Waters如何快速建立稳定可靠的液相色谱分析方法.pdf

1吴园生吴园生Waters Asia Headquarter如何快速建立稳定可靠的液相色谱分析方法如何快速建立稳定可靠的液相色谱分析方法2005 Waters Corporation纲要纲要 何谓理想HPLC色谱柱何谓理想HPLC色谱柱?现代液相柱的选择技巧现代液相柱的选择技巧 系统、快速液相色谱方法开发策略系统、快速液相色谱方法开发策略 色谱柱生产流程对分离重现性的影响色谱柱生产流程对分离重现性的影响 总结总结22005 Waters Corporation理想液相色谱柱的衡量标准理想液相色谱柱的衡量标准 峰形佳、柱效好峰形佳、柱效好 对任何分析物(酸性,碱性和中性)柱寿命长柱寿命长 不同pH和柱温下均有良好表现 色谱分离可轻易放大色谱分离可轻易放大 从分析规模直接放大至制备规模 分离表现高度重现分离表现高度重现 柱与柱间、不同批次填料间和不同粒径填料间均需如此 柱产品质量的可溯源性和柱生产流程是否符合最新柱产品质量的可溯源性和柱生产流程是否符合最新GMP规范规范 价格适中价格适中2005 Waters Corporation为何峰对称性是理想色谱柱的首要判据?峰形不佳将导致峰形不佳将导致?方法开发难度加大、过程拖长方法开发难度加大、过程拖长?分析结果不一致分析结果不一致?色谱分离度不足色谱分离度不足?检测灵敏度降低检测灵敏度降低32005 Waters CorporationMinutes0510152025峰形不佳的后果?积分不准?分离度降低?灵敏度不足2005 Waters Corporation99.6%99.8%99.9%积分后定量结果拖尾因子拖尾因子=1.0092.3%95.3%积分后定量结果97.8%拖尾因子拖尾因子=1.58峰形不佳对积分准确度的影响42005 Waters CorporationRs=(tr Peak 2 trPeak 1)/0.5(w4.4%Peak 1+w4.4%Peak2)Rs=(11.5-10.6)/0.5(2.0+0.5)Rs=0.72Minutes0510152025注:基线分离需Rs不小于1.5峰形不佳对峰分离度的不良影响峰形不佳对峰分离度的不良影响2005 Waters Corporation峰形不佳对检测灵敏度的影响峰形不佳对检测灵敏度的影响:Tamoxifen(它莫西芬)0.00000.0004AU510Minutes510Minutes0.00000.0004AUC18 品牌 AC18 品牌 B注:对信噪比的要求LOQ（最低定量限）10LOD（最低检测限2信噪比A 11.0B 6.5 52005 Waters Corporation纲要纲要 何谓理想HPLC色谱柱何谓理想HPLC色谱柱?现代液相柱的选择技巧现代液相柱的选择技巧 系统、快速液相色谱方法开发策略系统、快速液相色谱方法开发策略 色谱柱生产流程对分离重现性的影响色谱柱生产流程对分离重现性的影响 总结总结2005 Waters Corporation以传统方式制造硅胶色谱填料的过程以传统方式制造硅胶色谱填料的过程:起始原料为矿物硅酸盐（如泡花碱）起始原料为矿物硅酸盐（如泡花碱）Na2SiO3(矿物矿物)+2H+Si(OH)4(silicic acid)+2Na+硅胶颗粒硅胶颗粒(含金属杂质含金属杂质!)C18/C8 bonding+endcappingC18/C8 Reversed Phases(最终仍带金属杂质最终仍带金属杂质!)62005 Waters Corporation硅胶晶格中杂质铝对硅醇基酸度的影响硅胶晶格中杂质铝对硅醇基酸度的影响质子酸HOSiOAlOOSiSiOHHOOOOOSiSi金属嵌入硅胶晶格中，使硅醇基的酸性大大增强金属嵌入硅胶晶格中，使硅醇基的酸性大大增强+_2005 Waters Corporation硅胶中金属杂质含量对螯合性化合物硅胶中金属杂质含量对螯合性化合物Hinokitiol峰形的影响峰形的影响Minutes2468流动相流动相:20 mM Phosphate Buffer pH 3.6（含（含 0.05%EDTA):Acetonitrile(50:50)低金属杂质高金属杂质含量高金属杂质含量OOMn+OOSiSi72005 Waters Corporation传统型传统型C18硅胶柱上金属杂质对碱性化合物峰形的影响硅胶柱上金属杂质对碱性化合物峰形的影响Minutes515253545AmitriptylineAcenaphthenePropranolol and ButylparabenNaphthalene铝杂质含量 375 ppmTf USP=6.5流动相 pH 72005 Waters Corporation与键合相的疏水性作用双重保留机理与键合相的疏水性作用双重保留机理:1).