。第48页第48页生长偶联型中特殊形式生长偶联型中特殊形式中期合成型中期合成型 酶合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞酶合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶合成也伴随停止。生长进入平衡期以后，酶合成也伴随停止。特点：特点：酶合成受产物反馈阻遏或分解代谢物阻遏。酶合成受产物反馈阻遏或分解代谢物阻遏。所所相应相应mRNAmRNA是不稳定。是不稳定。枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线 第49页第49页2.2.部分生长偶联型（又称延续合成型）部分生长偶联型（又称延续合成型）酶合成在细胞生长阶段开始，在细胞生长进入平酶合成在细胞生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还能够延续合成较长一段时间。衡期后，酶还能够延续合成较长一段时间。特点：特点：可受诱导，普通不受分解代谢物和产物阻遏。可受诱导，普通不受分解代谢物和产物阻遏。所相应所相应mRNAmRNA相称稳定。相称稳定。黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线第50页第50页3.3.非生长偶联型（又称滞后合成型）非生长偶联型（又称滞后合成型）只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶生物合成都属于这一类型。大量积累。许多水解酶生物合成都属于这一类型。特点特点：受分解代谢物阻遏作用。受分解代谢物阻遏作用。所相应所相应mRNAmRNA稳定性高。稳定性高。黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线 第51页第51页总结：影响酶生物合成模式主要原因 高：可在细胞停止生长后继 1）mRNA稳定性 续合成酶 差：伴随细胞停止生长而终 止酶合成 2）培养基中阻遏物存在 不受阻遏：伴随细胞生长而开始酶合成。受阻遏：细胞生长一段时间或平衡期后，酶才开始 合成。第52页第52页 酶生产中最抱负合成模式：延续合成型：发酵过程中没有生长久和产酶期显著差异。细胞开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还能够继续生成一段时间。对于：同时合成型：提升对应mRNA稳定性，如降低发酵 温度。滞后合成型：尽也许降低甚至解除分解代谢物阻遏，使 酶合成提早开始。中期合成型：要在提升mRNA稳定性以及解除阻遏两方 面努力。第53页第53页(二二)产酶动力学产酶动力学普通产酶动力学方程可表示为：普通产酶动力学方程可表示为：式中式中 X X细胞浓度细胞浓度(g/L)(g/L)细胞比生长速率细胞比生长速率(h(h-1-1)生长偶联比产酶系数生长偶联比产酶系数(IU/g)(IU/g)非生长偶联比产酶速率非生长偶联比产酶速率(IU/(g(IU/(g h)h)E E酶浓度酶浓度(IU/L)(IU/L)t t时间时间(h)(h)第54页第54页生长偶联型生长偶联型部分生长偶联型部分生长偶联型 非生长偶联型非生长偶联型 第55页第55页 第三节第三节 微生物发酵产酶微生物发酵产酶 一、产酶微生物分离和选育一、产酶微生物分离和选育 1.1.优良产酶菌种应具备条件优良产酶菌种应具备条件 （1 1）酶产量高）酶产量高 （2 2）易培养（生长速率高、营养要求低）易培养（生长速率高、营养要求低）（3 3）遗传性能稳定，不易退化）遗传性能稳定，不易退化 （4 4）易分离提纯）易分离提纯 （5 5）安全可靠（不是致病菌）安全可靠（不是致病菌）第56页第56页2.2.惯用产酶微生物惯用产酶微生物Escherichia coli Pseudomonas Bacillus subtilis Micrococcus Streptococcus StreptomycesAspergillus nigerAspergillus oryzaeMonascusPenicilliumTrichoderma Rhizopus Mucor Absidia Saccharomyces cerevisiae Candida第57页第57页 3.3.产酶微生物分离和筛选产酶微生物分离和筛选 1)1)样品采集样品采集:从富含该酶作用底物场合采集样品从富含该酶作用底物场合采集样品 2)2)富集培养富集培养:投其所好，取其所抗投其所好，取其所抗 3)3)分离取得微生物纯培养（分离取得微生物纯培养（pure culturepure culture）。）。4)4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。初筛：选出产酶菌种，以多为主。