第十三章-色谱分析法.pdf

第十七章第十七章 色谱分析法概论色谱分析法概论 学习指导与基本要求学习指导与基本要求：色谱分析法色谱分析法是根据试样中各组份在互不相溶的两相中吸附能力、分配系数或其它亲和作用的差异来进行分离分析的方法，简称色谱法或层析法。具体要求如下具体要求如下：掌握吸附色谱的原理及色谱条件的选择原则；掌握分配色谱法的原理、正相色谱和反相色谱的概念及组分的流出顺序规律；掌握基本类型色谱法的分离机制;了解色谱法的发展趋势 理解色谱法的分类和色谱流出曲线以及有关概念；第一节第一节 概概 述述 色谱分析法简称色谱法或层析法(chromatography)，是一种物理或物理化学分离分析方法。在近 50年中，由于气相色谱法、高效液相色谱法及薄层扫描法的飞速发展，而形成一门专门的科学色谱学。色谱法已广泛应用于各个领域，成为多组分混合物的最重要的分析方法，在各学科中起着重要作用。历史上曾有两次诺贝尔化学奖是授予色谱研究工作者的：1948 年瑞典科学家 Tiselins 因电泳和吸附分析的研究而获奖，1952 年英国的 Martin 和 Synge 因发展了分配色谱而获奖；此外在 1937l972 年期间有 12次诺贝尔奖的研究中，色谱法都起了关键的作用。色谱法创始于 20 世纪初，1906 年俄国植物学家Tsweet将碳酸钙放在竖立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚冲洗。在管的不同部位形成色带，因而命名为色谱。管内填充物称为固定相(stationary phase)，冲洗剂称为流动相(mobile phase)。随着其不断发展，色谱法不仅用于有色物质的分离，而且大量用于无色物质的分离。虽然“色”已失去原有意义，但色谱法名称仍沿用至今。30 与 40 年代相继出现了薄层色谱法与纸色谱法。50 年代气相色谱法兴起，把色谱法提高到分离与“在线”分析的新水平，奠定了现代色谱法的基础，l957 年诞生了毛细管色谱分析法。60 年代推出了气相色谱质谱联用技术(GC-MS)，有效地弥补了色谱法定性特征差的弱点。70 年代高效液相色谱法(HPLC)的崛起，为难挥发、热不稳定及高分子样品的分析提供了有力手段。扩大了色谱法的应用范围，把色谱法又推进到一个新的里程碑。80 年代初出现了超临界流体色谱法(SFC)，兼有GC与HPLC的某些优点。80 年代末飞速发展起来的高效毛细管电泳法(high performance capillary electrophoresis，HPCE)更令人瞩目，其柱效高，理论塔板数可达l07m-1。该法对于生物大分子的分离具有独特优点。色谱法的分离原理主要是利用物质在流动相与固定相之间的分配系数差异而实现分离。色谱法与光谱法的主要区别在于色谱法具有分离及分析两种功能，而光谱法不具备分离功能。色谱法是先将混合物中各组分分离，而后逐个分析，因此是分析混合物最有力的手段。这种方法还具有高灵敏度、高选择性、高效能、分析速度快及应用范围广等优点。色谱法可从不同的角度进行分类：1.按流动相与固定相的分子聚集状态分类 在色谱法中流动相可以是气体、液体和超临界流体，这些方法相应称为气相色谱法(gas chromatography，GC)、液相色谱法(liquid chromatography，LC)和超临界流体色谱法(supercritical fluid chromatography，SFC)等。按固定相为固体(如吸附剂)或液体，气相色谱法又可分为气-固色谱法(GSC)与气-液色谱法(GLC)；液相色谱法又可分为液-固色谱法(LSC)及液-液色谱法(LLC)。2.按操作形式分类 可分为柱色谱法、平板色谱法、电泳法等类别。柱色谱法(column chromatography)是将固定相装于柱管内构成色谱柱，色谱过程在色谱柱内进行。按色谱柱的粗细等，又可分为填充柱(packed column)色谱法、毛细管柱(capillary column)色谱法及微填充柱(microbore packed column)色谱法等类别。气相色谱法、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)及超临界流体色谱法等属于柱色谱法范围。平板色谱法(planar 或 plane chromatography)是色谱过程在固定相构成的平面状层内进行的色谱法。又分为纸色 谱 法(paper chromatography；用滤 纸 作固定 液 的载体)、薄 层色 谱 法(thin layer chromatography，TLC，将固定相涂在玻璃板或铝箔板等板上)及薄膜色谱法(thin film chromatography；将高分子固定相制成薄膜)等，这些都属于液相色谱法范围。