酶联免疫吸附试验ELISA.pptx

试验五试验五 1.1.酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA)ELISA)2.2.补体结合反应补体结合反应酶联免疫吸附试验ELISA第1页1.1.酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA)ELISA)酶联免疫吸附试验ELISA第2页免疫标识技术免疫标识技术1.1.定义：定义：2.2.将抗原将抗原-抗体反应与标识技术相结合，用抗体反应与标识技术相结合，用放放射性同位素、酶或荧光素射性同位素、酶或荧光素标识已知抗体或抗原，经标识已知抗体或抗原，经过检测标识物，间接测定未知抗原或抗体。过检测标识物，间接测定未知抗原或抗体。2.2.分类：分类：放射免疫测定法：放射免疫测定法：131131I I，3232P P免疫荧光技术：免疫荧光技术：FITCFITC，PEPE免疫酶测定法：免疫酶测定法：HRPHRP，APAP酶联免疫吸附试验ELISA第3页免疫酶测定法免疫酶测定法(E Enzyme nzyme I ImmunommunoA Assay,EIA)ssay,EIA)用酶标识抗原或抗体进行抗原抗体反应。用酶标识抗原或抗体进行抗原抗体反应。用酶标识抗原或抗体进行抗原抗体反应。用酶标识抗原或抗体进行抗原抗体反应。辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)(HRP)(HRP)，碱性磷酸酶，碱性磷酸酶，碱性磷酸酶，碱性磷酸酶(AP)(AP)(AP)(AP)特点：特点：特点：特点：高度特异性：保持抗原抗体反应特异性高度特异性：保持抗原抗体反应特异性高度特异性：保持抗原抗体反应特异性高度特异性：保持抗原抗体反应特异性 高灵敏度：酶催化底物显色高效性，高灵敏度：酶催化底物显色高效性，高灵敏度：酶催化底物显色高效性，高灵敏度：酶催化底物显色高效性，pgpgpgpg水平微量检测水平微量检测水平微量检测水平微量检测 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 分类：分类：分类：分类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶免疫组化法：酶免疫组化法：酶免疫组化法：酶免疫组化法：组织中或细胞表面抗原。组织中或细胞表面抗原。组织中或细胞表面抗原。组织中或细胞表面抗原。酶联免疫吸附试验ELISA第4页酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(E E E Enzyme-nzyme-nzyme-nzyme-L L L Linked inked inked inked I I I ImmunommunommunommunoS S S Sorbent orbent orbent orbent A A A Assay,ELISA)ssay,ELISA)ssay,ELISA)ssay,ELISA)用酶标识抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）用酶标识抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原方法。中未知抗体或抗原方法。1.1.定义定义2.2.分类分类间接法（间接法（间接法（间接法（Indirect ELISAIndirect ELISA）：）：）：）：将已知抗原吸附于固相载体，酶标识二抗将已知抗原吸附于固相载体，酶标识二抗检测液相中未知抗体检测液相中未知抗体双抗体夹心法（双抗体夹心法（双抗体夹心法（双抗体夹心法（Sandwich ELISA)Sandwich ELISA)：将已知抗体吸附于固相载体，酶标识一抗将已知抗体吸附于固相载体，酶标识一抗检测液相中可溶性抗原检测液相中可溶性抗原竞争法（竞争法（竞争法（竞争法（Competitive ELISA)Competitive ELISA)：将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标识抗原或将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标识抗原或抗体抗体检测液相中可溶性抗原或抗体检测液相中可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验ELISA第5页酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(E E E Enzyme-nzyme-nzyme-nzyme-L L L Linked inked inked inked I I I ImmunommunommunommunoS S S Sorbent orbent orbent orbent A A A Assay,ELISA)ssay,ELISA)ssay,ELISA)ssay,ELISA)3.3.原理原理（以间接性（以间接性ELISA为例）为例）：显色显色显色显色酶联免疫吸附试验ELISA第6页试验内容：试验内容：间接法测定溶血素间接法测定溶血素 定性检测定性检测酶联免疫吸附试验ELISA第7页试验材料试验材料脱纤维绵羊红细胞脱纤维绵羊红细胞 抗原抗原兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素）兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素）待测兔血清待测兔血清HRPHRP标识羊抗兔标识羊抗兔IgG IgG 二抗二抗包被缓冲液：包被缓冲液：0.05M pH9.60.05M pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液洗涤液：含洗涤液：含0.05%Tween 200.01M pH7.4 PBS0.05%Tween 200.01M pH7.4 PBS底物缓冲液：底物缓冲液：pH5.0 pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液磷酸盐柠檬酸缓冲液底物溶液：底物溶液：OPD 10mgOPD 10mg，底物缓冲液，底物缓冲液25ml25ml，30%H30%H2 2O O2 2 40L 40L酶标板，酶标仪酶标板，酶标仪酶联免疫吸附试验ELISA第8页试验方法试验方法1.1.