大鼠P物质SPELISA试剂盒说明书模板.doc

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大鼠P物质(SP)酶联免疫吸附测定试剂盒
使用说明书
产品编号: QS41985
北京奇松生物科技有限公司
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本试剂盒仅供体外研究使用!
预期应用
ELISA法定量测定大鼠血清、 血浆或其它相关生物液体中SP含量。
实验原理
用纯化的抗体包被微孔板, 制成固相载体, 往包被抗SP抗体的微孔中依次加入标本或标准品、 生物素化的抗SP抗体、 HRP标记的亲和素, 经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色, 并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的SP呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度( OD值) , 计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板: 一块( 96孔)
2. 标准品( 冻干品) : 2瓶, 每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml, 盖好后静置10分钟以上, 然后重复颠倒/搓动以助溶解, 其浓度为500pg/ml, 做系列倍比稀释(注: 不要直接在板中进行倍比稀释)后, 分别稀释成500pg/ml, 250pg/ml, 125pg/ml, 62.5pg/ml, 31.2pg/ml, 15.6pg/ml, 7.8pg/ml, 样品稀释液直接作为标准浓度0pg/ml, 临用前15分钟内配制。如配制250pg/ml标准品: 取0.5ml(不要少于0.5ml)500pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中, 混匀即可, 其余浓度以此类推。
3. 样品稀释液: 1×20ml。
4. 检测稀释液A: 1×10ml。
5. 检测稀释液B: 1×10ml。
6. 检测溶液A: 1×120μl( 1:100) 临用前以检测稀释液A1:100稀释, 稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制( 100μl/孔) , 实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制, 轻轻混匀, 在使用前一小时内配制。
7. 检测溶液B: 1×120μl/瓶( 1:100) 临用前以检测稀释液B1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。
8. 底物溶液: 1×10ml/瓶。
9. 浓洗涤液: 1×30ml/瓶, 使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10. 终止液: 1×10ml/瓶( 2NH2SO4) 。
11. 覆膜: 5张
12. 使用说明书: 1份
自备物品
1.酶标仪( 建议参考仪器使用说明提前预热)
2.微量加液器及吸头, EP管
3.蒸馏水或去离子水, 全新滤纸
标本的采集及保存
1. 血清: 全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000xg离心20分钟, 取上清即可检测, 或将标本放于-20℃或-80℃保存, 但应避免重复冻融。
2. 血浆: 可用EDTA或肝素作为抗凝剂, 标本采集后30分钟内于2-8°C1000xg离心15分钟, 或将标本放于-20℃或-80℃保存, 但应避免重复冻融。
3. 其它生物标本: 请1000xg离心20分钟, 取上清即可检测, 或将标本放于-20℃或-80℃保存, 但应避免重复冻融。
注: 以上标本置4℃保存应小于1周, -20℃或-80℃均应密封保存, -20℃不应超过1个月, -80℃不应超过2个月 标本溶血会影响最后检测结果, 因此溶血标本不宜进行此项检测。
操作步骤
实验开始前, 各试剂均应平衡至室温( 试剂不能直接在37℃溶解) ; 试剂或样品稀释时, 均需混匀, 混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量, 如样品浓度过高时, 应对样品进行稀释, 以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围, 计算时再乘以相应的稀释倍数。
1. 加样: 分别设空白孔、 标准孔、 待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl, 余孔分别加标准品或待测样品100μl, 注意不要有气泡, 加样将样品加于酶标板孔底部, 尽量不触及孔壁, 轻轻晃动混匀, 酶标板加上盖或覆膜, 37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性, 每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体, 甩干, 不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl( 在使用前一小时内配制) , 酶标板加上覆膜, 37℃反应60分钟。
3. 温育60分钟后, 弃去孔内液体, 甩干, 洗板3次, 每次浸泡1-2分钟, 大约400μl/每孔, 甩干( 也可轻拍将孔内液体拍干) 。
4. 每孔加检测溶液B工作液( 同检测A工作液) 100μl, 酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。
5. 温育60分钟后, 弃去孔内液体, 甩干, 洗板5次, 每次浸泡1-2分钟, 350μl/每孔, 甩干( 也可轻拍将孔内液体拍干) 。
