15新型PCR检测技术解析.pptx

第第15讲讲新新型型PCR检测技技术回顾上节课所学回顾上节课所学PCR五个要素五个要素模板：单链或双链模板：单链或双链DNA引物：引物：16-30 bp合成的寡合成的寡核苷酸核苷酸DNA聚合酶：耐热的聚合酶：耐热的Taq底物：四种脱氧三磷酸核底物：四种脱氧三磷酸核苷苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)液态反应体系：其中液态反应体系：其中Mg2+是是DNA聚合酶的激聚合酶的激活剂活剂基本程序基本程序94 30s 变性50-60 30-1 复性（使引物与模板充分退火）72 n(按1扩增1kb计算）延伸 25-35个循环基本内容基本内容一、多重一、多重PCRPCR二、二、荧光定量荧光定量PCRPCR的原理的原理三、三、实时实时荧光定量荧光定量PCRPCR的原理的原理四、四、实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR与常规的与常规的PCRPCR的差别的差别五、实时荧光定量五、实时荧光定量PCRPCR的应用的应用六、课堂小结六、课堂小结七、作业七、作业一、一、多重多重PCR1、定定义：它是在同一它是在同一PCR反反应体系里加上体系里加上二二对以上引物以上引物，同，同时扩增出多个核酸片段增出多个核酸片段的的PCR反反应，其反，其反应原理，反原理，反应试剂和操作和操作过程与程与一般一般PCR相同相同。区别在多对引物需要设计。区别在多对引物需要设计。2、多重多重PCR的的步步骤：多重多重PCR扩增区域的增区域的选择。多对多对引物的引物的设计。反反应条件的条件的选择及反及反应体系的体系的优化（化（引物引物浓度、模板度、模板浓度、度、dNTP及及酶的的浓度、度、Mg2+浓度、加入度、加入DMSO、甘油或者、甘油或者BSA、PCR循循环参数的参数的设定定）。结果分析果分析一、多重一、多重PCR一、多重一、多重PCR3 3、多重、多重PCRPCR的特点的特点高效性高效性 在同一在同一PCRPCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体。多种病原体。系统性系统性 多重多重PCRPCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检。菌战剂的同时侦检。经济简便性经济简便性 多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。的诊断信息。一、多重一、多重PCR4、多重、多重PCR的的应用用（5个实例）个实例）例一例一 肝炎病毒的感染，在同一病人体内，有肝炎病毒的感染，在同一病人体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染存在多种肝炎病毒重叠感染。有有时是甲是甲乙丙型肝炎病毒重叠乙丙型肝炎病毒重叠;有有时可能是甲乙型肝可能是甲乙型肝炎病毒重叠炎病毒重叠;有有时是乙丙型肝炎病毒重叠是乙丙型肝炎病毒重叠.一、多重一、多重PCR4、多重、多重PCR的的应用用（5个实例）个实例）例二例二 肠道致病性道致病性细菌的菌的检测，如，如伤寒，痢疾寒，痢疾和霍乱，有和霍乱，有时具有具有较相同的相同的肠道症状道症状，有，有时痢疾霍乱同存一病人并同痢疾霍乱同存一病人并同时发病病.一、多重一、多重PCR4、多重、多重PCR的的应用用（5个实例）个实例）例三例三 性病的性病的检测，如梅毒，淋病及艾滋病的，如梅毒，淋病及艾滋病的诊断断.战伤细菌及生物菌及生物战剂细菌的菌的检测，如破，如破伤风杆菌，杆菌，产气气荚膜杆菌，炭疽杆菌，鼠疫膜杆菌，炭疽杆菌，鼠疫杆菌等杆菌等侦检.需特殊培养的无芽胞需特殊培养的无芽胞厌氧菌，氧菌，如脆弱如脆弱类杆菌、杆菌、艰难杆菌的杆菌的鉴定等定等.一、多重一、多重PCR4、多重、多重PCR的的应用用（5个实例）个实例）例四例四 某些某些遗传病及癌基因的分型病及癌基因的分型鉴定定。遗传遗传病或癌基因，型病或癌基因，型别较多，或突多，或突变或缺失存在或缺失存在多个好多个好发部位部位，通，通过常常规PCR很很难检测出出来。来。例五例五 植物种质鉴定、植物病毒的检测、分子植物种质鉴定、植物病毒的检测、分子育种、快速检测外源基因的整合状态。育种、快速检测外源基因的整合状态。一、多重一、多重PCR二、二、荧光定量光定量PCR的原理的原理 荧光定量荧光定量PCRPCR技术不仅实现了技术不仅实现了PCRPCR从从定性定性到到定量定量的飞跃，而且与的飞跃，而且与常规常规PCRPCR相比，它具有相比，它具有特异性更强、特异性更强、有效解决有效解决PCRPCR污染问题、自动化程污染问题、自动化程度高度高等特点，目前已得到广泛应用。等特点，目前已得到广泛应用。