毛细管电泳法(capillary electrophoresis，CE)的分离过程在毛细管内进行，利用组分在电场作用下的迁移速度不同进行分离。3.按色谱过程的分离机制分类 可分为分配色谱法(partition chromatography)、吸附色谱法(adsorption chromatography)、离子交换色谱法(ion exchange chromatography，IEC)、空间排阻色谱法(steric exclusion chromatography，SEC)及亲合色谱法(affinity chromatography)等类型。色谱法简单分类如下表:色谱法气相色谱法填充柱色谱法毛细管色谱法（GC）GLCGSC液相色谱法（LC）平板色谱柱色谱法经典液相柱色谱法高效液相色谱法（HPLC）薄层色谱法（TLC）纸色谱法SECLSCLLCLLCSECLSCIECLLC高效毛细管电泳法（HPCE）超临界流体色谱法（SFC）第二节第二节 色谱法的基本原理色谱法的基本原理 一、色谱过程 色谱过程是物质分子在相对运动的两相间分配“平衡”的过程。混合物中，若两个组分的分配系数(distribution coefficient)不等，则被流动相携带移动的 速 度 不等差速迁移，而被分离。吸附柱色谱法的操作及色谱过程如图 18-l 所示。把含有A、B 两组分的样品加到色谱柱的顶端，A、B 均被吸附到固定相上。然后用适当的流动相冲洗，当流动相流过时，已被吸附在固定相上的两种组分又溶解于流动相中而被解吸，并随着流动相向前移行，已解吸的组分遇到新的吸附剂颗粒，又再次被吸附，如此在色谱柱上不断地发生吸附、解吸、再吸附、再 解吸的过程。若两种组分的理化性质存在着微小的差异，则在吸附剂表面的吸附能力也存在微小的差异，经过反复多次的重复，使微小的差异积累起来就变成了大的差异，其结果就使吸附能力弱的 B 先从色谱柱中流出，吸附能力强的 A 后流出色谱柱，从而使各组分得到分离。二、基本类型色谱法的分离机制 1.分配色谱法 分配色谱法利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离。其固定相为液体，GLC 和 LLC 都属于分配色谱法范围。分配色谱法的示意图如图 18-2。图中 X 代表样品中某组分(溶质)分子，下标 m 与 s 分别为流动相与固定相。溶于流动相与溶于固定相的溶质分子处于动态平衡，平衡时浓度之比(严格应为活度比)为狭义分配系数(partition coefficient):mmssmsVXVXCCK/=(1.1)溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相中溶解度越小，则 K 越大。在 LLC 中 K 主要与流动相的性质(种类与极性)有关，在 GLC 中 K 与固定相极性和柱温有关。2.吸附色谱法 吸附色谱法利用被分离组分对固体表面活性吸附中心吸附能力的差别而实现分离。其固定相为固体吸附剂，大部分 GSC 和 LSC 都属于吸附色谱法。吸附过程是样品中各组分的分子(X)与流动相分子(Y)争夺吸附剂表面活性中心(即为竞争吸附)的过程(图 18-3)。吸附平衡可以表示为:maamnYXnYX+流动相中组分的分子Xm与吸附在吸附剂表面的n个流动相分子Ya相置换，组分的分子被吸附，以Xa表示。流动相分子回至流动相内部，以Ym表示。吸附平衡常数称为吸附系数(Ka)，可近似用浓度商表示：namnmaaYXYXK=因为流动相的量很大，nanmYY/近似于常数，且吸附只发生于吸附剂表面，所以，吸附系数可写成：()()mmaamaaVXSXXXK/=(1.2)式中Sa为吸附剂的表面积，Vm为流动相（展开剂）的体积。吸附系数与吸附剂的活性、组分的性质和流动相的性质有关。3.离子交换色谱法 离子交换色谱法利用被分离组分离子交换能力的差别而实现分离。其固定相为离子交换树脂，按可交换离子的电荷符号又可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。以阳离子交换色谱为例说明分离机制。图 1-4 中R为树脂骨架，树脂表面的负离子(如SO3-)为不可交换离子；其正离子为可交换离子(H+离子)。当流动相中携带有正离子出现时，发生交换反应(见第 2 章)。交换反应达平衡时，以浓度表示的平衡常数称为选择系数(selec-tivity coefficient；Ks)，即 +=XRXKs/(1.3)式中RX+为交换到树脂上的阳离子，X+为在流动相中的游离阳离子。