紫外分光光度计测蛋白质含量.doc

紫外分光光度法测定蛋白质含量
1 仪器与试剂
TU-1901紫外-可见分光光度计，比色管，吸量管
标准蛋白质溶液：5.00 mg.mL-1溶液
0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液

2 实验方法与原理
本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法,它是研究分子吸收190nm～750nm波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。紫外-可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。
蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。该测定法具有简单灵敏快速高选择性，且稳定性好，干扰易消除不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定等优点。

3 实验步骤
3.1 准备工作
3.3.1启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。
3.3.2 在工作界面上选择测量项目（光谱扫描，光度测量），本实验选择光度测量，设置测量条件（测量波长等）。
3.3.3 将空白放入测量池中，点击START扫描空白，点击ZERO校零。
3.3.4 标准曲线的制作。
3.2 测量工作
3.2.1吸收曲线的绘制
用吸量管吸取2mL5.00mg/mL标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1cm石英比色皿，以0.9% NaCl溶液为参比，在190 nm～400nm区间，q全波段扫描。
3.2.2标准曲线的制作
用吸量管分别吸取0.5、1.0 、1.5、 2.0 、2.5mL 5.00 mg.mL-1标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在280 nm处分别测定各标准溶液的吸光度A278记录所得读数。
3.2.3样品测定
取适量浓度的待测蛋白质溶液3mL，按上述方法测定278 nm处的吸光度。平行测定三份。

4 实验结果记录
4.1 吸收曲线
根据全波段扫描结果，已知蛋白质的最大吸收峰位于280nm左右。
（λmax=278nm）
4.2 标准曲线的制作
以蛋白质标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
标准溶液浓度C(mg/mL)
吸光度A
0.25
0.175
0.50
0.338
0.75
0.538
1.00
0.698
1.25
0.892
绘制的蛋白质标准曲线如下图所示。

4.3 测定结果
根据两次平行测定的结果，得出未知蛋白溶液吸光度、根据标准曲线算出的蛋白溶液含量如下表所示。
平行测定次数
样品液吸光度A
样品溶液浓度C(mg/mL)
1
0.3644
0.518
2
0.3660
0.520
所测溶液平均浓度: C=0.519(mg/mL)

5 实验讨论
本次实验采用的蛋白溶液为牛血清蛋白。
蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在 275～280 nm 处具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，符合朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所处的微环境也不同，所以不同蛋白质溶液在 280 nm 的光吸收值不同。据初步统计，浓度为 1.0 mg/mL 的 1800 种蛋白质及蛋白质亚基在280 nm的吸光度在 0.3～3.0 之间，平均值为1.25±0.51。[1]

上图为文献[1]中以0.9%NaCl溶液为参比液，将浓度为0.3mg/mL的蛋白质溶液，进行波长扫描测量，得到吸收曲线。从吸收曲线可得 0.3 mg/mL 标准蛋白质溶液的最大吸收波长为279 nm，此波长下的吸光度为 0.167。
根据文献显示，仪器误差、不适当的校准曲线、测量中不符合朗伯—比尔定律的光学、化学因素、显色反应条件、共存离子干扰以及仪器测试条件等都是影响分光光度计准确性的因素。[2]
最让我印象深的便是仪器误差，主要体现在样品池的使用上。一般来说，为得到最准确的定量结果,应使用同一样品池测量标准样品和待测样品，虽然这样比较麻烦，根据文献[2]我们知道，最好的样口池应有平整、严格平行的光学表面,否则会使光束偏离,引起表观吸光度误差;另外，样品池在样品架上的方位应始终不变,这样不致于使测量空白和样品时的光学效应不一致而产生误差。
因此我认为，今后在使用分光光度计的时候，若要平行测定样品，应该使用同一样品池来装样品，不要像以往一样，因为麻烦、图快，就使用几个不同的样品池来测定，另外，师姐一再强调样品池在装不同样品之前一定要用去离子水、样液润洗几遍，保证不会有上一样品的残留，并且将光面上的残留物擦干，不能留有指纹，否则都会影响测定的准确性。
另外，在绘制标准曲线的时候也有一定的讲究，根据文献我们知道[3]，理论上仅用一个已知浓度的标准物质测量其吸光度便可进行定量分析校正,测得的吸光度值除以浓度便得斜率。但是有很多仪器和样品因素会偏离朗伯-比耳定律。若校准工作曲线不准确,会造成定量分析结果较大的误差。因此要得到一条标准工作曲线,应测量至少三个已知浓度标准样品溶液的吸光度,标准样品的浓度范围应包括待测样浓度。然后用线性回归方法找到所测数据和校正曲线的最佳拟合,以决定哪种类型的工作曲线可给出最佳的拟合。我认为在平时的实验当中，我们的待测样浓度经常没有在标准样品的浓度范围内，若样品浓度不在此范围内，可能会导致线性关系不佳，造成实验误差，而本次实验的标准曲线很好，待测样品浓度落在标准样品范围内。

参 考 文 献
[1] 曹红翠.紫外分光光度法测定蛋白质的含量.广东化工[J]2007(08)
[2] 申燕玲.分光光度计误差来源分析.计量与测试技术[J].1999（03）
[3] 薛芳,孙玉岭,卫锋. 用紫外可见分光光度计检测样品中误差问题探讨.现代仪器[J].1999（03）