5)5)复筛：选出产酶水平相对较高菌株，以质为主。复筛：选出产酶水平相对较高菌株，以质为主。第58页第58页 -淀粉酶筛选淀粉酶筛选第59页第59页蛋白酶产生菌取得办法蛋白酶产生菌取得办法应用含酪蛋白培养基应用含酪蛋白培养基第60页第60页4.4.产酶微生物优良菌种选育产酶微生物优良菌种选育 诱变育种诱变育种 原生质体融合育种原生质体融合育种 基因工程育种基因工程育种 第61页第61页 二二.微生物发酵产酶办法微生物发酵产酶办法 1.1.固体培养固体培养:尤其适合于霉菌培养尤其适合于霉菌培养 2.2.液体培养液体培养:当前酶发酵生产主要方式当前酶发酵生产主要方式 3.3.固定化细胞固定化细胞 :需要特殊固定化细胞反应器需要特殊固定化细胞反应器 第62页第62页三三.微生物酶类型微生物酶类型 1.1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中大纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中大分子而释放到细胞外，即使胞外浓度很高，胞内也分子而释放到细胞外，即使胞外浓度很高，胞内也能维持较低水平，受到调整控制少。能维持较低水平，受到调整控制少。2.2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用酶，酶胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用酶，酶活性和浓度受到中间产物和终产物调控。活性和浓度受到中间产物和终产物调控。第63页第63页酶发酵生产普通工艺流程酶发酵生产普通工艺流程 第64页第64页第四节 动、植物细胞培养产酶 与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞含有各自不同特性，需采取各自不同培养工艺。第65页第65页动物细胞模式图第66页第66页植物细胞结构第67页第67页 植物、动物、微生物细胞特性比较植物、动物、微生物细胞特性比较细胞种类细胞种类植物细胞植物细胞微生物细胞微生物细胞动物细胞动物细胞细胞大小细胞大小/um20030011010100倍增时间倍增时间/h120.3-615营养要求营养要求简朴简朴复杂复杂光照要求光照要求大多数要求大多数要求不要求不要求不要求不要求对剪切力对剪切力敏感敏感大多数不敏感大多数不敏感非常敏感非常敏感主要产物主要产物色素、药物、香精、酶等醇、有机酸、氨醇、有机酸、氨基酸、抗生素、基酸、抗生素、核苷酸、酶等核苷酸、酶等疫疫苗苗、激激素素、单单克克隆隆抗抗体体、酶等酶等第68页第68页三者之间差别主要有：三者之间差别主要有：植物细胞植物细胞 动物细胞动物细胞 微生物细胞。微生物细胞。动物细胞、植物细胞生产周期比微生物长。动物细胞、植物细胞生产周期比微生物长。植物细胞和微生物细胞营养要求较简朴。植物细胞和微生物细胞营养要求较简朴。植物细胞生长以及次级代谢物生产要求一定光照。植物细胞生长以及次级代谢物生产要求一定光照。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物、微生物和动物细胞主要目的产物各不相同。植物、微生物和动物细胞主要目的产物各不相同。第69页第69页一、植物细胞培养产酶一、植物细胞培养产酶 1.1.植物细胞培养特点植物细胞培养特点 2.2.培养基特点培养基特点 应用最广是应用最广是MSMS培养基和培养基和LSLS培养基培养基 MSMS培养基是培养基是19621962年由年由MurashingeMurashinge和和SkoogSkoog为烟草细胞培养而设计培养基。为烟草细胞培养而设计培养基。LSLS培养基是在培养基是在其基础上演变而来。其基础上演变而来。第70页第70页3.3.培养办法：培养办法：悬浮细胞培养悬浮细胞培养细胞株建立；外植体与愈伤组织细胞株建立；外植体与愈伤组织扩大培养；扩大培养；大罐培养；大罐培养；第71页第71页外植体：外植体：从植株取出，通过预处理后，用于植物组从植株取出，通过预处理后，用于植物组织培养植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、织培养植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）片段或小块。果实、种子等）片段或小块。愈伤组织：愈伤组织：将上述外植体植入诱导培养基中，于将上述外植体植入诱导培养基中，于2525左右培养一段时间，从外植体切口部位长出小左右培养一段时间，从外植体切口部位长出小细胞团。细胞团。第72页第72页水稻外植体（幼胚）水稻外植体（幼胚）和愈伤组织和愈伤组织外植体外植体愈伤组织愈伤组织第73页第73页4.4.