与键合相的的疏水性作用与键合相的的疏水性作用;2).与残余硅醇基间的离子交换作用与残余硅醇基间的离子交换作用O-SiO-SiO-O-SiO-SiO-O-SiO-O-SiO-SiO-SiOO-SiO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-SiOHO-SiOHO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-Si(CH3)2HN+(CH3)2HN+当流动相pH值小于3时,硅醇基趋于中性(未解离)BaseBase对碱性化合物的保留及严重拖尾对碱性化合物的保留及严重拖尾两实验使用相同的传统两实验使用相同的传统C8硅胶柱硅胶柱离子交换作用离子交换作用碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理当流动相为 pH6-8时,硅醇基带负电性(大部解离)82005 Waters Corporation既然既然pH 3时硅醇基离解受抑制，为何不在所有情况下采用酸性条件进行分离时硅醇基离解受抑制，为何不在所有情况下采用酸性条件进行分离?低pH可导致分离选择性的完全丧失!AU0.000.020.04Minutes0.002.004.006.008.0010.00AU0.000.010.020.030.04Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.00pH 7.0pH 2.0amitriptylinenortriptyline2005 Waters Corporation金属杂质的存在可使得硅醇基过度活化，以至某些碱性化合物在酸性条件下仍呈现拖尾峰金属杂质的存在可使得硅醇基过度活化，以至某些碱性化合物在酸性条件下仍呈现拖尾峰分析物:Chlorpheniramine杂质铝含量杂质铝含量,ppm12340100200300400拖尾因子拖尾因子“高纯硅胶”区流动相流动相流动相流动相:乙腈/KH2PO4pH 3.0(20:80)92005 Waters Corporation如何解决碱性化合物和螯合物的峰形问题如何解决碱性化合物和螯合物的峰形问题?从修饰流动相着手改善峰形从修饰流动相着手改善峰形(例如使用竞争性碱例如使用竞争性碱TEA或离子对色谱或离子对色谱)1970-1980年代策略年代策略 从改善反相填料着手降低硅醇基活性从改善反相填料着手降低硅醇基活性自自1990年代起至今年代起至今2005 Waters CorporationWaters现代色谱柱三大技术平台现代色谱柱三大技术平台亲水性化合物专用柱亲水性化合物专用柱Atlantis dC18Atlantis HILIC 柱杂化颗粒柱杂化颗粒柱 XTerra MS C18/C8 XTerra RP18/RP8超纯硅胶柱超纯硅胶柱 Symmetry C18/C8 SymmetryShieldRP18/RP8102005 Waters CorporationTetraethoxysilane(TEOS)Polyethoxysilane(PEOS)Symmetry系列超纯硅胶柱基体颗粒的化学合成过程系列超纯硅胶柱基体颗粒的化学合成过程无金属杂质的超纯起始原料无金属杂质的超纯起始原料2005 Waters Corporation常见品牌常见品牌C18柱在柱在pH7下的性能比较下的性能比较品牌品牌AcenaphkAmitrip/Acenap Amitriptyline拖尾因子拖尾因子(美国药典法美国药典法)Symmetry C18161.31.9Inertsil ODS-2161.42.5Puresil C18141.53.3Zorbax Rx C18161.86.0Purospher RP-18164.86.0Kromasil C18Alltima C1819231.53.59.413Nova-Pak C18162.35.5Nucleosil C18154.310Hypersil ODS112.810Zorbax ODS21无法测得结果无法测得结果!112005 Waters