细菌培养及检测.pptx

目录第一讲微生物细菌学第二讲细菌培养第三讲大肠杆菌第四讲金黄色葡萄球菌第五讲真菌学及其检测第六讲微生物学及其检测第一讲 微生物细菌学细菌的定义细菌的形态细菌的结构细菌的生理细菌的定义细菌是一类具有细胞壁的单细胞原核型微生物。通常使用显微测微尺来测量细菌的大小，以微米（m）作为测量单位细菌的形态1.球形 双球菌：肺炎双球菌2.链球菌：乳酸链球菌3.葡萄球菌：金黄色葡萄球菌细菌的结构基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞浆、核质特殊结构：荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢.球菌形态细菌的结构及功能细菌的结构及功能基本结构由外到内细菌的依次是 细胞壁、细胞膜、细胞浆 和核质。特殊结构有荚膜、鞭毛、菌毛和芽孢。其中能维持细菌的固有形态的结构是细胞壁，控制遗传性状的是 核质，与细菌的毒力有关的结构是 荚膜和菌毛，抵抗力强 的是 芽孢，决定细菌有无运动性的结构是 鞭毛。芽孢菌体细菌的生理水分（7090）：游离水和结合水固形物(1030）：有机物（蛋白质、核酸、糖类、脂类、其他）和无机物细菌的化学组成细菌的化学组成1、自养菌：自养菌具有完备的酶系统，合成能力较强，能以简单的无机碳化物作为碳源，合成菌体所需的有机物质。2、异养菌：异养菌不具备完备的酶系统，合成能力较差，必须利用有机物作为碳源，其代谢所需能量大多从有机物氧化中获得。致病菌多属异养菌，寄生菌多属自养菌。细菌的营养类型细菌的营养类型水、含碳化合物、含氮化合物、无无机盐细菌的营养物质细菌的营养物质1、细菌繁殖生长的条件：营养物质（五种营养成分）、温度（最适生长温度37）、pH（最适7.27.6）、渗透压（多在等渗条件下）、气体（根据细菌呼吸类型）2、细菌的繁殖方式：简单的二分裂细菌的生长繁殖细菌的生长繁殖第二讲 细菌培养根据某种细菌的营养需要而选择多种原料配制而成的培养基，不仅含有这种细菌生长繁殖所需要的各种营养物质，还要有适宜的PH。本实验所用的牛肉膏蛋白胨培养基，应用较广泛，适于芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等多种细菌的培养。配置好的培养基必须经过灭菌。对不同的材料应当采取不同的灭菌方法。培养基一般采用高压蒸汽灭菌法，就是将待灭菌的培养基放入密闭的高压灭菌锅内，通过加热是锅内的冷空气排进以后。关闭排气阀并继续加热，这是锅内的压力就会升高，最终使菌体蛋白质凝固变性，从而达到灭菌的目的。接种环是用火焰灼烧灭菌的。将某种菌种在彻底灭菌的培养基上，经过一段时间的培养后，就能够得到生长良好的细菌群体，它们在培养基上会呈现一定的形态特征。1、通过对牛肉膏蛋白胨培养基的配置，了解配置培养基的一般步骤和方法。2、了解灭菌的基本原理，以及实验中常用的灭菌方法。3、初步学会细菌培养的基本技术。一、细菌培养的实验原理二、目的要求大肠杆菌的生长状态 芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌、牛肉膏、蛋白胨、琼脂。天平、角匙、200mL烧杯、试管、漏斗、量筒、玻璃棒、滴管、胶管弹簧夹、铁架台、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、纱布、棉花、牛皮纸、线绳、标签、接种环、精密pH试纸（或pH计）、金属小筐、高压蒸汽灭菌锅、恒温箱 NaCl、1mol/L的NaOH溶液、体积分数为75%的酒精溶液、蒸馏水。三、材料用具四、细菌培养的方法和步骤（五）、培养（四）、接种（三）、搁置斜面（二）、灭菌（一）、培养基的配置用天平称取0.5g牛肉膏、1g蛋白胨、0.5gNaCl、2g琼脂。将称好的牛肉膏、蛋白胨和NaCl放入烧杯。称量 向上述烧杯中加入蒸馏水100ml，用玻璃棒搅匀后，放到酒精灯上加热。当牛肉膏和蛋白胨溶化后，加入琼脂，并继续用微火加热，在琼脂溶化的过程中，要控制火力的大小并且不断搅拌，以免培养基溢出或烧焦。