转录组+代谢组联合分析方案模板-20181123.docx

XX抗旱转录组研究方案
XX抗旱转录组和代谢组联合分析方案
研究背景及目的：
非生物应激反应对动植物适应环境有重要作用，生物只有通过自身应激反应适应环境才能存活。通常情况下，非生物逆境包括如强光、紫外线、高温或低温、冷冻、干旱、盐度、重金属和缺氧等多种复杂的环境条件引起的胁迫。对于植物而言，非生物逆境会引起很多细胞内物质包括核酸、蛋白质、碳水化合物和氨基酸等的积累，表明植物对非生物胁迫的应答机制不是一个线性机制，而是一个涉及多基因、多信号途径、多基因产物和生物化学分子的的复杂的反应机制。
在系统生物学和功能基因组时代，将多个组学联合运用、从整体上解释生物学问题才是大势所趋。因此，转录组和代谢组联合分析，可以从大量转录组信息中发掘差异基因，快速判断核心调控网络和关键候选基因，明确转录因子功能，阐述生物体响应非生物胁迫应答机制。
转录组（transcriptome）广义上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有mRNA的集合。蛋白质是行使细胞功能的主要承担者，蛋白质组是细胞功能和状态的最直接描述，转录组成为研究基因表达的主要手段，转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然纽带，转录水平的调控是目前研究最多的，也是生物体最重要的调控方式。
代谢物是生物体表型的基础，能帮助更直观有效地了解生物学过程以及其机理。基于对代谢物的定性定量分析，代谢组学可以用于研究代谢途径或代谢网络的解析，不同生物个体的代谢组学表型现象，不同疾病、药物等物理、化学或病原生物刺激后代谢产物的应答机制，以及食品、药物等安全评价。
XX属茄科一年生或有限多年生草本植物，是一种重要的经济作物，在我国南北方均有广泛种植。经过长期田间栽培观察发现，生长在北方的XX由于生长环境缺水，株形相对矮小，但是如降水量增加后其能生长较高大；南方的XX则由于生长环境雨水较多，株形较高大，但是如发生缺水胁迫石容易旱死。由此可见，干旱是影响XX生长的一种重要非生物胁迫。
随着二代高通量测序技术（NGS）的发展和推广，目前NGS广泛应用于各种生长发育、环境适应、免疫互作等研究。通过文献调研发现，在水稻、玉米、棉花、小麦等作物中，有大量文献报道显示应用转录组、miRNA、lncRNA测序技术从转录调控水平研究其响应干旱胁迫的分子机理，包括相关信号转导途径、代谢途径等。
本研究主要目的为解析XX在较长时间干旱条件下的调控机制，以及在复水后植物的调节机理，从转录组和代谢组水平比较抗旱和不抗旱XX材料在不同程度干旱处理过程中的转录组变化，从而挖掘相关关键基因以及调控机制。
实验设计：
选取抗旱和不抗旱的XX品种，根据抗旱表型最明显的时期选取合适生长期的XX进行处理实验。将种子播种2周后开始进行干旱处理，分两组进行：
（1） 轻度干旱处理；
（2） 重度干旱处理。
样品选择时，生物学重复是非常必要的，SCI没有生物学重复而拒稿的文章比例越来越高。生物学重复的相关性可以检验生物学实验操作的可重复性；生物学重复的相关性可以评估差异表达基因的可靠性；生物学重复的相关性可以辅助异常样品的筛查。推荐转录组样本设置3次生物学重复（设置2次生物学重复具有统计学意义，但如果存在异常样品，无法完成后续分析），代谢物对环境变化的感应很强，不同样品的重复差异是比较大，对于植物，代谢组建议6次生物学重复。
技术平台：采用Illumina Hiseq X ten高通量测序平台，双端150bp测序； LC-MS；
技术路线：