6. 依序每孔加底物溶液90μl, 酶标板加上覆膜37℃避光显色( 30分钟内, 此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色, 后3-4孔梯度不明显, 即可终止) 。
7. 依序每孔加终止溶液50μl, 终止反应, 此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性, 底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度( OD值) 。在加终止液后立即进行检测。
注:
1.试剂准备: 所有试剂都必须在使用前达到室温, 使用后请立即按照说明书要求保存试剂。实验操作中请使用一次性的吸头, 避免交叉污染。
2.加样: 加样或加试剂时, 请注意在吸取标本/标准品, 酶结合物或底物时, 第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大, 将会导致不同的”预孵育”时间, 从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间( 包括标准品及所有样品) 最好控制在10分钟内, 如标本数量多, 推荐使用多道移液器加样。
3.孵育: 为防止样品蒸发, 试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内, 酶标板加上盖或覆膜, 以避免液体蒸发; 洗板后应尽快进行下步操作, 任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态;同时应严格遵守给定的孵育时间和温度。
4.洗涤: 洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干, 勿将滤纸直接放入反应孔中吸水, 同时要消除板底残留的液体和手指印, 避免影响最后的酶标仪读数。
5.试剂配制: DetectionA及DetectionB在使用前请手甩几下或少时离心处理, 以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、 检测溶液A工作液、 检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用, 并使用相应的稀释液配制, 不能混淆。请精确配置标准品及工作液, 尽量不要微量配置( 如吸取检测溶液A时, 一次不要小于10μl) , 以避免由于不准确稀释而造成的浓度误差; 请勿重复使用已稀释过的标准品、 检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。
6.反应时间的控制: 加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化( 比如, 每隔10分钟) , 如颜色较深 请提前加入终止液终止反应, 避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
7.底物: 底物请避光保存, 在储存和温育时避免强光直接照射。
建议检测样品时均设双孔测定, 以保证检测结果的准确性。
如标本中待测物质含量过高, 请先稀释后再测定, 计算时请最后乘以稀释倍数。
洗板方法
1.手工洗板方法: 吸去( 不可触及板壁) 或甩掉酶标板内的液体; 在实验台上铺垫几层吸水纸, 酶标板朝下用力拍几次; 将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内, 浸泡1-2分钟, 根据需要, 重复此过程数次。
2.自动洗板: 如果有自动洗板机, 应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
特异性
本试剂盒可同时检测重组或天然的大鼠SP, 且与其它相关蛋白无交叉反应。
计算
以标准物的浓度为纵坐标( 对数坐标) , OD值为横坐标( 对数坐标) , 在对数坐标纸上绘出标准曲线。推荐使用专业制作曲线软件进行分析, 如curveexpert1.3, 根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度, 再乘以稀释倍数; 或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式, 将样品的OD值代入方程式, 计算出样品浓度, 再乘以稀释倍数, 即为样品的实际浓度。
检测范围: 7.8pg/ml-500pg/ml
最低检测限: 3.9pg/ml
说明
1. 只有全部使用USCNLIFETM试剂才能保证检测效果, 因为所有试剂都是有关联的, 不能混用其它制造商的产品。只有严格遵守USCNLIFETM试剂的试验说明才会得到最佳的检测结果。
2. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染, 试剂避免受到微生物的污染, 因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。
3. 试剂盒保存: 请收到试剂盒后尽快将标准品、 检测溶液A和检测溶液B保存于-20℃, 其余试剂短期保存请置于4℃, 长期保存则置于-20℃。
4. 浓洗涤液会有盐析出, 稀释时可在水浴中加温助溶。
5. 刚开启的酶联板孔中可能会有少许水样物质, 此为正常现象, 不会对实验结果造成任何影响。
6. 所有的样品都应管理好, 按照规定的程序处理样品和检测装置。
7. 有效期: 6个月。
8. 本操作说明适用于48T试剂盒, 但48T试剂盒所有试剂减半。
英文版
RatSubstanceP,SPELISAKit
CatalogNo:QS41985
96Tests
Operatinginstruction
.com

FORRESEARCHUSEONLY;NOTFORTHERAPEUTICORDIAGNOSTICAPPLICATIONS!