Corporation常见品牌常见品牌C8柱在柱在pH7下的性能比较下的性能比较品牌品牌AcenaphkAmitrip/Acenap Amitriptyline拖尾因子拖尾因子(美国药典法美国药典法)Symmetry C87.81.71.6Lichrosphere selectB 5.9 3.7 2.2Inertsil C8 7.6 1.8 2.3 YMC basic 3.7 2.1 2.8Puresil C8 7.5 2.1 2.9Zorbax Rx C8 5.5 6.7 6.0Kromasil C8 8.2 2.1 6.9Altima C8 6.1 4.4 7.0 2005 Waters Corporation在pH3下的柱性能测试条件流动相流动相:50 mM pH 3.00 KH2PO4/H3PO4:ACN(80:20 v/v)NClONH2+OHO-OHOOONH2NH+Chlorpheniramine(有机强碱有机强碱,pKa 9.1)Propranolol(有机强碱有机强碱,pKa 9.6)Maleate(有机强酸有机强酸,pKa1 1.8,pKa2 6.1)Toluamide(中性物质中性物质)122005 Waters Corporation2.6常见品牌常见品牌C18柱在柱在pH3下的性能比较下的性能比较柱品牌柱品牌ToluamidekChlorph/Toluam ChlorpheniramineSymmetry C181.43.41.3Purospher RP-181.40.711.4Alltima C182.43.21.8Inertsil ODS-21.72.91.9Zorbax Rx C181.43.32.0Puresil C181.63.62.9Nova-Pak C181.33.9Nucleosil C181.84.23.9Zorbax ODS1.74.94.6Hypersil ODS1.51111Kromasil C181.53.61.8拖尾因子拖尾因子(美国药典法美国药典法)2005 Waters Corporation柱品牌柱品牌ToluamidekChlorph/ToluamChlorpheniramine拖尾因子拖尾因子(美国药典法美国药典法)Symmetry C81.42.21.2Alltima C82.02.91.2Inertsil C81.42.61.3Puresil C81.53.01.4Zorbax Rx C81.52.51.6YMC Basic1.03.81.8LiChrospher RP-select B1.72.91.9kromasil C81.83.41.6常见品牌常见品牌C8柱在柱在pH3下的性能比较下的性能比较132005 Waters Corporation对碱性化合物的峰对称性对碱性化合物的峰对称性pH 7pH 3SymmetrySymmetry(极佳极佳)InertsilPurospherLiChrospher RP-select BAlltimaYMCbasicInertsilPuresilkromasilPurospherYMCbasicZorbax RxZorbax RxNova-PakLiChrospher RP-select BkromasilPuresilAlltimaNova-PakNucleosilNucleosilHypersilZorbaxZorbaxHypersil(差差)常见品牌柱在常见品牌柱在pH3和和 pH7下的峰形优劣排序下的峰形优劣排序2005 Waters Corporation用液相色铺柱全行业最严苛的流程进行生产与测试用液相色铺柱全行业最严苛的流程进行生产与测试142005 Waters Corporation无与伦比的色铺柱批间分离重现性无与伦比的色铺柱批间分离重现性2005 Waters CorporationRepeatability and Reproducibility of Retention Data and Band Profiles on Reversed-Phase Liquid Chromatographic Columns:Results Obtained with Symmetry C18 ColumnsJournal of Chromatography A,830(1999)55-79Marianna Kele(田纳西大学田纳西大学)&Georges Guiochon(橡树岭国家实验室橡树岭国家实验室)“当当SymmetryC18同批号柱与柱间保留时间差异在同批号柱与柱间保留时间差异在0.1%之内、不同批号间柱间的差异在之内、不同批号间柱间的差异在1%之内时，继续要求更精准的保留时间无异于苛求。