分析要点（文章思路）
本研究的亮点主要在三个方面：转录组与代谢组联合分析和四个维度（不同材料、不同干旱处理（轻度和重度）、不同处理时间点、不同组织）。所以文章思路主要也围绕这三个亮点展开。转录组和代谢组先从四个维度进行比较和分析(不同材料、不同干旱处理（轻度和重度）、不同处理时间点、不同组织），再进行转录组和代谢组联合分析，构建转录调控网络分析。
方案分析思路：
一、 转录组测序数据分析
1. 通过对下机后得到原始数据进行过滤（过滤接头序列或低质量序列），得到高质量数据，后续的分析均利用高质量数据分析；
2 组装Unigene库，并将以上过滤后获得的高质量数据与Unigene库进行比对分析，计算每个样品中基因的表达量；
3. 样品间差异基因比较分析：
3.1干旱处理过程中的差异基因筛选及注释：以抗旱XX在重度干旱的样品为例，通过对处理过程中4个时期样品进行两两比较，可以筛选出上调或下调表达的基因，对筛选到的这些差异基因进行功能注释、GO分类和富集、KEGG通路分类和富集分析，即可了解其参与的功能，进而筛选干旱处理过程中的关键基因；

差异基因火山图 差异基因KEGG代谢通路注释 差异基因维恩图
3.2基因时间序列表达模式分析，筛选跟表型变化较一致模式的基因集：根据干旱处理中差异基因表达模式分析，如可观测与蒸腾作用相关关键基因在叶片中的表达模式（如下图）。可根据这些基因随着处理时间延长表现出的表达模式，结合表型数据进行分析，筛选感兴趣的关键基因作为候选研究的关键基因。

差异表达基因模式折线图
3.3不同组样品的差异表达基因层次聚类分析：
对抗旱和不抗旱的不同处理时间的样品进行差异表达聚类分析，经过聚类可以对差异基因表达趋势分类，针对每一个亚簇可进一步提取数据作图并提供功能注释分析，可直观看到与抗旱相关基因的表达情况及功能。

差异基因聚类及注释图
3.4 按组来进行差异基因比较分析，从而便于整体上来比较不同材料、不同处理组、不同组织不同之间的差异。如按照时间序列筛选一个差异基因集合，按照不同组织（空间）筛选一个差异基因集合，比较两个集合共同和特异的差异基因，并进行相关功能注释和富集分析，从而解析与干旱处理时间相关、叶片和根部响应干旱特异的基因和信号途径。

时间和空间差异基因韦恩图
4、 根据样品所有基因表达量信息进行PCA分析，从而观察样品之间的分群，解析样品之间的关联。
样品PCA分析
5、通过加权共表达网络分析（WGCNA），基于所有基因或者差异表达基因的表达量信息，计算基因间的相关系数，构建基因共表达网络，鉴定网络中不同功能的基因模块。
WGCNA分析鉴定的基因模块
6、 计算各基因模块与关注表型之间的联系，鉴定关键基因模块并进行功能注释分析。比如，计算各基因模块与记录的抗旱处理过程中的表型数据（比如叶片含水量、光合作用速率、蒸腾作用速率等）之间的相关系数和显著性值，鉴定与各表型数据高度相关的基因模块。通过对关键基因模块进行GO富集等功能注释分析，从而来解析该模块调控相关性状的可能机制。
基因模块与性状关联性分析 基因模块功能富集分析
7、 计算各基因模块与样本之间的联系，根据基因模块的功能解释相关样本的表型。因为本研究的实验设计涉及不同材料、不同处理组、不同组织，性状较多，比如，两种材料的两种干旱处理的各4个时期，2个不同的组织。想知道在每个材料每个时期每个组织中发挥作用的基因模块，可通过计算每个模块的特征值与样本间的相关性来判断，来研究每个模块最喜欢哪个样本中表达。
基因模块与样品的关联系分析
8、 关键模块绘制基因调控网络，筛选其中关键调控因子和功能蛋白。模块中的各基因成员在关系上并非是平等的。把处于调控网络中心的基因称为核心基因（hub gene），这类基因通常是转录因子等关键的调控因子，是值得优先深入分析和挖掘的对象。在网络中，被调控线连接的基因，其表达模式是相似的，通常认为它们有相似的功能。所以，在这个网络中，如果线条一端的基因功能是已知的，那么就可以预测线条另一端的功能未知的基因也有相似的功能，这就方便下一步验证功能未知基因。
某基因模块调控网络图
二、 代谢组数据分析
2.1 代谢物定性定量分析
质谱分析后的下机 wiff 格式原始数据，可通过软件 Analyst 1.6.2 打开浏览，并用于定性定量分析。图 1 所示为混样 QC 样本的总离子流图（Total ions current，TIC，即每个时间点质谱图中所有离子的强度加和后连续描绘得到的图谱）及MRM代谢物检测多峰图（多物质的提取的离子流谱图， XIC），横坐标
为代谢物检测的保留时间（Retention time， Rt），纵坐标为离子检测的离子流
强度（强度，cps）。
图 1. 混样样品质谱分析总离子流图（上） 及 MRM 代谢物检测多峰图（下）
基于本地代谢数据库，对样本的代谢物进行了质谱定性定量分析。图1中MRM 代谢物检测多峰图展示了样本中能够检测到的物质，每个不同颜色的质谱
峰代表检测到的一个代谢物。
为了比较每个代谢物在不同样本中的物质含量差异，根据代谢物保留时间与峰型的信息，我们对每个代谢物在不同样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确。图 2展示了代谢物mr1267在不同样本中的定量分析积分校正结果，横坐标为代谢物检测的保留时间，纵坐标为某代谢物离子检测的离子流强度（cps）。

