LigandTracer技术讲座 蛋白质-细胞相互作用实时定量测定系统.pdf

ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments abLigandTracer蛋白-细胞相互作用实时定量测定系统倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments ab厂家介绍研发团队来自于Ridgeview Instruments AB，起源于瑞典乌普萨拉大学，素有瑞典的剑桥大学、美苏核竞争见证人之称依托其医学放射学科，2002年首次将其技术商业化LigandTracer，目前唯一专业的蛋白-细胞相互作用实时分析系统乌普萨拉大学在生物技术领域有许多卓越的贡献，比如：色谱技术-蛋白质纯化蛋白质分子量测定诺贝尔奖电泳技术诺贝尔奖层析技术(AKTA)诺贝尔奖SPR技术（Biacore）倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments ab产品介绍：仪器4款机器，不同的检测器LigandTracer Grey 低能量的射线，实时定量125I标记蛋白与细胞互作LigandTracer Yellow 高能量的射线，Tc-99m,In-111,F-18,I-123,I-124 等。以最少的人工操作，获得PET/SPECT标记的时间解析数据LigandTracer White 射线，实时检测如14C and 35SLigandTracer Green 实时检测荧光标记蛋白，如FITC,TexasRed和Alexa Fluor 633等倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments ab产品介绍：操作软件LigandTracer Software1.0适用于所有型号的LigandTracer仪器智能向导将一步一步地引导完成整个实验设置软件还附有视频，里面有软件使用的操作过程除LigandTracer外，还可用于其它仪器特点：一步一步引导的分析设计工具在“帮助”菜单下丰富的技术支持实验方案的智能评价倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments ab产品介绍：分析软件TraceDrawerMADETOMAKEDECISIONS对实时数据进行评估和分析的一个多功能软件。可以进行：动力学分析、评估KD和EC50、比对结果、汇编结果报告除LigandTracer外，还可用于其它仪器主要四大功能：收集：属于同一项目的数据结果(可以是不同格式的数据)比对：创建覆盖式图像比对评估：用高级数学工具计算结合痕量汇编：对实验结果添加您的结论后以报告的形式进行汇编倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments ab最新产品LigandTracer Green 实时定量蛋白-细胞相互作用 多种荧光检测 应用于活细胞或石蜡包埋组织 描绘蛋白-细胞结合的速度 蛋白-细胞结合的时间所示曲线图，反应了孵育过程及洗涤后蛋白-细胞结合情况倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments ab蛋白质相互作用研究蛋白质相互作用研究倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments ab动态的蛋白互作理论KD=kdkaA*BABA+B ABkdka蛋白互作，动态且可逆的过程抗原与抗体结合同时伴随着解离亲和力显示结合的强度，但需在反应达到平衡后平衡所需时间长短不一，几秒或数周，取决于相互作用及浓度倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments ab孵育时间足够长洗涤动作足够快配体的浓度与KD匹配配体受体1：1互作蛋白互作研究假说孵育时间过短，未达到平衡，则错失慢速反应的结合动态范围受限洗涤时间过长，自发的解离反应导致数值偏低，错失动力学结合信息细胞表面异质性特点，可能会有不同糖基化状态、不同构象的受体或其突变体结合。倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments ab蛋白互作检测方法Available methods suitable for real-time cell-based assays SPR/interferometry QCM LigandTracer RIA/Microarray/IF ELISA Y2H FRET Cocrystallization NMR In silico AFM Immunoprecipitation Micro-Cantilevers ITC倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments ab亲和力与动力学三种不同的配体-受体互作。10 nM配体孵育2h，7 h截留结果表明有相同的亲和力1nM，但不同的动力学fast on-fast off配体（绿色）需要不断补充配体，以保持与受体结合slow on-slow off（红色）孵育洗涤后仍与少量配体一直结合亲和力仅是真相的一半20100468h%blocked receptor0倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments ab传统终点法检测孵育时间影响中间速度结合1h孵育不够，需3h孵育相对慢速结合1h、3h、10h孵育均不够，需30h孵育倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments abfast on-fast off，增加配体浓度不会对结合率有大的改变slow on-slow off，增加配体浓度则有更多受体保持长时间的结合20100468 h010 nM30 nM100 nM20100468 h%blocked target0优化洗涤时间优化孵育时间增加配体浓度倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments abLigandTracer VS 终点法LigandTracer终点法终点法1：1假说不受限受限孵育时间不受限受限达到饱和不需要需要配体受体结合慢或快可知未知反应是否达到平衡可知未知时间相关的结合轨迹有无动力学参数有无结合受体定量有无实时信号数据定量检测基于1：1假说终点数据倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments abLigandTracer检测动态的蛋白-细胞相互作用倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments abLigandTracer 技术原理目标细胞在培养皿局部区域生长将培养皿放在倾斜旋转的支架上添加含放射性标记或荧光标记的配体溶液至培养皿在旋转过程中通过安置在培养皿上方的检测器采集信号DetectorCell dishDetectorCell dishTarget cellsMotor倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments abRadiation activityTimeCCCCCCCCCCCCC CDetectorCC细胞一旦结合配体，在旋转通过检测器时就会有信号被采集，出现峰值每转一圈，有新的配体结合上，峰的高度就会随之增加倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments abRadiationintensityTime(min)Peakheight随着标记蛋白与细胞受体的结合，信号峰高度不断变化，反应了互作过程可以研究截留。孵育与洗涤后，不断地记录峰值，得到了吸附与截留曲线图倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments abLigandTracer特点技术方面 实时测量，替代终点饱合法 可以检测 slow on-slow off及 fast on-fast off 结合。