Waters液相色谱方法开发.pdf

液相色谱方法开发液相色谱方法开发Waters中国有限公司中国有限公司培训中心培训中心2004 Waters Corporation开发液相色谱方法开发液相色谱方法?液相色谱方法即液相色谱实验所需的基本参数,包括以下各项内容液相色谱方法即液相色谱实验所需的基本参数,包括以下各项内容:流动相:种类及配比(等度或梯度)固定相:色谱柱类型及内径,长短 流动相输送系统参数:流速 检测器参数:检测波长,灵敏度等 温度控制 进样量?以上参数即构成一个具体的以上参数即构成一个具体的HPLC方法,亦称方法,亦称色谱条件色谱条件2004 Waters Corporation评价液相色谱方法的标准评价液相色谱方法的标准?问题什么样的分离结果是好的?分离度?问题什么样的分离结果是好的?分离度?2004 Waters Corporation什么是液相色谱的分离度？什么是液相色谱的分离度？分离度的定义：分离度的定义：)w(wvv122112+=RR:分离程度的量度分离程度的量度2004 Waters Corporation影响分离度的因素影响分离度的因素K,N?分离度方程分离度方程K是容量因子，表达了被分离组分与柱填料的作用强弱是容量因子，表达了被分离组分与柱填料的作用强弱 是分离因子 是分离因子,描述两个组分分离的好坏程度描述两个组分分离的好坏程度,是化学因素是化学因素N 是理论塔板数是理论塔板数,描述色谱峰的谱带展宽程度描述色谱峰的谱带展宽程度+=411 NkkR2004 Waters Corporation容量因子容量因子 k?改变改变k值的方法值的方法调节流动相的极性、调节流动相的极性、pH、离子强度等、离子强度等梯度淋洗梯度淋洗?与峰高的关系与峰高的关系?与与R的关系的关系2004 Waters Corporation分离因子 分离因子?定义定义=1 时两组分分不开时两组分分不开?改变的途径改变的途径改变固定相改变固定相改变流动相改变流动相改变温度改变温度改变样品的本身性质改变样品的本身性质120102 kkttttRR=1R2004 Waters Corporation色谱柱的柱效色谱柱的柱效 N?理论塔板数计算公式：理论塔板数计算公式：?W方法方法Wtan16切线法切线法Wh5.54 半峰高半峰高W393W4164W525521=WVN 2004 Waters Corporation，k，N如何控制分离度如何控制分离度?2004 Waters Corporation开发方法的其它考虑因素开发方法的其它考虑因素?分离度是色谱分离中主要考虑的因素分离度是色谱分离中主要考虑的因素?除分离度之外除分离度之外,在开发色谱方法时在开发色谱方法时,以下几个因素也都要考虑以下几个因素也都要考虑:灵敏度灵敏度载样量载样量分析速度分析速度溶剂损耗溶剂损耗成本成本容易使用容易使用色谱柱寿命色谱柱寿命效率效率2004 Waters Corporation方法开发方法开发:第一步干什么第一步干什么?想办法得到各种信息想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法查文献，如查文献，如CA(化学文摘化学文摘)仪器制造商的文献，如仪器制造商的文献，如Waters?对色谱柱有足够的了解对色谱柱有足够的了解掌握分离机理，自己开发方法掌握分离机理，自己开发方法?充分了解自己的样品充分了解自己的样品2004 Waters Corporation参照文献方法时的注意事项参照文献方法时的注意事项?采用与文献方法相同的色谱柱采用与文献方法相同的色谱柱(品牌品牌,固定相固定相,内径内径,长度长度),否则不能重现文献结果否则不能重现文献结果?注意不同注意不同HPLC系统体积的差异系统体积的差异,若系统体积不同若系统体积不同,则不能重现文献的梯度方法则不能重现文献的梯度方法?注意尽量避免流动相对色谱柱的损害注意尽量避免流动相对色谱柱的损害(pH,缓冲盐的种类和浓度缓冲盐的种类和浓度)?注意文献方法发表的年代背景注意文献方法发表的年代背景,不要机械照搬不要机械照搬,而应立足创新而应立足创新,尽可能采用尽可能采用HPLC新技术新技术2004 Waters Corporation一般的具体步骤一般的具体步骤?先用一根短的色谱柱先用一根短的色谱柱?用相对较高的流速用相对较高的流速?使用尽可能高纯度的标准品使用尽可能高纯度的标准品?先用高强度的洗脱液先用高强度的洗脱液?调节调节k值改变保留值值改变保留值?调节值改变选择性调节值改变选择性?调节柱长度改变柱效及分离速度调节柱长度改变柱效及分离速度请记住 每次改变一个参数请记住 每次改变一个参数2004 Waters Corporation反相色谱方法开发实例反相色谱方法开发实例?