培养条件影响与控制培养条件影响与控制（1 1）温度）温度（2 2）pHpH（3 3）通气与搅拌）通气与搅拌（4 4）光照控制）光照控制（5 5）前体添加（饲喂）前体添加（饲喂）（6 6）诱导子（）诱导子（elicitorselicitors）应用）应用第74页第74页5.5.植物细胞培养产酶实例植物细胞培养产酶实例 以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SODSOD）为例）为例(1)(1)大蒜愈伤组织诱导大蒜愈伤组织诱导 选取坚固、饱满、无病虫害大蒜蒜瓣，清选取坚固、饱满、无病虫害大蒜蒜瓣，清除外皮，先用除外皮，先用70%70%乙醇消毒乙醇消毒20s20s，再用，再用0.1%0.1%升汞升汞消毒消毒10min10min，然后无菌水漂洗，然后无菌水漂洗3 3次。次。在无菌条件下，切成在无菌条件下，切成0.5cm0.5cm3 3小块，植入含小块，植入含有有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和1.2mg/L 6-BA 1.2mg/L 6-BA 半固体半固体MSMS培养培养基中，在基中，在2525，600lux600lux，12h/d12h/d光照条件下培养光照条件下培养18d18d，诱导得到愈伤组织，每，诱导得到愈伤组织，每1818天继代一次。天继代一次。第75页第75页(2)(2)大蒜悬浮细胞培养大蒜悬浮细胞培养 将上述在半固体将上述在半固体MSMS培养基上培养培养基上培养18d18d愈伤愈伤组织，在无菌条件下转入含有组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和 1.2mg/L 6-BA 1.2mg/L 6-BA（苄基腺嘌呤）（苄基腺嘌呤）液体液体MSMS培养培养基中，加入灭菌玻璃珠，基中，加入灭菌玻璃珠，2525，600lux600lux，12h/d12h/d光照条件下震荡培养光照条件下震荡培养18d18d，使愈伤组织，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。分散成为小细胞团或单细胞。然后在无菌条件下，通过筛网将小细胞然后在无菌条件下，通过筛网将小细胞团或单细胞转入含有团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和1.2mg/L 1.2mg/L 6-BA 6-BA 液体液体MSMS培养基中，培养基中，25,600lux25,600lux，12h/d12h/d光照条件下震荡培养光照条件下震荡培养18d18d。第76页第76页(3)(3)酶分离纯化酶分离纯化 细胞培养完毕后，搜集细胞，通过细胞细胞培养完毕后，搜集细胞，通过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。第77页第77页二、动物细胞培养产酶二、动物细胞培养产酶 1.1.动物细胞培养特点动物细胞培养特点细胞生长速度慢。（需添加抗生素）细胞生长速度慢。（需添加抗生素）细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。反应过程成本高，产品价格贵。反应过程成本高，产品价格贵。细胞含有锚地依赖性。细胞含有锚地依赖性。原代细胞普通繁殖原代细胞普通繁殖5050代。代。第78页第78页 2.2.培养基培养基 天然培养基天然培养基 合成培养基合成培养基 无血清培养基无血清培养基第79页第79页3.3.培养办法培养办法(1)(1)悬浮培养悬浮培养(suspension culture)(suspension culture)(2)(2)贴壁培养贴壁培养(anchorage-dependent culture)(anchorage-dependent culture)(3)(3)贴壁悬浮培养贴壁悬浮培养(pseudo-suspension(pseudo-suspension culture)culture)微载体培养微载体培养(microcarrier culture)(microcarrier culture)包埋包埋(entrapment)(entrapment)和微囊和微囊(microencapsulation)(microencapsulation)培养培养 结团培养结团培养(aggregate culture)(aggregate culture)第80页第80页 4.4.培养条件影响与控制培养条件影响与控制（1 1）温度：普通控制在）温度：普通控制在36.5.36.5.（2 2）pHpH值：普通控制在值：普通控制在7.0-7.67.0-7.6微碱性范围内。微碱性范围内。（3 3）渗入压）渗入压:应与细胞内渗入压相同。应与细胞内渗入压相同。（4 4）溶解氧：依据情况随时调整）溶解氧：依据情况随时调整。第81页第81页思考题：第82页第82页