LC-MS∕MS定性分析思路与方法.pdf

美国应用生物系统中国公司应用技术服务部美国应用生物系统中国公司应用技术服务部LC-MS/MS定性分析思路与方法定性分析思路与方法2Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied BiosystemsLC-MS/MS 定性分析可用的几种方式：定性分析可用的几种方式：综合各种信息：理化性质，来源，NMR，X-RAY，LC-UV等等 库检索-PIS(MS2)-不同的碰撞能量，谱图不同 利用HRMS-QSTAR 直接进样-MSn，LC-MS全扫描，IDA 谱图解析-Prec，NL，Prod等等 标准品对照 合成推断的化合物-验证3Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied Biosystems准备工作准备工作 核对样品,名称,编号 通过询问样品提供人，查阅文献等，了解样品其他知识，例如熔点，沸点，溶解性等理化性质，样品来源，合成路线，光谱，波谱数据等；可能含有的杂质，样品大致含量,等等；样品保存状况，对温度，光敏感否；进行LC-MS分析前最好摸好LC条件，能够基本分离，流动相缓冲体系符合MS要求；色谱柱和管路的清洗新的色谱柱以及分析过大量样品的系统，可能要先冲洗很长时间才能干净,某些样品非常容易吸附在进样阀和管路中，尤其是采用针泵进样时，先用空白溶剂充分清洗管路。4Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied Biosystems准备工作准备工作 如原来溶解样品的溶剂,若不合适LC-MS,N2吹干,再用流动相定量溶解。溶解样品的溶剂一定要和流动相一致，否则得到的谱图不纯，峰形不好，变宽，出怪峰，甚至均为溶剂峰。某些固体直接用流动相不溶，可以先加一滴DMSO，再加甲醇或乙腈等稀释进样顺序要先稀后浓，定量溶解，浓度控制在几个ppM级，不然易污染系统，造成本底太高影响分析结果。浓度非常低的样品不能保存太长时间，容器吸附、分解等原因使样品浓度降低，样品工作液现配现做。5Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied Biosystems色谱柱选择色谱柱选择 选择原则:定性可长些,能够基线分离最好，若做不到，可以通过提取离子XIC来得到较好的色谱图。内径无要求，粗细均可，从5mm到细径柱如2mm,1mm的,用细径柱IS可不分流,对于API2000，3000的TIS，如4.6mm柱用1ml流量时灵敏度还不是最佳,不如流量低时更好，对于Turbo V源，可不分流，灵敏度更高。要对各种厂家的色谱柱有所了解，对于一些特殊的化合物必需使用特殊的色谱柱进行分离。相关的知识可以向色谱柱供应商索取。大多数著名的色谱柱厂商都有自己的色谱柱分析数据库，里面可能会有你想要的信息。6Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied BiosystemsLC条件的优化条件的优化 LC梯度的设定,目的是快速分离,峰形好,缩短时间提高效率,可以将所有化合物都冲出，防止影响下一个样品的测定。采取梯度洗脱，如分析多肽类化合物一般采取梯度洗脱，此时的信号会比等梯度洗脱时强很多，而且可以加大进样量，是提高灵敏度的一种有效措施，但是分析时间较长，且需要有色谱柱平衡的时间。7Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied Biosystems确定离子化方式确定离子化方式 根据样品性质确定离子化方式:高极性化合物,大分子,蛋白质、肽类、低聚核苷酸等生物分子；胺类、季铵盐等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯等,适合ESI(IS)。弱极性/中等极性的小分子，如脂肪酸，邻苯二甲酸等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯、脲等，适合APCI（HN）。ESI不行的：极端非极性化合物如苯等;APCI不行的：非挥发性样品;热稳定性差的样品 碱性化合物宜用正离子方式，酸性化合物宜用负离子方式，如未知,可能正负都要做,有些化合物正负都出峰,选择灵敏度高的方式,不明确的优先用正离子方式试 APPI，适合非极性化合物，同GC/MS有重复，但一般小型台式GC/MS，分子量范围小，APPI比GC/MS可测更高的分子量。8Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied Biosystems初步定性-寻找分子量初步定性-寻找分子量 对于纯样品，首先可采用针泵直接进样，察看存在哪些离子，设置低的DP电压可使谱图简单。通过改变DP，观察离子的增减，M+1、18、23、39、2M+1等等，初步判断分子量 注意要采集一段时间的溶解样品的溶剂本底信息，DP同采样相同，以便扣除本底干扰，可高、低各做一次，例如20V、80V等，所以低流速FIA方式最适合 注意，当样品溶液内含有离子抑制物质时，直接进样可能看不到分子峰，此时需要经色谱柱分离或重新处理样品。选择一种通用的源参数及源位置，以适合大部分样品分析该参数的确定可按照定量方法中FIA优化，通常主要取决于流动相有机溶剂比例和流速。9Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied Biosystems10Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied Biosystems正离子方式常出现如下离子正离子方式常出现如下离子:-Na 22 Da.higher than M+H-K 38 Da.higher than M+H-Li 6 Da.higher than M+H-NH4 17 Da.higher than M+H-ACN 40 Da.higher than M+HM+H2O+H,2M+H,3M+H,2M+Na等特意添加，帮助分析：例如有几个峰无法判断分子离子是哪个，此时加入微量Li+，有可能观察到增加6的峰，而通常碎片峰很少加合。11Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied Biosystems负离子方式常出现如下离子负离子方式常出现如下离子:-TFA 114 Da.higher than M-H(113、227为背景离子)-Acetate 60 Da.higher than M-H-Formic 46 Da.higher than M-H-Cl 36 Da.higher than M-H12Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied BiosystemsLC-MS中常见的本底离子：中常见的本底离子：m/z 15-150,溶剂离子，(H2O)nH+，n=3-112 m/z 102H+乙腈+乙酸,C4H7NO2H+,102.0549 m/z 102,三乙胺,(C2H5)3NH+,102.1283 m/z 149,管路中邻苯二甲酸酯的酸酐,C8H4O3H+,149.0233 m/z 288,2mm 离心管的产生的特征离子 m/z 279,管路中邻苯二甲酸二丁酯 C16H22O4H+,279.1591 m/z 316,2mm 离心管的产生的特征离子 m/z 384,瓶的光稳定剂产生的离子 m/z 391,管路中邻苯二甲酸二辛酯,C24H38O4H+,391.2843 m/z 413,邻苯二甲酸二辛酯+钠,C24H38O4Na+,413.2668 m/z 538,乙酸+氧+铁（喷雾管）,Fe3O(O2CCH3)6,537.879313Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied Biosystems同位素离子同位素离子 各种元素的同位素，基本上按照其在自然界的丰度比出现在质谱中，这对于利用质谱确定化合物及碎片的元素组成有很大方便，如氯35和37，溴79和81。同位素分布图，可用Analyst中计算器功能模拟，对于分子量较大，含C较多的分子，最高峰可能是C13同位素峰，还有含锡化合物，会产生一系列峰，所以分析数据时要注意。还可利用稳定同位素合成标记化合物，如：氘等标记化合物，再用质谱法检出这些化合物,在质谱图外貌上无变化，只是质量数的位移，从而说明化合物结构，反应历程等。14Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied Biosystems质量色谱-提取离子（XIC）质量色谱-提取离子（XIC）特征离子的质量色谱在复杂混合物分析及痕量分析时是 LCMS测定中最有用的谱图，当样品浓度很低时LCMS的TIC上往往看不到峰，此时，根据上一步得到的分子量信息，输入M+1或M+23等数值,观察提取离子的质量色谱图，检验直接进样得到的信息是否在LC-MS上都能反映出来，确定LC条件是否合适，以后进行MRM等其他扫描方式的测定时参考。调机时，注意标尺不要偏差太大，先用标准品校准仪器，如偏差很小，可不用重新校准仪器，读取分子量数值时要多采集几次，平均或累加后打出质谱图，这样相对准确。15Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied Biosystems16Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied Biosystems影响分子量测定的因素影响分子量测定的因素 PH的影响-正离子方式PH要低些，负离子方式PH要高些，除对离子化有影响外,还影响LC的峰形 气流和温度，当水含量高及流量大时要相应增加 溶剂和缓冲液流量，流速适当高可以提高出峰灵敏度 溶剂和缓冲液的类型,通常正离子甲醇好，负离子乙腈好些，不挥发性盐的影响-大量累积使仪器灵敏度下降 根据样品结构和性质，选择合适的液相色谱类型：正相、反相、C4、C18 合适的电压-样品在源内分解或碎裂，高DP电压多电荷离子比例低，多聚体也少，温度、DP电压要适当 杂质的影响：溶剂的纯度、水的纯净程度等。当成分复杂，杂质太多时，竞争使被测物离子化不好，同时使LC分离不好 样品浓度不够：有时需要浓缩17Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied Biosystems样品的预处理常用方法样品的预处理常用方法：a）超滤b）溶剂萃取去盐c）固相萃取d）灌注（Perfusion）净化去盐e）色谱分离反相色谱分离亲和技术分离f）沉淀蛋白-甲醇/乙睛g）酸水解，酶解h）衍生化18Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied Biosystems目标化合物检测目标化合物检测 对目标化合物检测，如果是纯样，则直接进行Product Scan，找出碎片信息，同样要扣本底。做Product Scan时，注意输入母离子质荷比小数点后的位数，输入要准，灵敏度才高，而且不容易出错，得到的谱图相对干净。处理得到的数据，一种方法是库检索，另外就是手工谱图解析。为了库检索，可设20，35，50V各打一张MS2图(QTRAP用户可以使用新的CES功能：三张谱叠加)。因为化合物性质不同，需要CE不同，推测可以高、低能分别碰撞，高质量区的碎片和低质量区碎片对推测结构都重要，低能量更能判断主要碎片，高能量可看到更多信息，解析参考质谱解析书。若为混合物或含有基质的实际样品，则首先由标准品建立方法，按照定量的步骤，选择至少2对MRM（四个数据点），进行LC-MS/MS分析，可以利用IDA，MRM-MS2工作流程，提高检测灵敏度。19Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied Biosystems20Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied Biosystems21Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied Biosystems未知化合物鉴定未知化合物鉴定-谱图解析谱图解析 IDA：Full Scan-MS2，一次进样，得到大部分信息，进一步可以再细一些，采用灵敏度更高的方法确证。加大DP，串联四极杆实现MS3，定性。前体离子扫描PREC：寻找代谢产物，结构解析，如肽磷酸化位点；中性碎片丢失扫描NL：结构解析 互补性方法，选已知同系物，研究其裂解规律，有共同的碎片或相差同样质量数，再扩展到未知物。例：天然产物结构分析的一种思路。22Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied Biosystems23Date|AB CONFIDENTIALOpportunities in the Services and System Solutions Market 2006 Applied Biosystems综合考察天然混合物中感兴趣化合物的结构类型、结构特征等探索被分析天然产物的合适质谱手段、深入细致地考察相同结构类型单体化合物的质谱行为及其与结构的相关性推测微量成分的可能结构结合NMR及LC-NMR方法验证结构开展天然混合物中相关成分的LC-UV、()ESI-MSn、HR、LC-MS及LC-MSn谱分析