之内时，继续要求更精准的保留时间无异于苛求。”“要在以上色谱柱上达致更优异的色谱保留重现性，很可能需要从所使用的仪器硬件本身着手进行系统优化。要在以上色谱柱上达致更优异的色谱保留重现性，很可能需要从所使用的仪器硬件本身着手进行系统优化。”无与伦比的色铺柱批间分离重现性无与伦比的色铺柱批间分离重现性来自色谱科学家的研究结论来自色谱科学家的研究结论152005 Waters Corporation杰出的柱床稳定杰出的柱床稳定与保护柱同时使用与保护柱同时使用,可达致可达致10,000次的进样次数次的进样次数2005 Waters CorporationWaters现代色谱柱三大技术平台现代色谱柱三大技术平台亲水性化合物专用柱亲水性化合物专用柱Atlantis dC18Atlantis HILIC 柱杂化颗粒柱杂化颗粒柱 XTerra MS C18/C8 XTerra RP18/RP8超纯硅胶柱超纯硅胶柱 Symmetry C18/C8 SymmetryShieldRP18/RP8162005 Waters CorporationAtlantis dC18 柱的成功秘诀柱的成功秘诀表面峰端表面峰端键合密度键合相连接方式微孔大小键合密度键合相连接方式微孔大小防微孔脱水峰形保留性能柱寿命防微孔脱水峰形保留性能柱寿命2005 Waters CorporationAtlantis dC18柱对极性化合物的优异保留性能柱对极性化合物的优异保留性能对嘌呤碱表现良好峰形对嘌呤碱表现良好峰形(因对填料进行了彻底封端因对填料进行了彻底封端)Compounds:1.Cytosine2.5-Fluorocytosine3.Uracil4.5-Fluorouracil5.Guanine6.Thymine7.Adenine123456Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.007V0=1.83 minConditionsColumn:AtlantisTMdC184.6 x 150 mm,5 m Mobile Phase A:H20Mobile Phase B:ACNMobile Phase C:100 mM CH3COONH4,pH 5.0Flow Rate:1.0 mL/minGradient:TimeProfile(min)%A%B%C0.090 01010.084 610Injection Volume:10 LTemperature:30 oCDetection:UV 254 nmInstrument:AllianceTM2695,2996 PDA尿嘧啶尿嘧啶(Uracil)是测试反相柱最广泛采用的死体积标记物,但在AtlantisdC18柱上具显著保留172005 Waters CorporationAtlantisdC18 Column:揭开人类酿酒历史之谜揭开人类酿酒历史之谜(2004)古埃及十二世王Tutankhamen(约公元前1346-1327)1922年发掘Tut王墓葬时所发现的具象形文字的残片,疑为盛酒器皿上的标签说明Tartaric Acid(酒石酸)Syringic Acid(丁香酸):是红葡萄中的两个内源性标记物2005 Waters CorporationAtlantis HILIC Silica HILIC Silica 柱用于在Atlantis dC18柱上依然无有效保留的场合 分离机制为“反反相色谱”技术 HILIC Silica 柱与Atlantis dC18柱上的出峰顺序刚好相反 由于使用含高有机溶剂成分的流动相进行分离，在LC/MS应用中的检测灵敏度比Atlantis dC18柱上显著提高 可直接将样品溶于纯有机溶剂中进样，省却了将样品溶剂蒸干再定容的麻烦。182005 Waters CorporationWaters现代色谱柱三大技术平台现代色谱柱三大技术平台亲水性化合物专用柱亲水性化合物专用柱Atlantis dC18Atlantis HILIC 柱杂化颗粒柱杂化颗粒柱 XTerra MS C18/C8 XTerra RP18/RP8超纯硅胶柱超纯硅胶柱 Symmetry C18/C8 SymmetryShieldRP18/RP82005 Waters Corporation高纯硅胶柱可用于解决您所有的应用难题吗高纯硅胶柱可用于解决您所有的应用难题吗?192005 Waters Corporation突破高纯硅胶柱局限性的必要性突破高纯硅胶柱局限性的必要性硅胶柱pH适用极限硅胶柱pH适用极限0102030400123456789101112kpH硅醇基解离,带负电荷硅醇基未解离碱性化合物具良好峰形但保留不足对碱性化合物的保留增强,但需严格控制流动相pH 值。