PLEASEREADTHROUGHENTIREPROCEDUREBEFOREBEGINNING!
Intendeduse
ThisimmunoassaykitallowsfortheinvitroquantitativedeterminationofratSPconcentrationsinserum,plasmaandotherbiologicalfluids.
Introduction
SubstancePisabioactive12-aminoacidpeptide(Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-amide)firstisolatedin1931frombrainandintestine.Thepeptideisinvolvedinmanyphysiologicalprocessesincludingpainmodulation,smoothmusclecontraction,bloodpressurecontrol,kidneyfunctionandwaterhomeostasis.SubstancePiswidelydistributedinnumeroustissuesandbodyfluidsincludingthecentralandperipheralnervoussystemgastrointestinaltract,respiratorytract,visualsystemandcirculatorysystem.
Testprinciple
Themicrotiterplateprovidedinthiskithasbeenpre-coatedwithanantibodyspecifictoSP.Standardsorsamplesarethenaddedtotheappropriatemicrotiterplatewellswithabiotin-conjugatedpolyclonalantibodypreparationspecificforSPandAvidinconjugatedtoHorseradishPeroxidase(HRP)isaddedtoeachmicroplatewellandincubated.ThenaTMBsubstratesolutionisaddedtoeachwell.OnlythosewellsthatcontainSP,biotin-conjugatedantibodyandenzyme-conjugatedAvidinwillexhibitachangeincolor.Theenzyme-substratereactionisterminatedbytheadditionofasulphuricacidsolutionandthecolorchangeismeasuredspectrophotometricallyatawavelengthof450nm±2nm.TheconcentrationofSPinthesamplesisthendeterminedbycomparingtheO.D.ofthesamplestothestandardcurve.
Materialsandcomponents
ReagentQuantity
Assayplate 1
Standard2
SampleDiluent 1×20ml
AssayDiluentA 1×10ml
AssayDiluentB 1×10ml
DetectionReagentA 1×120μl
DetectionReagentB 1×120μl
WashBuffer(25xconcentrate)1×30ml
Substrate 1×10ml
StopSolution 1×10ml
Platesealerfor96wells 5
Instruction 1
Othersuppliesrequired
Luminometer.
Pipettesandpipettetips.
EPtube
Deionizedordistilledwater.
Samplecollectionandstorage
Serum-Useaserumseparatortube(SST)andallowsamplestoclotfor30minutesbeforecentrifugationfor15minutesatapproximately1000×g.Removeserumandassayimmediatelyoraliquotandstoresamplesat-20℃or-80℃.
Plasma-CollectplasmausingEDTAorheparinasananticoagulant.Centrifugesamplesfor15minutesat1000×gat2-8℃within30minutesofcollection.Storesamplesat-20℃or-80℃.Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.
Otherbiologicalfluids-Removeparticulatesbycentrifugationandassayimmediatelyoraliquotandstoresamplesat-20℃or-80℃.Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.
Note:Serumandplasmatobeusedwithin7daysmaybestoredat2-8℃,otherwisesamplesmuststoredat-20℃(≤1months)or-80℃(≤2months)toavoidlossofbioactivityandcontamination.Avoidfreeze-thawcycles.Whenperformingtheassayslowlybringsamplestoroomtemperature.
DONOTUSEHEAT-TREATEDSPECIMENS.
Limitationsoftheprocedure
1. Thekitshouldnotbeusedbeyondtheexpirationdateonthekitlabel.
2. Donotmixorsubstitutereagentswiththosefromotherlotsorsources.
3. Ifsamplesgeneratevalueshigherthanthehigheststandard,furtherdilutethesamplesandrepeattheassay.Anyvariationinstandarddiluent,operator,pipettingtechnique,washingtechnique,incubationtimeortemperature,andkitagecancausevariationinbinding.