图 2. **样品代谢物定量分析积分校正
2.2 样本质控分析
通过对不同 QC 样本质谱检测分析的 TIC 图进行重叠展示分析，可以判断代谢物提取检测的重复性。如图 3 显示了第一与最后一个 QC 样本质谱检测 TIC图重叠结果，可以发现质谱检测较为稳定，重复性较好。

图 3. QC 样本质谱检测 TIC 重叠图

图 4. **样本及 QC 样本 PCA 得分图。三角形、方框分别表示品种 1（P1）与品种 2（P2）；黑色圆点表示质控样本（QC）； 不同颜色分别表示**七个时期组织样本； X 轴表示 PC1，Y 轴表示 PC2。
对 QC 样本及**组织样本进行代谢主成分分析， PCA 得分图（Score plot）
如图 4 所示，X 轴表示第一个主成分，Y 轴表示第二个主成分，QC 样本（黑色圆点）聚集在一起，其它样本且能够显著区别，结果表明**样品质谱检测分析较为稳定，采集的数据质量较好。
2.3 差异代谢物的比较
2.3.1 差异代谢物的筛选
为了得到两个品种之间差异的代谢物，我们分别使用 OPLS-DA 和双因素方差分析两种方法来进行筛选。在使用 SIMCA 14 的 OPLS-DA 时，我们分析同一个处理中两品种间差异代谢物。 图5A为两种方法得到的差异代谢物的韦恩图 。图5B 为已知的差异代谢物的分类扇形图。

A .OPLS-DA 和双因素方差分析筛选的差异代谢物的韦恩图

B.不同**品种之间差异代谢物的分类情况
图 5.两品种间差异代谢物的筛选及其分类情况

图 6. 不同**品种之间差异代谢物的分类情况
部分品种间差异的代谢物在各个样品中的积累量如图 6 所示，该热图横轴为样品的编号， 并且在横轴的上方分别用颜色条标出该样品所属品种以及时期： 左边的浅红色表示品种 I，右边深红色表示品种 II， 各个品种内各个时期用黄棕色由浅到深依次表示； 纵轴为每个代谢物，蓝色到红色依次表示代谢物含量从低到高。
3.3.2 差异代谢物的通路分析
对两品种或不同处理之间差异代谢物进行 KEGG 通路富集分析，结果如图7 所示。

图 7. 差异代谢物 KEGG pathway 富集分析

图 8. KEGG 富集到各通路的各代谢物在各时期各样本中的积累量热图
在各品种中各时期的代谢物积累量如图 8热图所示。
三、 转录组和代谢组联合分析
3.1 mRNA与代谢物表达相关性分析
我们将所有的差异表达代谢物的酶基因对应mRNA表达量被计算出来，比较两者之间的相关性。我们将基因和代谢物能够完全对应，表达趋势完全一致的列出：

图1.差异代谢物与差异基因表达相关性分析
3.2 差异基因与差异代谢物pathway分析
我们将差异基因与差异代谢物同时使用GenMAPP v2.1向KEGG pathway数据库映射，获得他们的共同的pathway信息。

图2.差异基因与差异代谢物pathway图，圆点是代谢物，长方形是酶基因
3.3 差异基因与差异代谢物互作网络构建
我们整合构建mRNA与代谢物互作网络如下：

图3.差异基因与差异代谢物整合调控网络构建，长方形是基因，椭圆是代谢物