封端不佳的反相柱会面临峰拖尾的问题。pH 10NortriptylineAmitriptylineMinutes0123Minutes0123pH 2硅醇基完全解离,硅胶基体逐步溶解！硅胶基体逐步溶解！碱性化合物呈中性，保留强,峰性佳。需要全新的柱技术需要全新的柱技术2005 Waters Corporation杂化颗粒柱技术杂化颗粒柱技术突破硅胶柱应用禁区的有力手段突破硅胶柱应用禁区的有力手段优点缺点无机基质优点缺点无机基质(C18硅胶硅胶)机械强度高机械强度高 柱效高柱效高 保留稳定保留稳定 有限的pH应用范围 对碱性分析物拖尾 化学不稳定性有机基质有机基质(高聚物高聚物)很宽的很宽的pH应用范围应用范围 无离子型作用无离子型作用化学稳定性好化学稳定性好 机械强度不佳 柱效低 保留行为难以预测杂化颗粒技术杂化颗粒技术(具硅具硅-碳键机制碳键机制)202005 Waters Corporation四乙氧基硅烷四乙氧基硅烷(TEOS)硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷(MPEOS)甲基三乙氧基硅烷甲基三乙氧基硅烷(MTEOS)Waters 专利技术荣获专利技术荣获2000年全球年全球 R&D 100 大奖大奖杂化颗粒柱杂化颗粒柱(XTerra)的合成过程示意的合成过程示意2005 Waters CorporationC18键合硅胶材料键合硅胶材料含自由硅醇基C18键合杂化材料键合杂化材料含1/3自由硅醇基(比硅胶材料少约一半)硅胶颗粒与杂化颗粒键合后的表面结构比较硅胶颗粒与杂化颗粒键合后的表面结构比较212005 Waters CorporationModern C18pH 1012USP TailingpH 2.5(3.5)MeCN20 mM KH2PO4/pH 4.5MeCN10 mM CH3COONH4pH 7MeCN20 mM K2HPO4pH 10MeCN20 mM Na2B4O7pH 7MeOH20 mM K2HPO4XTerra1.Nicotine2.Nortriptyline3.Propranolol4.Methamphetamine5.Amphetamine6.Ibuprofen7.Benzoic Acid8.Salicylic Acid1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 6 7 81.52.5基于杂化颗粒的基于杂化颗粒的Xterra RP18柱与普通柱与普通C18硅胶柱在分离酸性、碱性化合物时的拖尾因子比较硅胶柱在分离酸性、碱性化合物时的拖尾因子比较为何杂化颗粒柱可增强在高为何杂化颗粒柱可增强在高pH下的柱寿命下的柱寿命？硅胶快速溶解 严重的柱失效 柱寿命短暂Surface modified Silica Particles 因嵌入硅甲基的阻挡,颗粒表面溶解速度明显减缓 柱寿命大大延长XTerraHybrid Particles普通硅胶柱普通硅胶柱基于杂化颗粒的基于杂化颗粒的Xterra 柱柱222005 Waters Corporation基体溶解度基体溶解度(ppm)1 2 3 4 5 6 7 8 9 1012240-220-200-180-160-140-120-100-80-60-40-20-0-pH基体溶解度曲线基体溶解度曲线传统硅胶柱适用范围传统硅胶柱适用范围pH 2-7各种基体的液相柱在高各种基体的液相柱在高pH媒体中溶解速率的比较媒体中溶解速率的比较液相柱基体材料的溶解导致柱前端形成空腔，由此而造成色谱峰畸形、分叉。液相柱基体材料的溶解导致柱前端形成空腔，由此而造成色谱峰畸形、分叉。