微生物检验学之衣原体及检验.doc

衣原体及检验一、概述（一）概念 衣原体是一群体积较小，能通过细菌滤器，细胞内专性寄生，并有独特发育周期的原核细胞型微生物。由于它具有一些与细菌类似的生物学特性，现归属于广义的细菌范畴。（二）分类与命名1.传统分类法 按第九版Bergey细菌学分类手册，衣原体属于衣原体目、衣原体科、衣原体属。根据衣原体的抗原构造和DNA同源性的特点，将衣原体属分为四个种，包括沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体和家畜衣原体。能引起人类致病的主要是前三种。沙眼衣原体可分三个生物亚种，即沙眼生物亚种、性病淋巴肉芽肿生物亚种（LGV）及鼠生物亚种。其中沙眼亚种又分AK14个血清型；LGV生物亚种又分4个血清型L1、L2、L2a和L3。前两个亚种对人类有致病性，鼠亚种则不侵犯人类。肺炎衣原体是衣原体属中的一个新种。只有一个血清型，即TWAR组。2.分子生物学特性分类法 该法主要是从衣原体种系发生上分析和评价传统分类法。二、生物学性状1.发育繁殖周期与形态染色 衣原体在宿主细胞内生长繁殖有独特的发育周期，可见到两种形态结构不同的颗粒。（1）原体：呈球形或椭圆形，直径约0.3m，外有胞壁，内含致密的核质，为成熟的衣原体。吉姆萨染色呈紫色，Macchiavello染色呈红色。在细胞外较为稳定，无繁殖能力，但有高度的感染性。（2）网状体又称始体：呈球形或椭圆形，直径0.51m，无胞壁，胞浆内无致密的核质，而有纤细的网状结构。吉姆萨染色和Macchiavello染色均呈蓝色。为衣原体发育周期中的繁殖型，代谢活泼，不能自胞外存活，无感染性。衣原体的发育周期：原体当与易感细胞表面的特异受体吸附后，通过细胞的吞饮作用进入细胞，形成吞噬小泡。原体在泡内变软，增大为网状体。约8小时后，网状体在空泡内以二分裂方式繁殖、聚集，构成各种形状的包涵体。感染1824小时后，网状体浓缩形成具有坚韧细胞壁的原体，最后随宿主细胞破裂而释出，再感染新的易感细胞，开始新的发育周期。每个发育周期约需4072小时。2.抗原成分 衣原体的抗原性相当复杂，有属、种、型等特异性抗原。（1）属特异性抗原：衣原体细胞壁LPS为属特异性补体结合抗原。其与革兰阴性菌LPS结构不同，缺乏O-多糖和部分核心多糖，无典型内毒素生物学活性。长期应用于衣原体血清学诊断。（2）种特异性抗原：主要位于外膜蛋白（MOMP）上。（3）型特异性抗原：也位于MOMP上，用单克隆抗体作微量免疫荧光试验可识别衣原体各血清型。3.分离培养特性 衣原体专性细胞内寄生。绝大多数能在68日龄鸡胚卵黄囊中生长繁殖，并可在卵黄囊膜中找到包涵体、原体和始体颗粒，也可在传代细胞（如HeLa-299和Mc-Coy等细胞株）中培养。4.抵抗力 衣原体抵抗力弱，沙眼衣原体感染材料在3537条件下，经48小时左右即失去活性。不耐热，加热50经30分钟或5660 510分钟可杀死，但耐寒，在冰冻条件下可存活数年。鹦鹉热衣原体比沙眼衣原体稳定。对四环素、青霉素、红霉素、螺旋霉素、利福平较敏感。三、临床意义人类衣原体病主要包括：（一）沙眼衣原体1.沙眼 由沙眼生物亚种A、B、Ba和C四个血清型引起。主要通过眼-眼或眼-手-眼（常通过公用毛巾等媒介）的途径进行直接或间接接触传播。2.包涵体结膜炎 由沙眼生物亚种B、Ba、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、K血清型引起。包括婴儿及成人两类。婴儿经产道时该亚种可致包涵体结膜炎和婴幼儿肺炎。3.泌尿生殖道感染 主要由沙眼生物亚种D-K血清型引起，是经性接触传播引起的非淋菌性泌尿生殖道感染的主要病原。衣原体感染是男性尿道炎最常见的病因之一。未经治疗者多数转为慢性，周期性加重，或可合并附睾炎、前列腺炎等。在女性可引起尿道炎、宫颈炎、阴道炎、盆腔炎，也可与妇女不孕症有关。衣原体常与淋病奈瑟菌混合感染，淋病奈瑟菌对衣原体的繁殖起激活和促进作用。4.性病淋巴肉芽肿 由沙眼衣原体LGV生物亚种（L1、L2、L2a、L3）血清型引起，主要通过性接触传播。引起以化脓性腹股沟淋巴结炎为特征的性病，又称第四性病。主要侵犯淋巴组织，女性以累及会阴、肛门、直肠及盆腔淋巴结多见，男性以累及腹股沟淋巴结为常见，发生化脓性炎症和慢性肉芽肿，有些可形成瘘管。（二）鹦鹉热衣原体 主要引起鸟类或家禽感染，由感染该衣原体的鸟类等动物的粪便污染环境，以气溶胶形式传给人类。使人类发生上呼吸道感染、肺炎和毒血症。典型临床表现为非典型肺炎。也有引起心内膜炎的报道。（三）肺炎衣原体 其传播方式主要是人与人之间经飞沫或呼吸道分泌物传播。