二、二、荧光定量光定量PCR的原理的原理荧光定量荧光定量PCRPCR最常最常用于用于基因表达产物基因表达产物的分析，即将转录的分析，即将转录生成的生成的单链单链mRNAmRNA逆逆转录成转录成双链的双链的cDNAcDNA,以此以此cDNAcDNA为为模板进行反应。模板进行反应。（动画动画）荧光定量荧光定量PCRPCR所使用的荧光化学可分为两种：所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针荧光探针和和荧光染料荧光染料。1、荧光探光探针 PCR PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性特异性的的荧荧光探针光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧报告荧光基团光基团和一个和一个淬灭荧光基团淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；的荧光信号被淬灭基团吸收；PCRPCR扩增时，扩增时，TaqTaq酶的酶的5533外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩每扩增一条增一条DNADNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与累积与PCRPCR产物形成完全同步。产物形成完全同步。荧光信号的强弱与荧光信号的强弱与PCRPCR的产物数量成正比，根据测量到的产物数量成正比，根据测量到的荧光信号强弱，通过的荧光信号强弱，通过分析软件分析软件得到样本的原始拷贝数。得到样本的原始拷贝数。二、荧光定量二、荧光定量PCR的原理的原理1、荧光探光探针 二、荧光定量二、荧光定量PCR的原理的原理1、荧光探光探针 二、荧光定量二、荧光定量PCR的原理的原理1、荧光探光探针 二、荧光定量二、荧光定量PCR的原理的原理1、荧光探光探针 二、荧光定量二、荧光定量PCR的原理的原理1、荧光探光探针 二、荧光定量二、荧光定量PCR的原理的原理 2 2、荧光染料、荧光染料 在在PCRPCR反应体系中，加入反应体系中，加入过量荧光染料过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入荧光染料特异性地掺入DNADNA双链后，发射荧双链后，发射荧光信号，光信号，而而不掺入链中不掺入链中的的SYBRSYBR染料分子不染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与的增加与PCRPCR产物的增加完全同步产物的增加完全同步。二、荧光定量二、荧光定量PCR的原理的原理2 2、荧光染料、荧光染料二、荧光定量二、荧光定量PCR的原理的原理2 2、荧光染料、荧光染料二、荧光定量二、荧光定量PCR的原理的原理观看视频动画观看视频动画荧光探针特异性高探针设计要求高合成费用高多重PCR检出荧光染料简便易行价格便宜要求反应的特异性不能进行多重PCR二、荧光定量二、荧光定量PCR的原理的原理3 3、荧光探针和荧光染料的区别、荧光探针和荧光染料的区别荧光探针SNP解析病毒、病原菌的检测荧光染料mRNA表达量分析二、荧光定量二、荧光定量PCR的原理的原理4 4、荧光探针和荧光染料的用途、荧光探针和荧光染料的用途三、实时荧光定量三、实时荧光定量PCR的原理的原理 1、Ct 值 在在荧光定量光定量PCR技技术中，有一个很重中，有一个很重要的概念要的概念-Ct值。C代表代表Cycle，t代表代表threshold（临界（临界值）。值）。Ct值的的含含义是：是：每个反每个反应管内的管内的荧光光信号到达信号到达设定的域定的域值时所所经历的的循循环数数。2、Ct值与起始模板的关系与起始模板的关系每个模板的每个模板的Ct值与与该模板的模板的起始拷起始拷贝数数的的对数数存在存在线性关系，起始拷性关系，起始拷贝数越多，数越多，Ct值越小。利用已知起始拷越小。利用已知起始拷贝数的数的标准品准品可作出可作出标准曲准曲线，其中横坐，其中横坐标代表起代表起始拷始拷贝数的数的对数，数，纵坐坐标代代表表Ct值。三、实时荧光定量三、实时荧光定量PCR的原理的原理 三、实时荧光定量三、实时荧光定量PCR的原理的原理 Ct起始拷贝数或起始浓度起始拷贝数或起始浓度标准曲线标准曲线三、三、实时荧光定量光定量PCR原理原理3、数据测定、数据测定 在实时荧光定量在实时荧光定量PCR的反应体系中，的反应体系中，随随着循着循环次数的增加，被次数的增加，被扩增的目的基因片段增的目的基因片段呈指数呈指数规律增律增长，通，通过实时检测与之与之对应的的随随扩增而增而变化化荧光信号光信号强度度，求得求得Ct值。再再利用数个已知模板利用数个已知模板浓度的度的标准品准品作作对照，即可得出待照，即可得出待测标本本目的基因的拷目的基因的拷贝数数。