快速结合的，随时观察发生的变化；慢速结合的，不用担心孵育时间太短 通过结合迹线及结合水平的变化描绘结合过程，无需细胞计数 反应不达到平衡也能得出正确结论操作方面 很少的准备工作 无需看守长时间运行 减少一次性用品的消耗及人工劳动力倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments abLigandTracer优势经济实惠自动化仪器实时定量检测细胞蛋白互作，任意分钟、小时、天基于细胞、组织、蛋白亲和力及动力学研究高度精确性和极好的重复性EGF-EGFR on A431 cells(normal culturing conditions or starved,with or without Iressa/gefitinib).A,B,C:4 replicatesD:3 replicates倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments abLigandtracer应用倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments ab药物动力学应用低剂量多次服用（绿色）短期内快速产生效果，如安眠药高剂量少次服用（红色）长时间有效，如止痛药试验研究中，fast on-fast off需要快速洗涤，slow on-slow off需要长时间孵育以得到准确结果传统终点法检测会丢失快速结合信息孵育过程中实时研究更为重要，不遗漏快速结合信息，并能得知平衡时间，这是仅测亲和力所无法达到的20100468h%blocked receptor0倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments ab细胞动力学动力学模型1：2，揭示了一个快速和一个慢速的结合CPS1:1理论模式非特异性结合的模型倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments ab蛋白-细胞相互作用LigandTracer Yellow医学诊断实时跟踪蛋白-细胞互作的结合事件吸附&截留主要目的：医学成像与靶标治疗的试剂研发111In与77Lu标记抗体效果类似，选择标记有了灵活性U36能在24h内一直保持40%截留水平，这是诊断影像学的一大进步LigandTracer Green荧光标记用荧光标记和用同位素标记的两组实验反映吸收过程和截留过程是一致的，验证了二款仪器的准确性不同的荧光标记选择，更简单准确的方法051015202530020406080100111In-U36177Lu-U36Time(h)Normalized units倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments ab不同细胞株或克隆之间的比较LigandTracer GreenAlexa Flour488标记单抗单抗的识别位点：anti-uPAR-AbA型细胞结合，B细胞无识别位点。倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments ab蛋白 组织 相互作用LigandTracer Grey125I-Anti-HER2 抗体与异种移植瘤SKOV-3 肿瘤细胞结合，20h后加入未标记抗体与之竞争抗体孵育近20h内1nM抗体被完全吸附，加入未标记抗体后由于相同结合位点的竞争，信号水平减弱。这一减弱是抗体与组织特异性识别与结合的强有力的证明倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments ab非细胞体系：蛋白与蛋白互作LigandTracer Grey用磁珠替代细胞，对标记蛋白结合进行实时跟踪可以应用在放射性药剂、PET等领域的基础研究中曲妥珠单抗与HER2结合曲线不同磁珠数量及不同抗体浓度倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments ab活力测定 51Cr 截留LigandTracer White51Cr 释放的反相 活细胞吸收 Cr 坏死细胞释放 Cr细胞生存实时测定51Cr标记细胞 添加 细胞毒素 坏死一旦出现，信号即被跟踪记录Triton X-100 on A431 cells倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments abDNA合成速度14C-T LigandTracer White细胞接受不同水平的辐照后DNA合成速度对比利用14C-胸腺嘧啶脱氧核苷，实时监测细胞的增殖量化外界辐照对细胞增殖速度的影响拓展应用有毒物质、复制抑制剂和S-期病变对细胞增殖速度的影响辐射条件下细胞DNA损伤和修复、DNA合成同步化等功能研究倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments ab发表文献2011最新文献LigandTracer Yellow and GreyPavel Barta et al.Circumventing the requirement of binding saturation for receptor quantification using interaction kinetic extrapolation.Nuclear Medicine Communications 2011,32:863867LigandTracer GreyHanna Bjo rkelund et al.Gefitinib Induces Epidermal Growth Factor Receptor Dimers Which Alters the Interaction Characteristics with 125I-EGF.PLoS ONESeptember 2011,6(9):e24739.LigandTracer YellowFranc ois Rouzet et al.Radiolabeled Fucoidan as a P-Selectin Targeting Agent for In Vivo Imaging of Platelet-Rich Thrombus and Endothelial Activation.J Nucl Med 2011;52:14331440倍辉科技ridgeviewinstruments abridgeviewinstruments ab发表文献LigandTracer GreenAndersson K et al,Antibody-antigen interactions:What is the required time to equilibrium?Nature Preceedings(2010)LigandTracer GreyBjrkelund H et al,Avoiding false negative results in specificity analysis of protein-protein interactions,Journal of Molecular Recognition(2010)Gedda L et al,Real-time immunohistochemistry analysis of embedded tissue,Applied Radiation and Isotopes 2010,68:23722376Lin X et al,Identification and properties of a receptor for the invertebrate cytokine astakine,involved in hematopoiesis,Experimental Cell Research,Exp Cell Res.2009 15;315(7):1171-80LigandTracer WhiteWang X,Albertioni F,Effect of Clofarabine on Apoptosis and DNA Synthesis in Human Epithelial Colon Cancer Cells,Nucleosides Nucleotides&Nucleic acids 2010 29(4-6):414-418.Vennstrm L et al,Real-time viability assay 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