色谱条件色谱条件色谱柱：色谱柱：C18，4mm30mm流动相：乙腈流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱，由强渐弱流速：流速：2ml/min样品：样品：对羟基苯甲酸甲酯 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben)对羟基苯甲酸丙酯 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben)对羟基苯甲酸丁酯 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)2004 Waters Corporation实例实例2:改变容量因子改变容量因子 K60/4050/5040/60?实例实例1谱图谱图2004 Waters Corporation?通过改变流动相改变选择性通过改变流动相改变选择性同样强度的不同溶剂同样强度的不同溶剂?改变色谱柱的影响会更大改变色谱柱的影响会更大实例实例2:改变选择性改变选择性()62:38/42:58/72:28/2322，OHCNCHOHMeOHOHTHF2004 Waters Corporation离子抑制色谱离子抑制色谱?离子型化合物在反相色谱柱上不保留离子型化合物在反相色谱柱上不保留?改变流动相的改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离值，抑制样品离子的电离?适用于弱酸性化合物的分离适用于弱酸性化合物的分离降低流动相的降低流动相的pH值，使样品降低离子化值，使样品降低离子化使用硅胶基质使用硅胶基质C18填料填料?使用条件应在填料基质的安全范围内使用条件应在填料基质的安全范围内硅胶柱的硅胶柱的pH在在2-8（较保险值（较保险值3-7）之间）之间H+Ac-HAc?在稀溶液中在稀溶液中:2004 Waters Corporation离子抑制色谱实例离子抑制色谱实例?在乙腈在乙腈/水及水及pH=7时，时，多数保留时间很短，无多数保留时间很短，无法完全分离。法完全分离。CHOOHOCH3COONaCHOCOOHOCH312342004 Waters Corporation常用缓冲液及其常用缓冲液及其pH值值名 称pKa Phosphoric Acid 磷酸 2.12(pKa1)Formic Acid 甲酸 3.75 Succinic Acid 琥珀酸 4.19(pKa1)Acetic Acid 乙酸 4.75 Succinic Acid 琥珀酸 5.57(pKa2)Phosphoric Acid 磷酸 7.21(pKa2)Boric Acid 硼酸 9.24 Phosphoric Acid 磷酸 12.32(pKa3)2004 Waters Corporation离子对色谱法离子对色谱法?在反相色谱流动相内加入在反相色谱流动相内加入“离子对离子对”试剂试剂与样品中可电离的组份形成与样品中可电离的组份形成“对离子对离子”目的目的:在反相色谱柱上分离离子型化合物在反相色谱柱上分离离子型化合物?离子对试剂的类型离子对试剂的类型PIC A：磷酸季丁铵，适用于酸性组份：磷酸季丁铵，适用于酸性组份PIC B：烷基磺酸盐，适用于碱性组份：烷基磺酸盐，适用于碱性组份?烷基长度不同，形成对离子的能力不同烷基长度不同，形成对离子的能力不同?通常有：通常有：B5，B6，B7，B8PIC D4：磷酸二丁胺，适用于弱碱：磷酸二丁胺，适用于弱碱2004 Waters Corporation离子对色谱机理离子对色谱机理OO(CC)nSO3-Na+加(CC)nSO3-N+C4C4C4C4N+C4C4C4C4O H-流动相加0.01M的SiOSiC18OOPIC-A试剂2004 Waters Corporation离子对色谱分析水溶性维生素离子对色谱分析水溶性维生素NCONH2NH3CHOCH2OHCH2OHNNNNH3CH3COOCH2CHCHCHHOHOHOCH2OHNNH3CNH2CH2NSCH2CH2OHCH3 Cl-+1.Niacinamide 烟酰胺2.Pyridoxine 吡哆素，VB63.Riboflavin 核黄素，VB24.Thiamine 硫胺素，VB12004 Waters Corporation用不同的离子对试剂用不同的离子对试剂色谱柱BondaPak C183.9mm300mm溶剂1.MeOH/H2O,PIC-B72.MeOH/H2O,PIC-B53.MeOH/H2O,PIC-B7/B5色谱柱BondaPak C183.9mm300mm溶剂1.MeOH/H2O,PIC-B72.MeOH/H2O,PIC-B53.MeOH/H2O,PIC-B7/B51.如用PIC-B7，在分开的情况下，保留时间太长1.如用PIC-B7，在分开的情况下，保留时间太长2.如用PIC-B5，峰分不开2.如用PIC-B5，峰分不开3.如用PIC-B7加B5，各组份分开，且保留时间合适3.如用PIC-B7加B5，各组份分开，且保留时间合适2004 Waters Corporation离子对色谱离子对色谱-水溶性维生素水溶性维生素 保留时间与PIC试剂B之间的关系保留体积 ml36ml4ml烟酰胺吡哆素(VB6)核黄素(VB2)硫胺(VB1)B5B750%(B5/B7)2004 Waters Corporation离子对色谱的优缺点离子对色谱的优缺点?