4. Thisassayisdesignedtoeliminateinterferencebysolublereceptors,ligands,bindingproteins,andotherfactorspresentinbiologicalsamples.UntilallfactorshavebeentestedintheQuantikineImmunoassay,thepossibilityofinterferencecannotbeexcluded.
Reagentpreparation
Bringallreagentstoroomtemperaturebeforeuse.
WashBuffer-Ifcrystalshaveformedintheconcentrate,warmtoroomtemperatureandmixgentlyuntilthecrystalshavecompletelydissolved.Dilute30mLofWashBufferConcentrateintodeionizedordistilledwatertoprepare750mLofWashBuffer.
Standard-ReconstitutetheStandardwith1.0mLofSampleDiluent.Thisreconstitutionproducesastocksolutionof500pg/mL.Allowthestandardtositforaminimumof15minuteswithgentleagitationpriortomakingserialdilutions(Makingserialdilutioninthewellsdirectlyisnotpermitted).Theundilutedstandardservesasthehighstandard(500pg/mL).TheSampleDiluentservesasthezerostandard(0pg/mL).

pg/mL.531.215.67.80
DetectionReagentAandB-DilutetotheworkingconcentrationusingAssayDiluentAandB(1:100),respectively.
Assayprocedure
Allowallreagentstoreachroomtemperature(Pleasedonotdissolvethereagentsat37℃directly.).Allthereagentsshouldbemixedthoroughlybygentlyswirlingbeforepipetting.Avoidfoaming.Keepappropriatenumbersofstripsfor1experimentandremoveextrastripsfrommicrotiterplate.Removedstripsshouldberesealedandstoredat4℃untilthekitsexpirydate.Prepareallreagents,workingstandardsandsamplesasdirectedintheprevioussections.Pleasepredicttheconcentrationbeforeassaying.Ifvaluesforthesearenotwithintherangeofthestandardcurve,usersmustdeterminetheoptimalsampledilutionsfortheirparticularexperiments.
1.Add100μlofStandard,Blank,orSampleperwell.CoverwiththePlatesealer.Incubatefor2hoursat37℃.
2.Removetheliquidofeachwell,don’twash.
3.Add100μlofDetectionReagentAworkingsolutiontoeachwell.CoverwiththePlatesealer.Incubatefor1hourat37℃.DetectionReagentAworkingsolutionmayappearcloudy.Warmtoroomtemperatureandmixgentlyuntilsolutionappearsuniform.
4.Aspirateeachwellandwash,repeatingtheprocessthreetimesforatotalofthreewashes.WashbyfillingeachwellwithWashBuffer(approximately400μl)usingasquirtbottle,multi-channelpipette,manifolddispenserorautowasher.Completeremovalofliquidateachstepisessentialtogoodperformance.Afterthelastwash,removeanyremainingWashBufferbyaspiratingordecanting.Inverttheplateandblotitagainstcleanpapertowels.
5.Add100μlofDetectionReagentBworkingsolutiontoeachwell.CoverwithanewPlatesealer.Incubatefor1hoursat37℃.
6.Repeattheaspiration/washasinstep4.
7.Add90μlofSubstrateSolutiontoeachwell.CoverwithanewPlatesealer.Incubatewithin30minutesat37℃.Protectfromlight.
8.Add50μlofStopSolutiontoeachwell.Ifcolorchangedoesnotappearuniform,gentlytaptheplatetoensurethoroughmixing.
9.Determinetheopticaldensityofeachwellatonce,usingamicroplatereadersetto450nm.
ImportantNote:
1.Absorbanceisafunctionoftheincubationtime.Therefore,priortostartingtheassayitisrecommendedthatallreagentsshouldbefreshlypreparedpriortouseandallrequiredstrip-wellsaresecuredinthemicrotiterframe.Thiswillensureequalelapsedtimeforeachpipettingstep,withoutinterruption.
2.PleasecarefullyreconstituteStandardsorworkingDetectionReagentAandBaccordingtotheinstruction,andavoidfoamingandmixgentlyuntilthecrystalshavecompletelydissolved.ThereconstitutedStandardscanbeusedonlyonce.Thisassayrequirespipettingofsmallvolumes.Tominimizeimprecisioncausedbypipetting,ensurethatpipettorsarecalibrated.Itisrecommendedtosuckmorethan10μlforoncepipetting.