待琼脂安全溶化后，补加蒸馏水至100ml。溶化用滴管逐滴滴入1mol/L的NaCl溶液，边滴边搅拌，并随时用pH试纸测pH，直到pH为7.47.6为止。调pH将培养基趁热分类到洁净的试管中，培养基的高度约为试管高度的1/5.注意:分装时不要将培养基沾在管口和试管上段，以免引起污染。分装培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。加棉塞时，应使棉塞长度的2/3哎试管口内。加棉塞（一）、培养基的配置 每10支试管用线绳捆成一捆，并且在管口外面包上一层牛皮纸，然后，用线绳扎好。在每捆试管外挂上标签，注明培养基名称、配制日期和制作者姓名。包扎1打开高压蒸汽灭菌锅，将里面的灭菌桶取出，向锅内加水（最好用开水），水面与底架平齐为宜。23456排出锅内的冷空气。接通电源，当压力上升到49KPa时，打开排气阀放气，当压力降到0是时，关闭排气阀。重复上述放气过程一次，以彻底排出锅内的冷空气。当锅内的压力上升到98KPa时，控制火力大小，使压力维持在98KPa左右20min。切断电源。将扎好的试管管口向上竖放在灭菌桶内，再将灭菌桶放回灭菌锅。注意：灭菌桶内的物品不能放得太挤，否则影响灭菌效果。加盖，并将排气软管插入灭菌桶的排气槽内。以两两对称的方式，同时旋紧相对的两个紧固螺栓，以防漏气。当压力降至0以后，打开排气阀，10min以后，旋松紧固螺栓，取出试管。最后。将灭菌锅里的水排放干净。（二）、灭菌（三）、搁置斜面当培养基冷却50左右时，将试管带棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的一半。（四）、接种13245用肥皂将双手洗净，擦干，再用酒精（75）棉球擦拭双手。当手上的酒精挥发完毕以后，点燃酒精灯。注意：一定要等手上的酒精挥发完毕后，在点燃酒精灯，否则，容易将手烧伤。接种 注意：整个实验操作过程都要小心谨慎，不要碰翻酒精灯，以免烧伤。（1）用左手大拇指、食指和无名指夹住菌种试管和待接种和斜面试管，右手拧松棉塞，不取下。（2）右手拿接种环，在火焰上烧灼灭菌，特别是箍处。（3）在火焰边取下两个棉塞，不能放下;烧灼管口一周。（4）将接种环伸入试管内，冷却后，轻轻挑取少量菌体，立即将接种环抽出。（5）在火焰旁将沾有菌种的接种环迅速伸到斜面培养基的底部，由里向外画蛇形细线。（6）抽出接种环后。烧管口，塞棉塞，接种环灭菌。熄灭酒精灯。实验后的带菌培养基，如果用的是致病菌，必须经高压蒸汽灭菌后方可倒掉；如果是非致病菌，也要经过加热后再倒掉。接种完毕，将所接菌种、接种日期、接种者姓名填写在标签上。（五）、培养将接种后的试管放入恒温箱内，在25下培养57d，或在37下培养24h。五、结论 观察斜面培养基上的细菌生长状况如何？细菌在液体培养基中生长后，常出现混浊，沉淀或形成菌膜。细菌接种在固体培养基上，经过一定时间的培养后，表面出现肉眼可见的单个细胞集团，称为菌落。液体培养基表面生长均匀混浊生长沉淀生长固体培养基：菌落、菌苔六、讨论问题答案1.在高压灭菌开始之前，为什么要排尽灭菌锅内的冷空气？在高压锅灭菌以前，如果国内的冷空气没排尽，当压力上升到98KPa，锅内的温度就不会达到应有的温度，导致灭菌不彻底。2.灭菌完毕以后，如果压力未降到0就打开排气阀，会出现什么现象？为什么？如果压力未降到0就打开排气阀，试管内的培养基就会冲出管口，这是因为高压蒸汽灭菌锅内外的压力不平衡所致。3.这种操作为什么一定要在火焰旁进行？空气中存在有大量的微生物，而接种灯得火焰旁能形成一个无菌区域，在这里操作，可以避免杂菌污染。第三讲 大肠杆菌定义革兰氏阴性短杆菌，大小0.513微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌 特性大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。代谢大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。