现代超纯硅胶柱适用范围现代超纯硅胶柱适用范围pH 2-8杂化颗粒柱适用范围杂化颗粒柱适用范围pH 1-122005 Waters Corporation杂化颗粒柱对创建稳定可靠的杂化颗粒柱对创建稳定可靠的HPLC分析方法的独特价值分析方法的独特价值NoteColumn Particle,Temperature and%Organic Held Constant0.111010002468101214pHkAcetaminophenIbuprofenNortriptylineLidocaineDoxepinImipraminep-ToluamideMobile Phase:35%MeCN,65%20 mM Buffer稳定保留区稳定保留区稳定保留区稳定保留区硅胶柱硅胶柱Xterra杂化颗粒柱杂化颗粒柱232005 Waters CorporationDibucaine(局部麻醉药-碱性化合物)美国药典美国药典USP 28 上所推荐的色谱方法上所推荐的色谱方法淋洗剂:1.2 g 十二烷基磺酸钠(SDS),0.2g 醋酸钠,2.0 ml 三乙基胺溶于300 ml 水中,调pH 至 5.6，然后加700 ml甲醇3.9 x 300 mm L1 柱，要求 拖尾因子拖尾因子 1000 L分离在同一根色谱柱上进行分离在同一根色谱柱上进行!解决方案解决方案:1.在梯度表的每一个时间段中加入相应的补偿时间在梯度表的每一个时间段中加入相应的补偿时间2.在在Empower软件上软件上启动启动柱前体积柱前体积功能功能372005 Waters Corporation*需指明哪个溶剂先加（如将甲醇加入水中还是水加入甲醇中？）需指明哪个溶剂先加（如将甲醇加入水中还是水加入甲醇中？）关于流动相关于流动相pH的提醒的提醒:缓冲液的缓冲液的pH需在加入有机溶剂前调试！需在加入有机溶剂前调试！需要清楚地记录并遵循流动相的配制顺序需要清楚地记录并遵循流动相的配制顺序!60/40600400流动相的配制顺序流动相的配制顺序:您常常忽视的细节您常常忽视的细节2005 Waters CorporationpH0.111010002468101214保留因子保留因子(k)酸酸(未离子化未离子化)中性化合物中性化合物碱碱 1碱碱1+2(完全离子化完全离子化)酸酸(完全离子化完全离子化)碱碱 2NA,B1B2(未离子化未离子化)B1NAB2pH 5.5pH6.0您的分析方法为何重现性不佳您的分析方法为何重现性不佳?流动相缓冲流动相缓冲pH值是否靠近分析物的值是否靠近分析物的pKa范围范围?如图所示如图所示,在靠近中性在靠近中性pH区间分析可离子化化合物时需要对流动相区间分析可离子化化合物时需要对流动相pH进行非常仔细的控制进行非常仔细的控制!382005 Waters Corporation0.000.100.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH 5.01230.000.100.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH 54312pH 5.20.000.100.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00132pH 5.61320.000.100.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.001.p-Toluamide2.Lidocaine3.IbuprofenGrumbach,Diehl分析方法对pH敏感度的测试-糟糕的结果Column:XTerraRP184.6 x 100 mm,5 mMobile Phase A:20mM Ammonium Acetate(pH 5.0 to 5.8)or 20mM Ammonium Bicarbonate(pH 6.8 to 7.0)Mobile Phase B:ACNFlow Rate:0.5 mL/minIsocratic Mobile Phase Composition:40%A;60%B Injection volume:10LTemperature:30oCDetection:UV 230 nmInstrument:AllianceTM2690,996 PDA2005 Waters Corporation0.000.100.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH 7.03120.000.100.200.300.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH 6.83121.p-Toluamide2.Lidocaine3.IbuprofenGrumbach,Diehl132pH 5.81.