优点优点:可用反相色谱分析离子可用反相色谱分析离子离子和中性化合物可在同一次色谱分析中完成离子和中性化合物可在同一次色谱分析中完成通过选择不同的通过选择不同的PIC试剂可使选择性得到惊人的改善试剂可使选择性得到惊人的改善,特别是对中性和离子型溶质特别是对中性和离子型溶质?缺点缺点:PIC 试剂的平衡较慢试剂的平衡较慢?推荐专用色谱柱作离子对分析推荐专用色谱柱作离子对分析 当心当心 PIC 试剂在甲醇试剂在甲醇,乙腈等溶剂中沉淀乙腈等溶剂中沉淀 当心用过的离子对试剂的化学污染当心用过的离子对试剂的化学污染2004 Waters Corporation用离子对？还是离子抑制？用离子对？还是离子抑制？中性物质PIC A 酸性物质PIC B 碱性物质R SO3HR C OHOR OSOHOOR OPOHOOR NH2R2NHR3N(R4N+)-CH3OH/0.01M(NH4)2HPO4CH3CN/H2OCH3OH/H2O磺酸染料苯甲酸马来酸雌酮磷酸地塞米松氢化可的松对苯二甲酸二乙脂，苊多巴胺VB2，肾上腺素可待因洁尔灭离子抑制CH3OH/1%HAc CH3CN/NaH2PO42004 Waters Corporation什么是梯度方法什么是梯度方法90/10,CH3CN/H2O80/20,CH3CN/H2O?梯度:流动相的组成或流速随洗脱时间的变化而变化梯度:流动相的组成或流速随洗脱时间的变化而变化2004 Waters Corporation梯度洗脱的特点梯度洗脱的特点?优点优点单位时间的分离能力增加单位时间的分离能力增加检测灵敏度提高检测灵敏度提高?缺点缺点仪器设备要求高仪器设备要求高不适合某些检测方式不适合某些检测方式色谱柱需再生色谱柱需再生定量分析的重复性较低定量分析的重复性较低2004 Waters Corporation梯度洗脱的方式梯度洗脱的方式?高压梯度及低压梯度高压梯度及低压梯度溶剂溶剂 A溶剂溶剂 B泵 A泵 B泵 A泵 B混合器混合器A 高压梯度高压梯度溶剂溶剂 A溶剂溶剂 B比例阀（溶剂混合点）混合器比例阀（溶剂混合点）混合器B 低压梯度低压梯度（溶剂混合点）（溶剂混合点）泵泵2004 Waters Corporation梯度滞后梯度滞后:系统体积的影响系统体积的影响死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时)滞后(系统)体积滞后(系统)体积溶剂输送系统(泵)检测器进样器色谱柱色谱柱梯度混合器溶剂输送系统(泵)高压梯度注意滞后体积包括进样器、阻尼器、混合器及其管路注意滞后体积包括进样器、阻尼器、混合器及其管路比例阀比例阀检测器进样器ABCD色谱柱色谱柱溶剂输送系统(泵)低压梯度 阻尼器 混合器2004 Waters Corporation滞后体积大小的影响滞后体积大小的影响?滞后体积太大会引起梯度变化的延迟滞后体积太大会引起梯度变化的延迟例如滞后体积为例如滞后体积为 2.0ml，流速，流速 1.0ml/min?实际梯度会比设置值晚实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题分钟响应，没有问题对微柱色谱影响更大，如上例，流速对微柱色谱影响更大，如上例，流速0.1ml/min?实际梯度会比设置值晚实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受分钟响应，不能接受?滞后体积的不同会使方法转换麻烦滞后体积的不同会使方法转换麻烦滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现?普通普通HPLC的滞后体积为的滞后体积为24ml对分析型对分析型HPLC没有影响没有影响对作微柱实验用梯度时影响较大，因此应选滞后体积小的液相色谱仪，以适应梯度实验对作微柱实验用梯度时影响较大，因此应选滞后体积小的液相色谱仪，以适应梯度实验2004 Waters Corporation梯度洗脱的可变参数梯度洗脱的可变参数?A,B液的化学特性液的化学特性和配比和配比?梯度的起终点及陡度梯度的起终点及陡度?梯度变化的路径梯度变化的路径(梯度曲线形状梯度曲线形状)124356789 10 112004 Waters Corporation梯度曲线的变化凹线梯度曲线的变化凹线Curve 630-100%Curve 730-100%Curve 830-100%2004 Waters Corporation梯度曲线的变化凸线梯度曲线的变化凸线Curve 630-100%Curve 530-100%Curve 430-100%2004 Waters Corporation梯度平衡时间的影响梯度平衡时间的影响?10分钟的梯度，分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复分钟的平衡时间色谱图不重复2004 Waters Corporation梯度平衡时间的影响梯度平衡时间的影响平衡时间6分钟平衡时间7分钟平衡时间8分钟平衡时间9分钟?