抗原处理：抗原处理：脱纤维绵羊血脱纤维绵羊血脱纤维绵羊血脱纤维绵羊血加加加加3mL N.S3mL N.S3mL N.S3mL N.S，混匀，混匀，混匀，混匀rpmrpmrpmrpm，5min5min5min5min加加加加3mL N.S3mL N.S3mL N.S3mL N.S，混匀，混匀，混匀，混匀rpmrpmrpmrpm，5min5min5min5min取取取取2mL2mL2mL2mL压积红细胞压积红细胞压积红细胞压积红细胞加入加入加入加入2mL2mL2mL2mL蒸馏水，震荡破碎红细胞蒸馏水，震荡破碎红细胞蒸馏水，震荡破碎红细胞蒸馏水，震荡破碎红细胞用包被缓冲液稀释成用包被缓冲液稀释成用包被缓冲液稀释成用包被缓冲液稀释成1 1 1 1：400400400400备用备用备用备用2.2.包被抗原：包被抗原：取酶标板，加入取酶标板，加入取酶标板，加入取酶标板，加入100L/100L/100L/100L/孔抗原稀释液孔抗原稀释液孔抗原稀释液孔抗原稀释液4444，湿盒内，湿盒内，湿盒内，湿盒内，18h18h18h18h酶联免疫吸附试验ELISA第9页取出包被好抗原酶标板（取出包被好抗原酶标板（4 4孔孔/组），甩干孔内液体组），甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次3.3.加待测血清加待测血清标识各孔，加入对应液体标识各孔，加入对应液体100L/100L/孔孔1234阴阴性性空空白白阳阳性性待待测测4.4.加二抗：加二抗：3737，湿盒内，湿盒内，30min30min甩干孔内液体甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次各孔加入酶标二抗各孔加入酶标二抗100L/100L/孔孔3737，湿盒内，湿盒内，30min30min5.5.显色：显色：甩干孔内液体甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次加入底物溶液加入底物溶液100L/100L/孔孔避光显色，避光显色，10min10min6.6.观察结果观察结果试验方法试验方法酶联免疫吸附试验ELISA第10页预期结果预期结果阳性：显色为黄色阳性：显色为黄色阴性：无色阴性：无色1 2 3 4阴性阴性阴性阴性 阳性阳性阳性阳性酶联免疫吸附试验ELISA第11页注意事项注意事项洗涤彻底，防止交叉污染。洗涤彻底，防止交叉污染。按次序加样，孔底无气泡。按次序加样，孔底无气泡。包被和温育在湿盒内进行。包被和温育在湿盒内进行。酶联免疫吸附试验ELISA第12页2.2.补体结合反应补体结合反应（Complement fixation Test,CFT）酶联免疫吸附试验ELISA第13页概念：概念：补体结合反应：补体结合反应：是指在是指在补体补体参加下，以绵羊红细胞参加下，以绵羊红细胞（SRBCSRBC）和溶血素（抗）和溶血素（抗SRBCSRBC抗体）作为抗体）作为指示指示系统系统抗原抗体反应抗原抗体反应。酶联免疫吸附试验ELISA第14页补反中包含补反中包含两个系统两个系统五种成份：五种成份：待检系统：已知待检系统：已知AgAg或或AbAb、待检、待检AbAb或或AgAg及仅及仅供一组供一组Ag-AbAg-Ab系统反应定量补体。系统反应定量补体。指示系统：绵羊红细胞和溶血素。指示系统：绵羊红细胞和溶血素。原理：原理：酶联免疫吸附试验ELISA第15页待测系统待测系统待测系统待测系统抗原抗原抗原抗原+未知血清未知血清未知血清未知血清1 2补体补体补体补体12Step 1 Step 1 抗原抗体复合物形成抗原抗体复合物形成抗原抗体复合物形成抗原抗体复合物形成Step 2Step 2补体结合和耗竭补体结合和耗竭补体结合和耗竭补体结合和耗竭指示系统指示系统指示系统指示系统SRBC+SRBC+抗抗抗抗SRBCSRBC抗体抗体抗体抗体Step 3Step 3SRBCSRBC裂解裂解裂解裂解121：No Ab；2：Ab酶联免疫吸附试验ELISA第16页AgY待测血清待测血清 YYYYYYYYAb阳性阳性No Ab阴性阴性AgAgAg酶联免疫吸附试验ELISA第17页抗原：伤寒菌裂解产物抗原：伤寒菌裂解产物待测血清：待测血清：56，30min补体：豚鼠血清补体：豚鼠血清2%绵羊红细胞绵羊红细胞溶血素溶血素材料：材料：酶联免疫吸附试验ELISA第18页方法：方法：12345试验管试验管试验管试验管血清血清血清血清对照管对照管对照管对照管抗原抗原抗原抗原对照管对照管对照管对照管补体补体补体补体对照管对照管对照管对照管SRBCSRBC对照管对照管对照管对照管待测血清待测血清待测血清待测血清0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.4mL0.4mL0.8mL0.8mL抗原抗原抗原抗原补体补体补体补体 N.S N.S摇匀，摇匀，摇匀，摇匀，3737，水浴，水浴，水浴，水浴15min15min溶血素溶血素溶血素溶血素SRBCSRBC0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL 摇匀，摇匀，37，水浴，水浴15min（1份份/2人）人）酶联免疫吸附试验ELISA第19页预期结果：预期结果：1 1管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。明呈红色为溶血。溶血溶血不溶血不溶血2.2.试验管试验管血清对照管血清对照管抗原对照管抗原对照管补体对照管补体对照管SRBCSRBC对照管对照管？溶血溶血溶血溶血溶血溶血不溶血不溶血酶联免疫吸附试验ELISA第20页绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可猛烈震荡。各种试剂吸管不可混用。注意事项：注意事项：酶联免疫吸附试验ELISA第21页