Ks与离子的电荷和水合离子半径、流动相性质和pH、离子交换树脂的性质及温度有关。4.空间排阻色谱法 空间排阻色谱法根据被分离组分分子的线团尺寸而进行分离。其固定相是多孔性填料凝胶，故此法又称为凝胶色谱法(gel chromatography)，也称为分子排阻色谱法。该色谱法按流动相的不同分为两类：以有机溶剂为流动相者称为凝胶渗透色谱法(gel permeation chromatography，GPC)；以水溶液为流动相者为凝胶过滤色谱法(gel filtration chromatography，GFC)。凝胶色谱法的分离机制与前三种色谱法完全不同，它只取决于凝胶的孔径大小与被分离组分线团尺寸之间的关系，与流动相的性质无关。其作用类似于分子筛的作用(反筛子)，示意图如图 1-5。凝胶色谱法的分离机制有多种说法，空间排斥理论是目前被多数人所接受的理论。该理论有两条假设：(l)孔内外同等大小的溶质分子处于扩散平衡状态:XmXs Xm与Xs分别代表在流动相与凝胶孔隙中同等大小的溶质分子。平衡时，两者浓度之比为渗透系数(permeation coefficient；Kp)mspXXK/=(1.4)(2)渗透系数的大小只由溶质分子的线团尺寸及凝胶孔隙的大小所决定。在凝胶孔径一定时：当分子大到不能进入凝胶的所有孔隙时，Xm=0，则Kp=0；当分子小到能进入所有孔隙时，Xs=Xm，Kp=1；分子尺寸在上述两种分子之间时，0KpKB，因此B先于A流出色谱柱。当B随流动相进入检测器(将浓度变化转变为电信号变化的装置)时，流出曲线开始突起，随B在检测器中的浓度变化而形成色谱峰B。当B完全通过检测器后，流出曲线回复平直基线。而后，分配系数大的组分A进入检测器，形成色谱峰A。A通过后，流出曲线又恢复平直。B 第三节第三节 色谱法的发展趋势色谱法的发展趋势 色谱法是分析化学中发展最快、应用最广的方法之一。这是因为现代色谱法是分离分析方法，具有分离与“在线”分析两种功能，能解决组分复杂的样品分析问题，而且还可以制备纯组分。色谱法在药物分析中有着极为重要的地位，各国药典都收载了许多色谱分析方法。中国药典1995 年版二部收载623 个品种的色谱方法，用于纯度检查、定性鉴别和含量测定，一部收载 434 个品种的色谱方法用于中药的鉴定和含量测定。色谱法的发展趋势主要是两个方面，一方面是色谱方法及其硬件的进一步研究；另一方面是联用技术的发展。1.新型固定相和检测器的研究 虽然已有很多种类的色谱固定相，但新型固定相仍然不断出现，从而使色谱分析方法的应用越来越广泛。如各种手性固定相的出现使手性药物的分析变得十分方便，大大促进了手性药物的立体选择性研究。从 1985 年以来发展了内表面反相固定相等几种浸透限制固定相，允许体液如血浆等直接进样。1989 年又出现了灌注色谱固定相，用于各种生物大分子的分离分析。此外，还有各种特殊用途的固定相的研制。新型检测器也在不断研制，如蒸发光散射检测器和半导体激光荧光检测器等。后者对靛菁绿（indocyanine）标记后的白蛋白的最低检测限为 1.3pmol，优于普通光度法达两个数量级。2.色谱新方法的研究 目前色谱方法的研究仍然十分活跃。新近发展起来的电色谱法兼有毛细管电泳和微填充柱色谱法的优点，其应用研究越来越多，它将成为最重要的色谱方法之一。1995 年又出现了以激光的辐射压力为色谱分离驱动力的光色谱，按几何尺寸对组分进行分离，但其应用还在研究之中。3.色谱-光谱(或质谱)联用技术 把色谱作为分离手段，光谱(或质谱)充作鉴定工具，各用其长，互为补充。已有 GC-MS、气相色谱-傅里叶变换红外光谱（GC-FTIR）、SFC-MS、HPLC-UV、HPLC-MS 及TLC-UV 等多种联用仪器的商品。还有毛细管区带电泳(CZE)-MS 和 HPLC-NMR 等联用技术。由于计算机的运用，这些联用仪多数都能绘制光谱-色谱三维谱，即在一张图上可以同时获得定性与定量信息。4.色谱-色谱联用技术 将两种色谱法联用称为二维或多维色谱法。两种色谱法可以互相弥补，分离一些难分离的物质对，常见的有：GLC-GSC、HPLC-GC、LC-SFC 及 HPLC-HPLC(如 LLC-IEC、LLC-SEC)等，还有非手性固定相与手性固定相联用的 HPLC。在色谱-色谱联用中常用到柱切换技术。这种联用技术能够获得更多的定性信息，也提高定量的准确度。5.色谱专家系统 这是一种色谱-计算机联用技术。色谱专家系统是指模拟色谱专家的思维方式，解决色谱专家才能解决的问题的计算机程序。完整的色谱专家系统包括了柱系统推荐和评价、样品预处理方法推荐、分离条件推荐与优化、在线定性、定量及结果的解析等功能。色谱专家系统的应用，将大大提高色谱分析工作的质量和效率。