三、三、实时荧光定量光定量PCR原理原理3、数据测定、数据测定三、三、实时荧光定量光定量PCR原理原理3、数据测定、数据测定Rn(荧光信号荧光信号)循环数循环数Cycle Number三、三、实时荧光定量光定量PCR原理原理3、数据测定、数据测定操作过程操作过程四、实时荧光定量四、实时荧光定量PCR与常规与常规PCR的差别的差别2、分析对象的差别：、分析对象的差别：1、原理的差别：、原理的差别：动画视频动画视频四、实时荧光定量四、实时荧光定量PCR与常规与常规PCR的差别的差别3、使用仪器及结果输出形式的差别：、使用仪器及结果输出形式的差别：五、五、实时荧光定量光定量PCR的的应用用1.病原体检测病原体检测 2.产前诊断产前诊断 3.药物疗效考核药物疗效考核 4.肿瘤基因检测肿瘤基因检测 5.新药开发研究新药开发研究 6.超早期感染用药物及疗法的研究与开发超早期感染用药物及疗法的研究与开发 1、病原体病原体检测 目前，采用目前，采用荧光定量光定量PCR检测技技术可以可以对淋球菌、沙眼衣原体、解淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人支原体、人类乳乳头瘤病毒、瘤病毒、单纯疱疹病毒、人疱疹病毒、人类免疫免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分核分枝杆菌、枝杆菌、EB病毒和巨病毒和巨细胞病毒等病原体胞病毒等病原体进行定量行定量测定。与定。与传统的的检测方法相比具有方法相比具有灵敏度高、取灵敏度高、取样少、快速少、快速简便便等等优点。点。五、实时荧光定量五、实时荧光定量PCR的应用的应用2、产前前诊断断 到目前到目前为止，人止，人们对遗传性物性物质改改变引起的引起的遗传性疾病性疾病还无法治无法治疗，只能通，只能通过产前前监测，减少病，减少病婴出生，以防止各出生，以防止各类遗传性疾病的性疾病的发生生。如如为减少减少X连锁遗传病患儿的出生，从病患儿的出生，从孕孕妇的外周血中分离胎儿的外周血中分离胎儿DNA，用，用实时荧光定量光定量PCR检测其其Y性性别决定区基因是一决定区基因是一种无种无创伤性的方法，易性的方法，易为孕孕妇所接受。所接受。五、实时荧光定量五、实时荧光定量PCR的应用的应用3、药物物疗效考核效考核 比如，对乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒(HBV)、丙型、丙型肝炎病毒肝炎病毒(HCV)定量分析定量分析显示：示：病毒量与病毒量与某些某些药物的物的疗效关系。效关系。HCV高水平表达，高水平表达，干干扰素治素治疗作用不敏感。作用不敏感。五、实时荧光定量五、实时荧光定量PCR的应用的应用 癌基因的表达增加和突癌基因的表达增加和突变，在，在许多多肿瘤早期瘤早期就可以出就可以出现。实时荧光定量光定量PCR不不但能有效地但能有效地检测到基因的突到基因的突变，而且可以，而且可以准确准确检测癌基因的癌基因的表达量表达量。目前用此方法目前用此方法进行行过端粒端粒酶hTERT基基因、慢性粒因、慢性粒细胞性白血病胞性白血病WT1基因、基因、肿瘤瘤ER基因、前列腺癌基因、前列腺癌PSM基因、基因、肿瘤相关的瘤相关的病毒基因等多种基因的表达病毒基因等多种基因的表达检测。五、五、实时荧光定量光定量PCR的的应用用4、肿瘤基因检测、肿瘤基因检测 5、新新药开开发研究研究 针对一些感染性疾病的一些感染性疾病的药物，如各种病毒病、物，如各种病毒病、细菌病等，在新菌病等，在新药的开的开发过程中，快速了解程中，快速了解药物物对疾病疾病进程的影响可以程的影响可以为新新药开开发节约大量的人大量的人力、力、时间和和资金，与以前所用的常金，与以前所用的常规方法相比，方法相比，实时荧光定量光定量PCR技技术可以快速、准确、定量、可以快速、准确、定量、灵敏地灵敏地测定血液或定血液或组织中病原体的含量，因此有中病原体的含量，因此有利用分析利用分析药物的作用效果，物的作用效果，为比比较不同的配方的不同的配方的疗效、用效、用药量、用量、用药时间等等提供快速、定量的等等提供快速、定量的评价。价。五、实时荧光定量五、实时荧光定量PCR的应用的应用6、超早期感染用超早期感染用药物及物及疗法的研究与开法的研究与开发 实时荧光定量光定量PCR方法方法测定是血液中病定是血液中病毒核酸的含量，因此不必等到病人体内毒核酸的含量，因此不必等到病人体内产生抗体，同生抗体，同时，由于其灵敏度与由于其灵敏度与Elisa相比相比不可同日而不可同日而语，在病毒感染的早期，即血在病毒感染的早期，即血液中病毒含量很低液中病毒含量很低时就可以就可以测定。因此就定。因此就出出现了一个新的了一个新的领域，即在病毒或域，即在病毒或细菌含菌含量很低量很低时如何用如何用药，用什么，用什么药以及用以及用药量量等等进行研究，行研究，为将疾病消将疾病消灭在超早期作出在超早期作出贡献。献。五、实时荧光定量五、实时荧光定量PCR的应用的应用六、课堂小结六、课堂小结七、作业：七、作业：CT CT值？值？O(_)O 谢谢！