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.000.000.100.200.300.40Column:XTerraRP184.6 x 100 mm,5 mMobile Phase A:20mM Ammonium Acetate(pH 5.0 to 5.8)or 20mM Ammonium Bicarbonate(pH 6.8 to 7.0)Mobile Phase B:ACNFlow Rate:0.5 mL/minIsocratic Mobile Phase Composition:40%A;60%B Injection volume:10LTemperature:30oCDetection:UV 230 nmInstrument:AllianceTM2690,996 PDA分析方法对pH敏感度的测试-糟糕的结果392005 Waters Corporation分析方法对pH敏感度的测试-优异的结果2005 Waters Corporation杂化颗粒柱对创建稳定可靠的杂化颗粒柱对创建稳定可靠的HPLC分析方法的独特价值分析方法的独特价值Note:Column Particle,Temperature and%Organic Held Constant0.111010002468101214pHkAcetaminophenIbuprofenNortriptylineLidocaineDoxepinImipraminep-ToluamideMobile Phase:35%MeCN,65%20 mM Buffer稳定保留区稳定保留区稳定保留区稳定保留区硅胶柱硅胶柱Xterra&X-Bridge 杂化颗粒柱杂化颗粒柱402005 Waters Corporation您在日常您在日常HPLC分析工作中所面临的常见问题分析工作中所面临的常见问题Peak TailingRetentionReproducibilityProductQualityPriceWatersPeak TailingRetentionReproducibility峰拖尾:28%保留时间重现性不佳:25%分离不佳:24%柱寿命太短柱寿命太短 11%极性化合物保留不佳:12%2005 Waters Corporation我的色谱柱寿命为何不长我的色谱柱寿命为何不长?您是否有恰当的样品前处理手段您是否有恰当的样品前处理手段?样品前处理样品前处理(净化和富集净化和富集)的好坏不仅影响分析结果的灵敏度和可靠性，而且直接影响色谱柱的寿命的好坏不仅影响分析结果的灵敏度和可靠性，而且直接影响色谱柱的寿命?您的色谱柱是否有适当的保护措施您的色谱柱是否有适当的保护措施?在线过滤器在线过滤器保护柱保护柱?您的色谱柱是否曾暴露在过于剧烈的分离条件您的色谱柱是否曾暴露在过于剧烈的分离条件?使用某些对填料基体有腐蚀性的高浓度缓冲盐使用某些对填料基体有腐蚀性的高浓度缓冲盐(如在中性或碱性如在中性或碱性pH区域使用区域使用高浓度缓冲盐的磷酸盐或硼酸盐高浓度缓冲盐的磷酸盐或硼酸盐)柱温过高柱温过高将色谱柱暴露在极端将色谱柱暴露在极端pH的流动相中的流动相中412005 Waters Corporation您在日常您在日常HPLC分析工作中所面临的常见问题分析工作中所面临的常见问题Peak TailingRetentionReproducibilityProductQualityPriceWatersPeak TailingRetentionReproducibility峰拖尾:28%保留时间不重现:25%分离不佳分离不佳:24%柱寿命太短 11%极性化合物保留不佳:12%2005 Waters Corporation()()1kk14NRs22+=影响分离度的若干因素影响分离度的若干因素柱效柱效N 2,2,R 40%40%分离选择性分离选择性(方法开发归根结底是如何使得方法开发归根结底是如何使得 1)1)保留因子保留因子K最佳最佳=5422005 Waters Corporation影响柱效影响柱效(塔板数塔板数)的因素的因素dpLN 柱效柱效(N)与柱长与柱长L呈正比呈正比,与填料粒径与填料粒径dp呈反比呈反比选择柱长选择柱长L与填料粒径与填料粒径dp的指导原则的指导原则分离难易程度分离难易程度L/dp困难困难30,000(150mm/5um,100mm/3.5um,75mm/2.5um)中等中等20,000(100mm/5um,75mm/3.5um,50mm/2.5um)简单简单10,000(50mm/5um,30mm/3.5um,20mm/2.5um)注注:方法开发的终极原则是在最短的色谱柱上完成最快的分离方法开发的终极原则是在最短的色谱柱上完成最快的分离,以达致最高的样品通量和最省的流动相耗量。