C微生物学实验基本操作与培训.pptx

一、无菌操作一、无菌操作 1、无菌概念：什么地方是有菌的，什么地方是无菌的；哪些地方要求基本无菌，哪些地方严格要求无菌。2、操作环境：实验室；接种箱；超净工作台；无菌工作室。3、工作范围：接种、转管、倒平板、梯度稀释、涂平板、平板划线、菌体(菌悬液)转移及其他需要无菌操作的实验环节。一、无菌操作一、无菌操作 4、要领及注意事项：（以实验室接种、转管为例）（1）斜面、接种环拿法；（2）火焰保护；（3）接种环灭菌；（4）接种环冷却及轻快接触斜面；（5）棉塞的制作及处理。二、染色、制片二、染色、制片 1、类型：分装片和涂片；2、操作步骤：（以涂片为例）1）涂片：载玻片-滴加生理盐水-挑菌涂成 薄膜；2）干燥：室温自然干燥：3）固定：菌面向上，火焰上过2-3次：4）染色：滴加染色液（美蓝）,覆盖（2-3分 钟）；5）水洗：自来水冲洗，至基本无色，晾干；6）镜检：调节光源，低倍镜观察，高倍镜观察，油镜观察。二、染色、制片二、染色、制片4、要领及注意事项：（1）生理盐水和菌体一定不能过多；（2）菌膜不能过厚，最好细胞分布疏密相间；（3）固定要到位，不能残留水，也不能固定过度；（4）染色时间正确，一定要按规定计时；（5）水洗时，水流不宜过急；（6）镜检前片子一定要干燥无水。三、油镜头的使用三、油镜头的使用 1工作范围：观察细菌及相近大小的微生物，真核微生物的细胞器。2、使用特点：一定要用油；操作要求较高。三、油镜头的使用三、油镜头的使用3、要领及注意事项：（1）所用装片、涂片上一定不能有水；（2）先用低、高倍镜观察并选好视野，并将待 观察目标调至视野正中心；（3）注意保护镜头和片子，从侧面观察镜头进 入油系；（4）油镜头观察时，用微调调焦距，始终按 镜、片分离方向用微调调焦距；（5）调焦距速度一定要慢，避免焦躁,因为图象 出现的焦距范围很小；（6）注意光线的强弱；（7）用擦镜纸蘸取溶剂（二甲苯）擦净镜头和装 片。四、革兰氏染色四、革兰氏染色 1工作范围：细菌学中最重要的鉴别染色法之一，也可用于其他微生物的鉴别中。一般的微生物形态观察不必用革兰氏染色。2、基本步骤：1）初染：结晶紫染色；2）媒染：碘液媒染；3）脱色：乙醇脱色；4）复染：番红复染;四、革兰氏染色四、革兰氏染色 3、要领及注意事项：1）菌种的菌龄，要选择生长旺盛期的典型菌体；2）制片，按单染色的基本要求操作；3）乙醇脱色时间是本实验成功与否的关键，注意 衬以白背景，用95%乙醇滴洗至刚刚刚刚无紫色为 止，约2030秒，立即立即用水冲净乙醇；4）观察时，以分散开的细菌颜色为准。5）对未知菌进行革兰氏染色时，应选择两株形态 不同、染色结果不同的已知菌和未知菌一起混合 制片、染色。五细菌、放线菌、酵母菌和霉菌五细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌体形态的差别的菌体形态的差别（1）细菌、放线菌是原核生物，酵母菌和霉）细菌、放线菌是原核生物，酵母菌和霉 菌是真核生物，大小不同；菌是真核生物，大小不同；（2）放线菌和霉菌是丝状菌，细菌和酵母菌）放线菌和霉菌是丝状菌，细菌和酵母菌 是非丝状菌；是非丝状菌；（3）霉菌有孢子柄、子实体等特化形态，放）霉菌有孢子柄、子实体等特化形态，放 线菌没有。线菌没有。（4）一定要注意提问，不要理解为菌落形）一定要注意提问，不要理解为菌落形 态。态。六、用血球计数板计数微生物的数量六、用血球计数板计数微生物的数量 1工作范围：此法计得的是死、活菌的总数，故称总菌计数法。2、基本步骤：1）稀释：将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液不浓，可不必 稀释。2）镜检计数室：在计数前，先对计数板的计数室进行镜 检。若有污物，则进行清洗。3）加样品：盖上盖玻片，用毛细管将菌液由盖玻片边缘滴 一小滴，让其自行渗进计数室。不可有气泡。4）显微镜计数：五分钟后，先低倍镜找计数室，后高倍镜 计数。一般以每小格510个菌体为宜。常选四角 和中央五个中格计数。格线上菌体只数上线和左 边线。芽大于母体一半方计。同法计另一室。5）清洗血球计数板：自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，自行 晾干。镜检，洗净为止。