3. Toensureaccurateresults,properadhesionofplatesealersduringincubationstepsisnecessary.Donotallowwellstosituncoveredforextendedperiodsbetweenincubationsteps.Oncereagentshavebeenaddedtothewellstrips,DONOTletthestripsDRYatanytimeduringtheassay.
4. Foreachstepintheprocedure,totaldispensingtimeforadditionofreagentstotheassayplateshouldnotexceed10minutes.
5. Toavoidcross-contamination,changepipettetipsbetweenadditionsofeachstandardlevel,betweensampleadditions,andbetweenreagentadditions.Also,useseparatereservoirsforeachreagent.
6. Thewashprocedureiscritical.Insufficientwashingwillresultinpoorprecisionandfalselyelevatedabsorbancereadings.
7. Duplicationofallstandardsandspecimens,althoughnotrequired,isrecommended.
8. SubstrateSolutioniseasilycontaminated.Pleaseprotectitfromlight.
Specificity
ThisassayrecognizesrecombinantandnaturalratSP.Nosignificantcross-reactivityorinterferencewasobserved.
Sensitivity
TheminimumdetectabledoseofratSPistypicallylessthan3.9pg/mL.
Thesensitivityofthisassay,orLowerLimitofDetection(LLD)wasdefinedasthelowestdetectableconcentrationthatcouldbedifferentiatedfromzero.
DetectionRange
7.8-500pg/mL.ThestandardcurveconcentrationsusedfortheELISA’swere500pg/mL,250pg/mL,125pg/mL,62.5pg/mL,31.2pg/mL,15.6pg/mL,7.8pg/mL.
Calculationofresults
Averagetheduplicatereadingsforeachstandard,control,andsampleandsubtracttheaveragezerostandardopticaldensity.Createastandardcurvebyreducingthedatausingcomputersoftwarecapableofgeneratingafourparameterlogistic(4-PL)curve-fit.Asanalternative,constructastandardcurvebyplottingthemeanabsorbanceforeachstandardonthex-axisagainsttheconcentrationonthey-axisanddrawabestfitcurvethroughthepointsonthegraph.ThedatamaybelinearizedbyplottingthelogoftheSPconcentrationsversusthelogoftheO.D.andthebestfitlinecanbedeterminedbyregressionanalysis.Itisrecommendedtousesomerelatedsoftwaretodothiscalculation,suchascurveexpert13.0.Thisprocedurewillproduceanadequatebutlessprecisefitofthedata.Ifsampleshavebeendiluted,theconcentrationreadfromthestandardcurvemustbemultipliedbythedilutionfactor.
Storageoftestkitsandinstrumentation
1. TheStandard,DetectionReagentAandDetectionReagentBshouldbestoredat-20℃uponbeingreceived.Otherreagentsarekeptaccordingtothelabelsonvials.Butforlongtermstorage,pleasekeepthewholekitat-20℃.Theunusedstripsshouldbekeptinasealedbagandstoredat2-8℃intheirpouchwiththedesiccantprovidedtominimizeexposuretodampair.Thetestkitmaybeusedthroughouttheexpirationdateofthekit(sixmonthsfromthedateofmanufacture).Openedtestkitswillremainstableuntiltheexpiringdateshown,provideditisstoredasprescribedabove.
2. Theremaybesomefoggysubstanceinthewellswhentheplateisopenedatthefirsttime.Itwillnothaveanyeffectonthefinalassayresults.
3. Donotremovemicrotiterplatefromthestoragebaguntilneeded.
4. Amicrotiterplatereaderwithabandwidthof10nmorlessandanopticaldensityrangeof0-3ODorgreaterat450nmwavelengthisacceptableforuseinabsorbancemeasurement.
5. Usefreshdisposablepipettetipsforeachtransfertoavoidcontamination.
6. Donotsubstitutereagentsfromonekitlottoanother.Useonlythereagentssuppliedbymanufacturer.
7. Validperiod:sixmonths.
Precaution
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