以达致最高的样品通量和最省的流动相耗量。2005 Waters CorporationHPLC技术技术UPLC技术技术2.5 m 75 mmInjection=2.5 LFlow rate=0.5ml/minRs(2,3)=2.345 m 150 mmInjection=5.0 LFlow rate=0.2ml/minRs(2,3)=2.283.5 m 100 mmInjection=3.3 LFlow rate=0.3ml/minRs(2,3)=2.321.7 m 50 mmInjection=1.7 LFlow rate=0.6ml/minRs(2,3)=2.29AU0.000.100.20Minutes0.000.501.001.502.002.503.003.504.00AU0.000.100.20Minutes0.002.004.006.008.0010.00AU0.000.100.20Minutes0.000.200.400.600.801.001.201.401.601.802.00AU0.000.100.20Minutes0.000.200.400.600.801.001.10使用更短具更细填料的分析柱使用更短具更细填料的分析柱(保持保持L/dP为常数为常数)是实现高通量分析的不二法门是实现高通量分析的不二法门432005 Waters Corporation()()1kk14NRs22+=影响分离度的若干因素影响分离度的若干因素柱效柱效N 2,2,R 40%40%分离选择性分离选择性(方法开发归根结底是如何使得方法开发归根结底是如何使得 1)1)保留因子保留因子K最佳最佳=52005 Waters Corporation如何在实践中调控如何在实践中调控?这是方法开发的根本这是方法开发的根本!分离柱流动相溶剂选择流动相分离柱流动相溶剂选择流动相pH 442005 Waters Corporation在林林总总的色谱柱中在林林总总的色谱柱中,方法开发应从何开始方法开发应从何开始?Symmetry C18 具有超常分离重现性的超纯硅胶的通用形C18柱 Symmetry ShieldRP18 高纯硅胶柱提供高度重现结果,绝佳峰形,与Symmetry C18相比具正交性分离选择性,可用于全水相分离 XTerra MS C18/XTerra RP18 方法开发者的首选柱 宽pH 应用范围,多种键合相和多种粒径供选择 Atlantis dC18 转为 极性化合物而设计，已在工业界获广泛使用 HILIC 提供真正与dC18相互补的分离选择性2005 Waters Corporation从您最熟悉的路径开始从您最熟悉的路径开始:首先尝试用高纯硅胶柱在低首先尝试用高纯硅胶柱在低pH下构建分析方法下构建分析方法为何首先用为何首先用 Symmetry C18柱在柱在pH3下分离下分离?峰形有保障峰形有保障?柱寿命长柱寿命长?pH3为稳定保留区，方法稳定可靠为稳定保留区，方法稳定可靠样品样品不肯定不肯定?否否Atlantis dC18At pH 2-5Symmetry C18At pH 3SymmetryShieldRP18 At pH 3Xterra RP18At pH 3Atlantis HILICAt pH 2-5不成功不成功?是否属亲水性化合物是否属亲水性化合物?是是不成功不成功?无充分保留无充分保留!仍不成功仍不成功?转向高转向高pH分离分离!Preparation of 10mM NH4COOH buffer at pH 3:For 2 liters of 10mM buffer,weight out 1.26g of NH4COOHAdd 2 liters of water and stir until dissolvedAdjust to pH 3 with formic acid452005 Waters Corporation如何实施低如何实施低pH下的三柱分析方案下的三柱分析方案?换柱前谨记探索流动相溶剂所带来的分离选择换柱前谨记探索流动相溶剂所带来的分离选择性性0-80%gradient ACN-H20,10mM bu