六、用血球计数板计数微生物的数量六、用血球计数板计数微生物的数量3、要领及注意事项：（1）计数结果是微生物总数，含死、活菌；（2）菌悬液要摇匀；（3）计数格数和分布要合理；（4）对压线、出芽等情况处理；（5）菌悬液稀释要适当，不要过浓或过稀；（6）光线要适中（尤其不要太强），否则找不到计 数室；（7）要先低倍镜，后高倍镜。七、七、微生物大小的测定微生物大小的测定 1工作范围：原核微生物的测定一般要用油镜头；真核微生物的测定一般用高倍镜即可；测微尺多用来测定细菌和酵母菌，放线菌和霉菌较少。2、操作步骤 1）目镜测微尺的标定 (1)放置目镜测微尺：测微尺刻度朝下；(2)放置镜台测微尺：测微尺刻度朝上；(3)校正目镜测微尺：按低、高、油顺序，使两种测微尺某一区间的 两对刻度线完全重合，按下式计算：两对重合线间镜台测微尺格数10目镜测微尺每小格长度（um）=两对重合线间目镜测微尺格数 2）菌体大小的测定：换上装片，测出菌体长宽格数，算出菌体大小。3）取出目镜测微尺，将两种测微尺用擦镜纸擦净，入盒。七、七、微生物大小的测定微生物大小的测定 3、要领及注意事项：（1）镜台测微尺刻度务必朝上；（2）目镜测微尺刻度朝下，放于目镜与镜头之间；（3）按低、高、油顺序校正目镜测微尺；（4）两对刻度线要整格完全重合；（5）镜台测微尺线条太粗时，可与线条的同边对齐。（6）测细菌等原核微生物时，用油镜头要严格按油镜头的 使用要求操作，要特别注意光线的强弱。（7）对不到一格的数值的判断一定要尽量准确，不能马 虎；（8）对各类微生物的大小要心中有数，如计算的结果与理 论值差距很大，要验算。八、斜面、平板、摇瓶的制作八、斜面、平板、摇瓶的制作 1工作范围：斜面：培养和保存菌种；平板：微生物分离、纯化和活菌计数；摇瓶：微生物液体培养，模拟发酵罐。2、操作步骤：1）按培养基配方称量各种药品、试剂；2）斜面和平板按要求称量琼脂，摇瓶不用琼脂；3）溶化：加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，在电 热套上加热使其溶解。加入琼脂，加热，搅拌溶化，补充水分至所需的总体积；4）调pH：测pH值，用滴管向培养基中加入NaOH或 HCl,边调边测，直至要求的pH范围；八、斜面、平板、摇瓶的制作八、斜面、平板、摇瓶的制作5）分装：将配制的培养基分装入试管和三角烧瓶（250ml）内，试管装1/4。6）加塞：在管（瓶）口塞上棉塞，既保证通气又可阻止外 界微生物进入造成污染：摇瓶用八层纱布盖口；7）包扎8）灭菌9）搁置斜面：趁热将试管棉塞端搁在玻棒上，使斜 面长度不超过试管长度的一半；倒平板：用无菌操作的方法将三角烧瓶中的培养基趁热 倒入培养皿中，6-7个/100 ml；10）无菌检查：将斜面37恒温培养2448小时，以检查 灭菌是否彻底。八、斜面、平板、摇瓶的制作八、斜面、平板、摇瓶的制作3、要领及注意事项：1）各种药品、试剂的称量要注意精确性；2）微生物培养用培养基一般用自来水配制；3）斜面的琼脂溶化要彻底；4）调pH（除“自然”外）千万不要省略；5）分装培养基应用培养基分装器（移液管、玻璃 漏斗）分装，不要使培养基沾在管（瓶）口上；6）倒平板时，注意避免烧、烫手。九、灭菌九、灭菌1、操作步骤：1)通电，打开开关，观察指示灯，视状态添加 水；2)放置灭菌物品；3)设定温度、时间（121，20 min），通电加 热；4)完全排净冷空气，关上排气阀；5)灭菌结束后，切断电源，使锅内温度自然降至 压力为0，打开排气阀 6)取出灭完菌的培养基、物品，自然冷却，排尽 水。九、灭菌九、灭菌2、要领及注意事项：1）一定要检查水位；2）温度和时间设置方法按说明书要求操作；3）排净冷空气是关键，要理解原理；4）应开盖蒸发一定时间后再取出灭完菌的培 养基、物品；5）大胆、细心，注意安全。十、包扎十、包扎 1、试管：若干试管一捆，棉塞外包一层牛皮 纸；2、三角烧瓶：棉塞外包一层牛皮纸，以防冷 凝水润湿棉塞，用绳子扎好；3、移液管：上口塞棉花，报纸包扎；4、培养皿：6-7套一组，报纸包扎；5、棉塞：最好非脱脂棉制作；6、注明日期、姓名。实验操作考试实验操作考试1、细菌单染色制片；2、用油镜观察细菌装片；3、血球计数板的使用；4、测定装片中酵母菌的大小；5、从斜面中取菌种接种到平板上；6、取菌悬液涂平板；7、斜面转接保藏菌种；8、用三角瓶制备1瓶无菌水；9、制1支1 ml无菌吸管。