大肠杆菌1 1、培养：在LB液体培养基上扩大培养2、分离：灭菌灭菌 倒平板倒平板 培养培养 划线分离划线分离 LBLB液体和固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌液体和固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌将固体培养基倒入将固体培养基倒入4 4个灭菌后的培养皿中制备平面培个灭菌后的培养皿中，制备平面培养基养基在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，培养在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，培养12h12h平板划线法平板划线法培养皿倒置，培养皿倒置，3737恒温培养恒温培养12241224小时小时大肠杆菌的培养和分离菌种保存菌种保存培养基的培养基的配制配制灭菌灭菌超净工件台超净工件台倒平板倒平板接种液体接种液体培养培养划线分离划线分离培养培养大肠杆菌检测方法和步骤方法：用平板涂布法将样品稀释后（每个水样做3个浓度）涂布到伊红美蓝培养基后，待长出菌落，观察符合特征的群落，计算菌落数目，从而求出总数目。培养基成分及其配置1、成分：蛋白胨10g、乳糖 10g、磷酸氢二钾 2g、琼脂 2030g、蒸馏水1000ml、2%伊红水溶液 20ml、0.5%美蓝水溶液 13ml 2、配置方法：先将琼脂加至900ml蒸馏水，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整PH为7.27.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器内以115灭菌20min，冷却备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至5055，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。实验步骤涂布平板法1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。4.将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上2030min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数。涂布平板操作涂布平板操作第四讲 金黄色葡萄球菌概括葡萄球菌属微球菌科，本菌有19个菌种，从人体上可检出12个种。葡萄球菌属主要与皮肤腺体和温血动物的粘膜相关系，有些种是人及动物的条件致病菌。金黄色葡萄球菌对人类有致病性，通常被称为病原性球菌。金黄色葡萄球菌可引起化脓性炎症，又称为化脓性球菌。易培养，对营养要求不高，在普通培养基中生长良好。需氧或兼性厌氧。最适生长温度37，最适生长pH 7.4。耐盐性强，在含1015%的氯化钠培养基中仍能生长，可用于筛选菌种。在普通营养琼脂平板上培养1824，可形成圆形、表面光滑、不透明的菌落。可产生金黄色色素，色素为脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落内，不渗至培养中。培养特性在血平板上可形成明显透明的溶血环。为型溶血。可产生卵磷脂，在卵黄高盐培养基上形成周围有白色沉淀环的菌落。大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红试验、VP试验多为阳性，不产生靛基质。触酶阳性。