引起青少年急性呼吸道感染，以肺炎为主，常可呈地方性、散发性流行，也可引起支气管炎、咽炎等。该衣原体也可引起慢性感染，其与急性心肌梗死和慢性冠心病的关系越来越引起注意。四、微生物检验1.标本采集与处理（1）沙眼衣原体：沙眼和包涵体结膜炎的患者，取眼穹隆部及睑结膜病灶作刮片。子宫颈炎取子宫颈刮片上皮细胞或分泌物作涂片。标本置于运送培养基中送检，常用的运送培养基为2SP培养基。性病淋巴肉芽肿患者可取腹股沟淋巴结脓液，也可取直肠拭子或活检材料送检。（2）鹦鹉热衣原体：采取患者血液、痰液或咽喉含漱液，痰标本用约210倍的灭菌肉汤或组织培养液洗脱附着在标本上的病原体，用力振摇，制成悬液，置室温12小时后，低速离心取上清液接种。尸检材料取肝、脾、肺等组织，也可采腹腔和心包渗出液。（3）肺炎衣原体：一般利用拭子经鼻前庭插入鼻咽部，旋转后取出，利用转运培养基，冷藏送检。也可采集气管内痰液或肺泡灌洗液。要求24小时内接种或置-70保存。2.直接显微镜检查 染色镜检，寻找上皮细胞细胞质内的包涵体。包涵体即指在易感细胞内含增殖的始体和子代原体的空泡。根据包涵体的形态、在细胞内的位置及染色性等特性，对鉴别衣原体有意义。（1）吉姆萨（Giemsa）染色：原体呈紫红色，始体呈蓝色，包涵体呈深紫色。沙眼衣原体包涵体密度低，呈空泡形。鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体包涵体呈深密度的卵圆形，肺炎衣原体在HeLa细胞中的包涵体形态与鹦鹉热衣原体十分相似，但不像鹦鹉热衣原体具有多形性。（2）碘液染色：标本经甲醛固定后，用Lugol碘液染10分钟，水洗后镜检。因包涵体的基质含有丰富的糖原，可被碘液染成深褐色，而细胞的其他部分呈黄色。沙眼衣原体含糖原，碘液染色阳性。鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体碘液染色阴性。（3）可利用抗LPS单抗进行直接法荧光抗体染色检测上皮细胞内的衣原体抗原。3.酶免法检测抗原 可检测临床标本中的可溶性抗原。4.核酸检测 按MOPO基因序列或其他具有种、型特异性的核酸片段，构建特异性引物或探针，利用PCR、核酸探针技术进行检测。按16SrRNA基因序列设计引物一般具有属特异性。5.分离培养 各种衣原体均可在鸡胚卵黄囊和组织细胞内生长繁殖，鹦鹉热衣原体常用小鼠分离。（1）鸡胚卵黄囊接种：将检查标本加适当抗生素（如链霉素等）处理后接种于鸡胚卵黄囊分离培养。（2）细胞培养：目前常用的细胞有两种：即经X线照射的McCoy细胞和HeLa细胞。不同种的衣原体有各自最适合的培养细胞系。沙眼衣原体多用McCoy细胞，鹦鹉热衣原体适合用Hela 229细胞系进行培养。肺炎衣原体适合用HEP-2和HL细胞系进行培养。为了达到较好的培养效果，可对细胞系进行一定处理，可以用DEAE葡聚糖预处理，以便增加分离率，也可以用细胞生长抑制剂，抑制宿主细胞生长，以利于衣原体的分离培养。（3）小白鼠接种：小白鼠对不同种衣原体的敏感性不同，对沙眼衣原体不敏感，主要用于鹦鹉热衣原体的分离。用小鼠腹腔、颅内或滴鼻接种。6.检测抗体 用补体结合试验、微量免疫荧光法、酶免法检测抗体。五、治疗原则 四环素类及大环内酯类对衣原体有较高的活性，青霉素类、磺胺、氧氟沙星以及利福平等也有一定的活性，磺胺对肺炎衣原体无效。孕妇、哺乳期妇女以及儿童禁用四环素而首选红霉素。【例题】下列何种微生物能通过滤器A.军团菌B.分枝结核杆菌C.衣原体D.肺炎克雷伯杆菌E.流感嗜血杆菌正确答案C答案解析衣原体是一群体积较小，能通过细菌滤器，细胞内专性寄生，并有独特发育周期的原核细胞型微生物。【例题】下列说法正确的是A.衣原体与病毒结构相似B.衣原体可引起非典型肺炎C.衣原体对抗生素不敏感D.衣原体无自己的酶系统E.衣原体不能通过滤器正确答案B答案解析人类衣原体病主要包括沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体。其中，鹦鹉热衣原体主要引起鸟类或家禽感染，由感染该衣原体的鸟类等动物的粪便污染环境，以气溶胶形式传给人。使人发生上呼吸道感染、肺炎和毒血症。典型临床表现为非典型肺炎。 【例题】下列关于衣原体网状体的叙述正确的是A.无感染性B.具有高感染性C.有细胞壁结构D.无繁殖能力E.生长成为原体正确答案A答案解析网状体又称始体，呈球形或椭圆形，直径0.51 m ，无胞壁，胞浆内无致密的核质，而有纤细的网状结构。姬姆萨染色和Macchiavello染色均呈蓝色。为衣原体发育周期中的繁殖型，代谢活泼，不能自胞外存活，无感染性。