平衡时间从平衡时间从6到到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到到7分钟的平衡时间不足，而分钟的平衡时间不足，而8到到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足2004 Waters Corporation水中有机污染物的影响水中有机污染物的影响 214 nm0.1 AUFS 254 nm0.1 AUFS?50ml超纯水的有机物污染状态超纯水的有机物污染状态2004 Waters Corporation水中有机污染物的影响水中有机污染物的影响 214 nm0.1 AUFS 254 nm0.1 AUFS?典型的典型的“实验室水实验室水”有大量的有机污染物不适合高灵敏度梯度分析有大量的有机污染物不适合高灵敏度梯度分析2004 Waters Corporation梯度方法开发实例梯度方法开发实例-第一步第一步Curve 60-100%Curve 60-100%?开发一个有开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的条件下柱，在最初的条件下(0-100%乙腈乙腈-水水)，分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长，分离度也不好。，分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长，分离度也不好。2004 Waters Corporation梯度方法开发实例梯度方法开发实例-第二步第二步Curve 650-100%Curve 650-100%?为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例(50-100%，乙腈，乙腈-水水),分离得到改善。但是分离得到改善。但是9个化合物出了个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的2004 Waters Corporation梯度方法开发实例梯度方法开发实例-第三步第三步Curve 650-100%Curve 650-100%?从空白梯度图显示，在同样的色谱条件，同样的检测灵敏度下，共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。从空白梯度图显示，在同样的色谱条件，同样的检测灵敏度下，共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。2004 Waters Corporation梯度方法开发实例梯度方法开发实例-第四步第四步Curve 650-100%Curve 650-100%?空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰）中的第一个小峰对第空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰）中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。2004 Waters Corporation梯度方法开发实例梯度方法开发实例-第五步第五步Curve 550-95%Curve 550-95%?根据根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用的规律，试用5#曲线使曲线使3-9号峰提前号峰提前(曲线曲线5，50-100%B)，但是小峰仍未分出来，改用，但是小峰仍未分出来，改用50-95%B见到变好的趋势见到变好的趋势2004 Waters Corporation梯度方法开发实例梯度方法开发实例-第六步第六步Curve 450-90%Curve 450-90%?最后用最后用50-90%B，曲线，曲线4，得到好的结果，得到好的结果2004 Waters Corporation方法开发的其它因素方法开发的其它因素?流速对柱效的影响流速对柱效的影响不同内径的色谱柱有各自的最佳流速不同内径的色谱柱有各自的最佳流速?样品的进样量样品的进样量(浓度浓度)对柱效的影响对柱效的影响?样品的进样体积对柱效的影响样品的进样体积对柱效的影响?溶剂粘度对柱效的影响溶剂粘度对柱效的影响?以上因素均影响分离度以上因素均影响分离度2004 Waters Corporation结论结论?充分用已知样品结构确定以哪种方法开始充分用已知样品结构确定以哪种方法开始普通反相普通反相?离子抑制离子抑制?离子对离子对?还是其它还是其它?观察流动相条件改变时色谱峰的移动观察流动相条件改变时色谱峰的移动根据变化的方向及大小决定下一步干什么根据变化的方向及大小决定下一步干什么?改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！?色谱柱的改变影响最大色谱柱的改变影响最大