检测方法材料与方法1、材料培养基：7.5%NaCl肉汤培养基，血琼脂平板培养基（按常规方法制作）试剂：7.5%NaCl肉汤培养基，革兰氏染色，血琼脂平板，Baird-Parker琼脂平板，生理盐水，兔血浆（1：4），器材：温箱，显微镜，天平，均质器，载玻片，L型涂片棒，三角瓶，刻度吸管，平皿，试管及试管架，研磨，1ml注射器，实验动物：健康的小白鼠2、方法 待检样品25g+225ml灭菌生理盐水直接计数法 增菌培养方法Baird-Parker琼脂平板 7.5%NaCl肉汤培养基 血平板 血平板涂片染色镜 溶血观察动物接种试验 血浆凝固试验报告第五讲 真菌学及其检测 1、真菌是一类具有细胞壁，不含叶绿素，无根、茎、叶的分化，以寄生或腐生方式生存的真核微生物。异养型。真菌种类多，有10余万种，大多对人体无害，有的甚至有益。繁殖方式两种：即无性和有性繁殖。还有少数真菌，能致人、动植物发病，称为病原性真菌。一、真菌学2、分类：酵母菌酵母菌 霉菌霉菌 担子菌担子菌真真 菌菌二、检测标本直接镜检墨汁染色乳酸酚棉蓝染色不染色抗原检出分离培养二相性真菌氢氧化钾消化后涂片镜检脑心浸液病原性真菌脑心浸液沙氏培养基 血琼脂平板观察菌落性状和菌丝孢子形态显微镜检查湿片法或直接涂片高倍视野镜检，见有菌湿片法或直接涂片高倍视野镜检，见有菌丝孢子或单细胞真菌（有诊断价值，但不能确定真菌种类）丝孢子或单细胞真菌（有诊断价值，但不能确定真菌种类）第六讲 微生物学及其检测一、微生物学 1、微生物是指广泛分布于自然界中的一群肉眼微生物是指广泛分布于自然界中的一群肉眼看不到的微小生物，具有单细胞或简单的多细胞结看不到的微小生物，具有单细胞或简单的多细胞结构，或没有细胞结构的一群最低等的生物。构，或没有细胞结构的一群最低等的生物。2、微生物特性主要有四个方面 种类多 分布广 繁殖快 易变异3、微生物的形态结构4、微生物的化学组成C，H，O，N，P，S以及其他元素 5、微生物的营养物质 1 水和无机盐 2 碳源:凡能为微生物提供生长繁殖所需碳元素的营养物质 3氮源：凡能为微生物提供所必需氮元素的营养物质 来源：周围环境中得有机 无机含氮物质 作用:主要用于合成蛋白质，核酸以及含氮的代谢产物 4 能源:能为微生物生命活动提供最初能源来源的营养物质或辐射能 5生长因子：微生物生长不可缺少的微量有机物 6、微生物检测步骤一、液体样品：1、打来紫外灯灭菌30min 2、把所有做诶生物的物品一并带入无菌室 3、用酒精棉对手进行消毒，取出灭菌平皿并编号（根据本厂的菌落数进行编号）以下样液的菌落数小于100 4、用灭菌吸管吸取1ml灭菌盐水放入编号为“0”的平皿中 5、哟偶那个灭菌吸管分别吸取1ml样品放入编号为原液的两个平皿中（若盛装样液的容器诶桶装则应先把样液转入灭菌容器中再进行取样）6、吸取样液1ml放入灭菌的9ml盐水中，摇匀后分别放入编号为-1的两个平皿中 7、点燃酒精灯，倒入温度在46（不低于40）的营养琼脂，摇匀，带琼脂凝固后倒扣放置于温度为361的培养箱中培养48h2h 8、吸取样液10ml放于3支双料管中 9、吸取样液1ml放于3支单料管中 10、吸取样液0.1ml放于3支单料管中 11、把8、9、10所得最终溶液摇匀放置于温度为361的培养箱中培养24h1h 12、观察7、11的结果并记录二、固体样品：1、打开紫外灯灭菌30min 2、把所有做微生物的物品一并带入无菌室 3、用酒精棉对手进行消毒，取出灭菌平皿并编号（根据本厂的菌落数进行编号）4、用灭菌吸管从226ml盐水瓶中吸取1ml灭菌盐水放入编号为“0”的平皿中 5、称取磨碎或搅碎的样品25g放入225ml盐水瓶中，摇匀（此步得到样品稀释10倍的溶液，即“-1”溶液）6、用灭菌吸管分别吸取1ml“-1”溶液放入编号为“-1”的两个平皿中 7、吸取“-1”溶液1ml放入灭菌的9ml盐水中，摇匀（此步得到：-2“溶液）8、分别吸取1ml”-2“溶液放入编号为”-2“的两个平皿中 9、点燃酒精灯，倒入温度在46（不低于40）的营养琼脂，摇匀，带琼脂凝固后倒扣放置于温度为361的培养箱中培养48h2h 10、吸取”-1“溶液10ml放于3支双料管中 11、吸取”-1“溶液1ml放于3支单料管中 12、吸取”-1“溶液0.1ml放于3支单料管中 13、把8、9、10所得最终溶液摇匀放置于温度为361的培养箱中培养24h1h 14、观察7、11的结果并记录谢谢！